Breanne Cuddington holds a fellowship from the Canadian Breast Cancer Foundation. This work was sponsored by operating grants from the Cancer Research Society and the Canadian Cancer Society Research Institute (formerly the Canadian Breast Cancer Research Alliance). We thank Ann Tollefson (Saint Louis University School of Medicine) for LCRT cells and Dr. Kathleen Delaney and Marion Corrick for technical assistance with cotton rat housing and sedation.

NOTA: Los protocolos utilizados han sido aprobados por nuestro Consejo de Ética de Investigación de Animales institucional de la Universidad McMaster de acuerdo con Consejo Canadiense de Cuidado de Animales Directrices. Los experimentos se realizaron en las instalaciones de la Universidad de McMaster Animal Central. 1. cultivar células LCRT <ol><li> Células LCRT cultivo en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina. Mantener las células en frascos de cultivo de tejido T-150 a 37 ° C y 5% de CO 2. Células Passage cuando forman una monocapa 90% de confluencia (cada 2-3 días, Figura 1). </li><li> Pre-caliente 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), 1x tripsina y medio en un 37 ° C baño de agua durante 10 min antes de la división de las células. </li><li> Aspirar medio del matraz y enjuagar las células con 5 ml de PBS 1x. </li><li> Después de enjuagar, aspirar PBS e incubarcélulas con 2 ml de 1x tripsina hasta que las células se disocian del matraz (~ 2 min). </li><li> Resuspender las células en 8 ml de medio (para un total de 10 ml de suspensión celular) y suavemente pipeta arriba y abajo para romper los grumos de células. </li><li> Mantener células en un matraz T-150 mediante la siembra de 1 ml de suspensión de células en un medio de 24 ml (para un total de 25 ml por T-150) y el frasco de roca suavemente de un lado a otro. Mantener las células a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta el próximo partido. </li></ol> 2. La evaluación de la replicación del virus y la citotoxicidad en células LCRT <ol><li> La replicación del virus NOTA: virus de constructos que expresan un marcador fluorescente, como la proteína verde fluorescente (GFP), bajo el control de promotores virales endógenos facilitar la visualización de la infección y propagación del virus usando lectores de placas de fluorescencia. <ol><li> Semilla células LCRT en placas de cultivo, dejando un pozo para el conteo. Células de semillas tales que serán 80-90% confluentes un día después. Utilice una concentración de 10 5 cells / ml (100 l por pocillo) para producir la confluencia deseada un día después en placas de 96 pocillos de fondo plano. </li><li> El día siguiente, pre-caliente PBS 1x, 1x tripsina, medio completo y libre de suero en un baño de agua C 37 ° durante 10 min antes de iniciar el experimento. </li><li> Aspirar medio de las contando bien y enjuague células con 5 ml de PBS 1x oscilando por encima de la superficie del pozo. </li><li> Después de enjuagar, las células aspirado de PBS y se incuban con 2 ml de tripsina hasta que las células se disocian 1x del matraz (~ 2 min). </li><li> Resuspender las células en el volumen apropiado de medio completo para dar una densidad celular dentro de la gama contable utilizando un hemocitómetro. Para asegurar un recuento celular exacto, mezclar bien la suspensión celular antes de la inoculación del hemocitómetro pipeteando arriba y abajo. </li><li> Determinar el volumen del stock de virus necesaria para la infección en la multiplicidad deseada de infección (MOI). Requerido Paque Unidades Formadoras (pfu) = número de células sembradas * MOI(Pfu / célula) Volumen de reserva de virus requerido = pfu / virus requerida stock título (pfu / ml) </li><li> Preparar inóculo de virus en medio libre de suero en tubos. Mezclar bien con un vórtex o pipetear antes de añadir el inóculo a las células. </li><li> Infectar las células durante 1 hora a 37 ° C, después de lo cual se aplica un recubrimiento de mantenimiento de DMEM + 1% FBS. </li><li> Placas de escaneo uno y después de la infección de dos días (pi) para visualizar la fluorescencia de GFP. </li></ol></li><li> La citotoxicidad Virus NOTA: Realizar el ensayo de citotoxicidad resazurina en condiciones de poca luz como el compuesto es fotosensible. Un medio que contenía solamente debe ser incluido para corregir la fluorescencia de fondo. <ol><li> Preparar una solución de resazurina 5% (v / v) en PBS 1x. Mezclar la solución con la pipeta. </li><li> Aspirar medio de las células y se aplica la solución de resazurina 5%. Incluir un medio que contenía solamente para corregir la fluorescencia de fondo. </li><li> Se incuban las células durante 30 min a 37 ° C, después deque lee la fluorescencia usando un lector de placas de fluorescencia (excitación 530 nm, emisión 595 nm). </li><li> Analizar la información relativa a los controles no infectados corrección para el fondo de fluorescencia. </li></ol></li></ol> 3. Vivienda y Manejo <ol><li> Vivienda y Dieta <ol><li> Las ratas del algodón Casa individual para disminuir las luchas internas en jaulas de ratas de policarbonato que contienen ropa de cama de roedores (1/8 &quot;ropa de cama de mazorca de maíz), una sección de tubo de PVC no más de 8 pulgadas y nestlets como el enriquecimiento (Figura 2). </li><li> Use una canasta de acero asegurable para sentarse overtop de la jaula y contener alimentos de roedores y una botella de agua. Nota: esta configuración permitirá jaula para la captura segura y fácil de los animales, con la colocación del tubo de enriquecimiento contra el extremo de la jaula de ser de la mayor importancia. </li></ol></li><li> Manejo <ol><li> Manejar las ratas del algodón de la mañana, antes de las rondas de los técnicos de las instalaciones de los animales para evitar emocionante antesun procedimiento. </li><li> Durante todos los procedimientos, use guantes de cuero gruesos de protección. </li><li> A medida que los animales permanecen principalmente en los tubos de enriquecimiento, los utilizan para transferir las ratas en una nueva jaula durante la limpieza de rutina. Alternativamente, abra la jaula ligeramente para permitir que el manejador de llegar en su mano, el animal puede entonces ser restringido por scruffing la piel justo por encima de los hombros y empujando hacia abajo. Cuidado de Práctica no utilizar fuerza excesiva ya que el animal puede morder la lengua. </li><li> Sea paciente y utilizar una mano firme ya que los animales tienen una fuerte respuesta de huida o lucha y tratarán de evitar ser capturado por correr y saltar fuera de la jaula. Es importante destacar que no se ocupan de los animales por la cola como ocurrirá degloving. </li><li> Trampa los animales en sus tubos enriquecimientos más de manipulación directa. Esto disminuye drásticamente las lesiones y escapar. </li></ol></li></ol> 4. Captura y Anestesia <ol><li> Captura <ol><li> Use guantes de cuero gruesos para protegerion durante todos los procedimientos. </li><li> Utilice un recipiente grande de plástico transparente con agujeros para el aire y una tapa, una cámara de inducción de anestesia lo suficientemente grande para encajar el recipiente y un cono de nariz montado en el tubo de salida de gas (Figura 3). </li><li> Trabajar en parejas para hacer el procedimiento más eficiente y disminuir el tiempo de exposición de los animales al isoflurano, un anestésico de inhalación. Asegúrese de que un investigador es responsable de la apertura y la sustitución de la cubierta de acero de la jaula y la tapa de la cámara de inducción (controlador # 1) y su asociado es responsable de la captura del animal en el tubo y el transporte a la cámara de inducción (controlador # 2). </li><li> Colocar la jaula en una superficie plana y quitar la tapa exterior. Levante la bandeja de alimentación de acero ligeramente y lentamente maniobrar el tubo de enriquecimiento de manera que quede paralelo con los lados de la jaula y contra la parte posterior. Si es necesario, utilizar un objeto para maniobrar el tubo de enriquecimiento sin necesidad de abrir la jaula para evitar agitar el animal (manejarr # 1). </li><li> Si el animal se vuelve agitado y sale del tubo, dar tiempo suficiente para que el animal se relaje y una vez más se instalan en el tubo (manejador # 1). </li><li> Lentamente y deliberadamente levantar el borde más alejado de la cubierta de acero del tubo de enriquecimiento, manteniendo el otro extremo en contacto con la jaula. Hacer un espacio lo suficientemente grande para que el recipiente de plástico (controlador # 2). </li><li> En un movimiento suave y rápido, empuje el recipiente de plástico overtop del tubo de enriquecimiento. Mantener el contacto del recipiente con el lado de la jaula, atrapando el animal en el tubo. Realice los pasos 4.1.6 y 4.1.7 lo antes posible (manejador # 2). </li><li> Retire la bandeja de alimentación de acero y dar la tapa de plástico contenedor al controlador # 2 (controlador # 1). Deslice la tapa de plástico entre el lado de la jaula y el contenedor, siendo consciente de apéndices del animal atrapado en el proceso. No selle el envase, ya que esto hará que el siguiente paso más difícil (manejador # 2). </li></ol></li><li> AnesthesIowa <ol><li> Asegúrese de que el contenedor permanece cerrado y el transporte de los animales a la cámara de inducción. Colocar rápidamente el animal en la cámara y retirar la tapa del recipiente en un movimiento fluido (controlador # 2). Abra y vuelva a colocar inmediatamente la tapa de la cámara de inducción (manejador # 1). </li><li> Encienda el flujo de isoflurano a la cámara de inducción (5 L / min) y monitorear el animal para detectar signos de letargo, en cuyo punto se deslizan rápidamente el animal desde el tubo y el recipiente, la eliminación tanto de la cámara de inducción para facilitar la circulación de gas. </li><li> Cuando la rata está totalmente anestesiado, moverlo a la superficie de trabajo y colocar la nariz y la boca en el cono de la nariz (Figura 3). La rata está totalmente anestesiado cuando no responde a una pizca dedo contundente. </li><li> Coloque vaselina veterinario pomada oftálmica en los ojos del animal para evitar la sequedad y abrasiones. Este es un paso esencial como las ratas del algodón cuentan con grandes ojos que pueden ser propensos a la infección si se produce una lesión. </li> &lt;li&gt; monitorear cuidadosamente y mantener una tasa de respiración constante y asegúrese de que la nariz del animal permanece en la instalación durante todo el procedimiento cono de la nariz. Ajustar la velocidad de flujo de isoflurano adecuadamente. La cantidad de isoflurano requiere para anestesiar a cada animal variará. </li><li> Después del procedimiento, devolver el animal a su jaula y asegúrese de que recupere la movilidad completa y decúbito esternal. </li></ol></li></ol> 5. Preparación de las células LCRT para la formación de tumores subcutáneos NOTA: Una T-150 frasco de LCRT (90% de confluencia) produce aproximadamente 2 x 10 7 células. Basar el número de T-150 frascos requeridos sobre el número total de células necesarias. Semillas frascos adicionales para asegurar el número total de células requerida se obtiene y para acomodar las células perdidas durante la preparación y los necesarios para inyecciones adicionales. Mantener las células en hielo siempre que sea posible para prolongar la viabilidad celular. <ol><li> Para cosechar las células, medio aspirado desde el un matrazd células enjuague con 5 ml de PBS 1x. </li><li> Aspirar PBS e incubar las células con 2 ml de 1x tripsina hasta que las células se disocian del matraz (~ 2 min). </li><li> Resuspender las células en 8 ml de medio (para un total de 10 ml de suspensión celular) y suavemente pipeta arriba y abajo para romper los grumos de células. Continuar para cosechar las células de los matraces adicionales. </li><li> Piscina todo suspensiones de células en un tubo cónico, aproximadamente 4 T-150 por cada 50 ml tubo cónico. </li><li> Centrifugar el tubo a 160 x g durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar medio y volver a suspender el sedimento celular en el volumen apropiado de PBS (10 ml de PBS por T-150) para producir una densidad celular dentro de la gama contable utilizando un hemocitómetro. Para asegurar un recuento celular exacto, mezclar bien la suspensión celular antes de cargar el hemocitómetro pipeteando arriba y abajo. </li><li> Calcular el número total de células: Número total de células recogidas = recuento de células (células / ml) x resuspensión volumen (ml) </li><li> Determinarel volumen de suspensión de células requerido para todas las inyecciones. Hacer 2-3 dosis adicionales por experimento. Un total de 5 x 10 5 células inyectadas subcutáneamente LCRT formará tumores palpables dentro de 3-4 días. Número total de células requeridas = 5 x 10 5 células x número total de dosis Suspensión de células volumen requerido (ml) = (células totales requeridos * suma de los volúmenes de inyección) / (número total de células recogidas) </li><li> Pipetear el volumen requerido de la suspensión celular en un tubo cónico que contenía PBS y mezclar bien. Alícuotas inyecciones individuales (100 l) en tubos Eppendorf. Mantener los tubos en hielo durante el procedimiento de inyección. </li></ol> 6. Inyecciones NOTA: Realizar procedimientos con dos investigadores, uno para realizar las inyecciones, mientras que los otros monitores de la tasa de respiración del animal y el estado general, mientras que bajo anestesia. Utilice jeringas de insulina (29 G x 2.1 &quot;, 0.3 ml) para todas las inyecciones y una aguja nueva paracada animal. <ol><li> Las inyecciones subcutáneas <ol><li> Captura y anestesiar al animal (sección 4). </li><li> Afeitar el sitio de la inyección usando las podadoras. Piel de rata algodón es gruesa y requiere un condensador de ajuste afilado para obtener una superficie lisa para inyecciones. Limpie el sitio de la inyección con etanol al 70%, utilizando un hisopo de algodón y deje que se evapore antes de proceder. </li><li> Jeringas de carga (29 G x 1/2 &quot;, 0,3 ml) con las células mediante la elaboración lenta y constantemente. Si las burbujas son evidentes película de la jeringa con un poco de fuerza. Una vez que las burbujas se encuentran en la parte superior de empuje el émbolo hasta que el líquido está en la parte superior de la aguja. </li><li> Levante la piel en el lugar de la inyección (denominado persistencia del pliegue cutáneo) e inserte el bisel de la aguja hacia arriba. Asegúrese de que la aguja se mueve libremente debajo de la piel para evitar la inyección intramuscular. </li><li> Expulsar el contenido de la jeringa de manera uniforme y lentamente. Retirar el lado bisel de la aguja hacia abajo. </li></ol></li><li> Inyecciones intratumorales <ol><li> Captura de unad anestesiar al animal (sección 4). </li><li> Limpie el sitio de la inyección con etanol al 70%, utilizando un hisopo de algodón y deje que se evapore antes de proceder. </li><li> Jeringas de carga (29 G x 1/2 &quot;, 0,3 ml) con el inóculo de virus mediante la elaboración lenta y constantemente mientras se mantiene la aguja en posición vertical. Si las burbujas son evidentes película de la jeringa con un poco de fuerza. Una vez que las burbujas se encuentran en la parte superior de empuje entonces émbolo hasta que el líquido está en la parte superior de la aguja. </li><li> Insertar el lado bisel de la aguja hacia el tumor y expulsar el contenido de la jeringa de manera uniforme y lentamente mientras se mueve la aguja en un patrón en forma de abanico, retirando parcialmente la aguja antes de cada movimiento para evitar laceración del tumor. Retirar el lado bisel de la aguja hacia abajo. NOTA: Los tumores subcutáneos son LCRT, alcanzando aproximadamente 100 mm 3 en 5-7 días de rápido crecimiento. Además, los centros necróticos y hemorrágicos a menudo se forman en la superficie del tumor dentro de varios días y requieren camonitoreo REFUL (Figura 4). </li></ol></li><li> Las inyecciones intraperitoneales <ol><li> Captura y anestesiar al animal (sección 4). </li><li> Limpie el sitio de la inyección con etanol al 70% utilizando hisopos de algodón y deje que se evapore antes de proceder. </li><li> Jeringas de carga (29 G x 1/2 &quot;, 0,3 ml) con la droga mediante la elaboración lenta y constantemente. Si las burbujas son evidentes película de la jeringa con un poco de fuerza. Una vez que las burbujas se encuentran en la parte superior de empuje entonces émbolo hasta que el líquido está en la parte superior de la aguja. </li><li> Inserte la aguja en el cuadrante inferior derecho del abdomen. Tire hacia atrás del émbolo para asegurarse de que la sangre o las heces no son aspirados, esto indica una incorrecta colocación de la aguja. Si esto ocurre, retire la aguja y preparar una nueva jeringa. Cuando la aguja se coloca correctamente, expulsar contenido de la jeringa de manera uniforme y lentamente. </li></ol></li></ol> 7. Tumor Escisión y Necropsia <ol><li> Recoger y limpiar all herramientas con etanol al 70% antes de la eutanasia del animal. </li><li> La eutanasia a los animales por el método deseado, se recomienda inhalación de CO2 (2 l / min durante 5 a 10 minutos). Examine el animal para detectar cualquier anormalidad en la condición corporal. </li><li> Colocar el animal en decúbito dorsal sobre una tabla de disección y limpiar el animal con etanol al 70%. </li><li> Utilice las pinzas para levantar la piel en la parte inferior del abdomen. Corte a través de la piel y el músculo con unas tijeras y hacer una incisión medial que recorre la longitud del animal (ano a la barbilla). </li><li> Cortar la caja torácica haciendo dos cortes, uno lateralmente por el lado de la caja torácica y uno a través del esternón para exponer el corazón y los pulmones. Examine los lóbulos del pulmón para cualquier metástasis 27,29. </li><li> Examinar todos los órganos de anomalías y registrar cualquier cambio en el color, tamaño y consistencia. Si es necesario, los órganos incisión con un escalpelo para examinar los tejidos internos. Específicamente, examinar el hígado, los riñones, el bazo y el tracto gastrointestinal. </li><li> Inspeccione los ganglios linfáticos de las metástasis y la ampliación 27,29. </li><li> Para recoger el tumor, hacer incisiones flanco encima y debajo del tumor de tal manera que la piel puede ser arrancada del cuerpo con pinzas. Mientras sujeta firmemente la piel con pinzas, utilizar un bisturí para quitar cuidadosamente el tumor cortando entre el tumor y la dermis (Figura 5). </li><li> Colocar inmediatamente el tumor en un recipiente etiquetado de 10% de formalina tamponada neutral. </li><li> Dependiendo del tamaño del tumor, de 1-2 días (≤ 2 mm, pequeñas) o 5-6 días (&gt; 2 mm, grande) para la fijación de las secciones antes de preparar para el análisis histológico (Figura 6). </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ICP0-Null+HSV-1+and+interferon+signaling+defects+in+the+effective+treatment+of+breast+adenocarcinoma.">The role of ICP0-Null HSV-1 and interferon signaling defects in the effective treatment of breast adenocarcinoma.</a> Mol Ther. 12 (6), 1101-1110 (2005).</li><li>Papp, Z., Middleton, D. M., Mittal, S. K., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunization+with+recombinant+adenoviruses:+induction+of+immunity+and+protection+of+cotton+rats+against+respiratory+bovine+herpesvirus+type+1+infection.">Mucosal immunization with recombinant adenoviruses: induction of immunity and protection of cotton rats against respiratory bovine herpesvirus type 1 infection.</a> J Gen Virol. 78 (11), 2933-2943 (1997).</li><li>Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+pre-existing+adenovirus-specific+immunity+on+immune+responses+induced+by+recombinant+adenovirus+expressing+glycoprotein+D+of+bovine+herpesvirus+type+1.">The effect of pre-existing adenovirus-specific immunity on immune responses induced by recombinant adenovirus expressing glycoprotein D of bovine herpesvirus type 1.</a> Vaccine. 17 (7-8), 933-943 (1999).</li><li>Mittal, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+systemic+and+mucosal+immune+responses+in+cotton+rats+immunized+with+human+adenovirus+type+5+recombinants+expressing+the+full+and+truncated+forms+of+bovine+herpesvirus+type+1+glycoprotein+gD.">Induction of systemic and mucosal immune responses in cotton rats immunized with human adenovirus type 5 recombinants expressing the full and truncated forms of bovine herpesvirus type 1 glycoprotein gD.</a> Virology. 222 (2), 299-309 (1996).</li><li>Steel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syngeneic+Cotton+Rat+Cancer+Model+for+Replicating+Adenoviral+Vectors.">Syngeneic Cotton Rat Cancer Model for Replicating Adenoviral Vectors.</a> Molecular Therapy. 13 (1), 123 (2006).</li><li>Toth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+rat+tumor+model+for+the+evaluation+of+oncolytic+adenoviruses.">Cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses.</a> Hum Gene Ther. 16 (1), 139-146 (2005).</li><li>Toth, K., Spencer, J. F., Wold, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocompetent,+semi-permissive+cotton+rat+tumor+model+for+the+evaluation+of+oncolytic+adenoviruses.">Immunocompetent, semi-permissive cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses.</a> Methods Mol Med. 130, 157-168 (2007).</li><li>Steel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocompetent+syngeneic+cotton+rat+tumor+models+for+the+assessment+of+replication-competent+oncolytic+adenovirus.">Immunocompetent syngeneic cotton rat tumor models for the assessment of replication-competent oncolytic adenovirus.</a> Virology. 369 (1), 131-142 (2007).</li><li>Workenhe, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenic+HSV-mediated+oncolysis+shapes+the+antitumor+immune+response+and+contributes+to+therapeutic+efficacy.">Immunogenic HSV-mediated oncolysis shapes the antitumor immune response and contributes to therapeutic efficacy.</a> Mol Ther. 22 (1), 123-131 (2014).</li><li>Sobol, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+antiviral+immunity+is+a+determinant+of+the+therapeutic+success+of+oncolytic+virotherapy.">Adaptive antiviral immunity is a determinant of the therapeutic success of oncolytic virotherapy.</a> Mol Ther. 19 (2), 335-344 (2011).</li><li>Prince, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cotton+Rat+in+Biomedical+Research.">The Cotton Rat in Biomedical Research.</a> Animal Welfare Information Center Newsletter. 5 (2), (1994).</li></ol>

The authors acknowledge there are no financial conflicts of interest related to this research.

Cotton rats are highly excitable and have a strong flight response. Therefore, special care should be taken to minimize any undue stress on the animal. The cage setup described will allow for safe and easy capture of the animals, with the placement of the enrichment tube being of the utmost importance. When setting up cages, ensure that the enrichment tubes meet the size and shape requirements, and are placed in proper orientation in the cage. It is also important to ensure that any technicians who might be aiding in ani...

Virus oncolíticos (OV) se replican selectivamente en las células tumorales mediante la explotación de las diferencias bioquímicas entre células normales y tumorales 1,2. Hay dos tipos de VO: aquellos que no requieren una mutación para lograr oncolisis selectivo, denominado naturales virus de tipo salvaje y aquellas que deben ser diseñados para lograr oncolisis selectiva. La colección de mutaciones dentro de un tipo de tumor dado determina la naturaleza de la ventaja de crecimiento selectiva sobre las células normales para un OV 2. La seguridad y el beneficio de utilizar VO se ha demostrado en ensayos clínicos 3-7. A pesar de los avances en el campo de la virotherapy oncolítico existen brechas entre los resultados preclínicos y clínicos, lo que sugiere que se necesitan mejores modelos para evaluar la eficacia antitumoral de VO. Virus del herpes bovino tipo 1 (BHV-1) es un miembro de la familia Herpesviridae, subfamilia y Alphaherpesviridae. BHV-1 iniates bovina complejo de la enfermedad respiratoria en ganado, que se manifiesta en una amplia variedad de síntomas similares a un resfriado 8,9. BHV-1 se une a receptores de fijación y de entrada utilizados por HSV-1, tales como el sulfato de heparán y nectin-1 10. Sin embargo, se une CD155 en el lugar de nectin-2 10. BHV-1 tiene una gama de huéspedes muy estrecha de tal manera que es incapaz de entrar e iniciar eficazmente la replicación en células murinas normales y transformadas 3,4,10. Esto hace que el uso de modelos murinos convencionales problemático. La capacidad oncolítico del BHV-1 se ha demostrado in vitro 11,12. BHV-1 se ha demostrado para iniciar la replicación en y matar células tumorales humanas de una variedad de orígenes histológicos, incluyendo las células de cáncer de mama y el cáncer de mama células iniciar 11,12. Sin embargo, la capacidad antitumoral de BHV-1 debe ser evaluado in vivo en el contexto de un huésped inmunocompetente. Adenovirus humano (Ad), para lo cualhay 57 serotipos identificados, más comúnmente causa enfermedades respiratorias en los seres humanos. Vectores de Ad oncolíticos han sido evaluados por su eficacia antitumoral con varios avanzar en ensayos clínicos 13-15. A pesar de los datos pre-clínicos prometedores, los resultados clínicos han estado a la altura de las expectativas. Modelos de xenoinjertos de tumores humanos se suelen utilizar para estudiar la eficacia antitumoral de vectores de anuncios, aunque presentan atenúan la respuesta inmune al virus 16,17. Además, los modelos murinos singénicos no son permisivas a la infección del anuncio, por lo que la evaluación de las respuestas inmunitarias del huésped que utilizan estos modelos impracticables 17,18. El sistema inmune del huésped ha sido identificado como el mecanismo más influyente por el cual VO provocan la muerte de las células tumorales 19. Respuestas antitumorales entre tolerizado y el antígeno asociado a tumor no tolerizado modelos (TAA) son diferentes y pueden afectar en gran medida el éxito de la terapia OV. El HSV-1 OV KM100 (ICP0 n212VP16 en 1814 20) 20,21 provocó la regresión del tumor en el 80% de los ratones portadores de tumor en un modelo de cáncer mamario de antígeno T medio del polioma murino 22. Sin embargo, en HER-2 modelos / neu, la eficacia antitumoral de KM100 varió entre el 20% de regresión completa en ratones singénicos y estasis del tumor en ratones transgénicos, los ratones HER2 hacer tolerante. En conjunto, estos datos ponen de relieve la importancia de evaluar plenamente VO utilizando modelos animales que mejor se recapitulan el paisaje inmunológico humano para entender completamente qué características determinan el éxito terapéutico. La rata algodonera (Sigmodon hispidus), indígena de Norte y Sur América, es más comúnmente utilizado como un modelo de infección por el virus sincitial respiratorio (tal como fue revisado en 5). Ratas del algodón también se utilizan en-BHV-1 Investigación de la vacunación contra, ya que recapitulan la patología asociada con la enfermedad respiratoria bovina complejo 6,23. Además, BHV-1 infección de ratas del algodónes inmunogénica, la inducción de la mucosa sostenido y respuestas inmunes sistémicas 6,23-25. Las líneas celulares se han derivado de fibrosarcoma espontánea y osteosarcomas de la glándula mamaria (LCRT) y el hueso (CCRT y VCRT), respectivamente 26. Ratas del algodón se han utilizado para evaluar la eficacia in vivo de vectores de Ad oncolíticos, ya que son susceptibles a la infección por Ad y exhiben patología similar a los seres humanos 27-29. El uso de modelos inmunocomprometidos para la evaluación preclínica de VO no sólo son menos indicativo de una respuesta clínica a la terapia pero no tienen en cuenta el papel del sistema inmune en virotherapy oncolítico 30,31. Por lo tanto, los modelos de rata de algodón tolerantes a tumores de carcinoma mamario y osteosarcoma singénico y son modelos pertinentes en los cuales evaluar la eficacia pre-clínica de VO, tales como BHV-1 y Ad que no puede ser estudiada usando modelos murinos convencionales.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog #</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>May use any brand&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can prepare in lab, filter to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030164</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Antibiotic-Antimycotic&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Quality Biological Inc.</td>
			<td>110-001-101HI</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-150cm2 tissue culture flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-80</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TypLE Express</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate, flat bottom</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td>May use any brand, must be tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td>May use an alternative reagent for determination of cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8640 Teklad 22/5 Rodent diet</td>
			<td>Harlan&#160;</td>
			<td>8640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#8221; corncob rodent bedding</td>
			<td>Harlan</td>
			<td>7092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestlets</td>
			<td>Ancare</td>
			<td>-</td>
			<td>Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>May use any brand, must be sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>M60302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can prepare in lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog #</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood)</td>
			<td>NAPCO</td>
			<td>Model used not currently available</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Model used not currently available&#160;</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Bright-line Hemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon Trio BioAnalyzer&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>Model used not currently available&#160;</td>
			<td>May use any fluorescence plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Safire2 Multi-detection Microplate Reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Model used not currently available&#160;</td>
			<td>May use any fluorescence plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6R benchtop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366816</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table Top Anaesthesia machine</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>Model used not currently available&#160;</td>
			<td>May use any brand, must be portable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wahl Peanut Mini Clippers</td>
			<td>Wahl</td>
			<td></td>
			<td>May use any brand of small clippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringes 29 G x 1/2&#39;, 0.3 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>329464</td>
			<td>May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat&#8217;s tough skin.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>MedPro</td>
			<td>018-425</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-Pointed Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>8940</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Tissue Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-812-41</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

handling of the cotton rat in studies for the pre-clinical evaluation of oncolytic viruses

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Debido a la naturaleza extremadamente excitable de las ratas del algodón, estar familiarizado con y utilizar procedimientos optimizados para reducir el estrés de los animales facilitará en su uso como un modelo animal preclínico. El uso de técnicas de manejo adecuadas también reducirá al mínimo el riesgo para el investigador. Al utilizar las ratas del algodón es imprescindible para mantener la calma. Las ratas son muy excitables y tratarán de escapar de su jaula. El uso de un tubo ...

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Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

Manejo de la rata del algodón en Estudios para la evaluación preclínica de virus oncolíticos

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

handling-cotton-rat-studies-for-pre-clinical-evaluation-oncolytic

Research

JoVE Journal

Medicine

9.3K vistas.  McMaster University. Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model. 

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Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness of a variety of oncolytic platforms including HSV, Reovirus, and Vaccinia OVs as treatment for cancer are currently underway2-5. One key characteristic of oncolytic viruses is that they can be genetically modified to express reporter transgenes which makes it possible to visualize the infection of tissues by microscopy or bio-luminescence imaging6,7. This offers a unique advantage since it is possible to infect tissues from patients ex vivo prior to therapy in order to ascertain the likelihood of successful oncolytic virotherapy8. To this end, it is critical to appropriately sample tissue to compensate for tissue heterogeneity and assess tissue viability, particularly prior to infection9. It is also important to follow viral replication using reporter transgenes if expressed by the oncolytic platform as well as by direct titration of tissues following homogenization in order to discriminate between abortive and productive infection. The object of this protocol is to address these issues and herein describes 1. The sampling and preparation of tumor tissue for cell culture 2. The assessment of tissue viability using the metabolic dye alamar blue 3. Ex vivo infection of cultured tissues with vaccinia virus expressing either GFP or firefly luciferase 4. Detection of transgene expression by fluorescence microscopy or using an In Vivo Imaging System (IVIS) 5. Quantification of virus by plaque assay. This comprehensive method presents several advantages including ease of tissue processing, compensation for tissue heterogeneity, control of tissue viability, and discrimination between abortive infection and bone fide viral replication.

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are promising for cancer therapeutics. The ability to ascertain the infectability of live tissue specimens obtained from patients prior to treatment is a unique advantage of this therapeutic approach. This protocol describes how to process tissues for ex vivo infection with oncolytic virus and subsequent viral quantification.

Ex infección in vivo del tejido vivo con virus oncolíticos

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Investigación

Medicina

The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel underlying neurobiological mechanisms behind drug action and neurotransmitter-related disorders, such as depression and ADHD. Like most of the imaging methods (PET, SPECT, CT) it represents a progress in the investigation of brain disorders and the related function of neurotransmitter pathways in a non-invasive way with respect of the overall neuronal connectivity. Moreover it also provides the ideal tool for translation to clinical investigations. MRI, while still behind in molecular imaging strategies compared to PET and SPECT, has the great advantage to have a high spatial resolution and no need for the injection of a contrast-agent or radio-labeled molecules, thereby avoiding the repetitive exposure to ionizing radiations. Functional MRI (fMRI) is extensively used in research and clinical setting, where it is generally combined with a psycho-motor task. phMRI is an adaptation of fMRI enabling the investigation of a specific neurotransmitter system, such as serotonin (5-HT), under physiological or pathological conditions following activation via administration of a specific challenging drug.
The aim of the method described here is to assess brain 5-HT function in free-breathing animals. By challenging the 5-HT system while simultaneously acquiring functional MR images over time, the response of the brain to this challenge can be visualized. Several studies in animals have already demonstrated that drug-induced increases in extracellular levels of e.g. 5-HT (releasing agents, selective re-uptake blockers, etc) evoke region-specific changes in blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signals (signal due to a change of the oxygenated/deoxygenated hemoglobin levels occurring during brain activation through an increase of the blood supply to supply the oxygen and glucose to the demanding neurons) providing an index of neurotransmitter function. It has also been shown that these effects can be reversed by treatments that decrease 5-HT availability16,13,18,7. In adult rats, BOLD signal changes following acute SSRI administration have been described in several 5-HT related brain regions, i.e. cortical areas, hippocampus, hypothalamus and thalamus9,16,15. Stimulation of the 5-HT system and its response to this challenge can be thus used as a measure of its function in both animals and humans2,11.

The goal of this technique is to assess serotonin (5-HT) neurotransmitter function in the live and free-breathing animal with pharmacological magnetic resonance imaging (phMRI) and an intravenous challenge with a selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI), fluoxetine.

El uso de la fMRI farmacológico-reto en la investigación preclínica: la aplicación al sistema de 5-HT

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

Evaluación previa a la clínica de inhibidores de tirosina cinasa para el tratamiento de la leucemia aguda

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Transarterial Administration of Oncolytic Viruses for Locoregional Therapy of Orthotopic HCC in Rats

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis. In recent years, oncolytic virotherapies have proven themselves to be potentially powerful tools to fight malignancy. Due to the unique dual blood supply in the liver, it is possible to apply therapies locally to orthotopic liver tumors, which are predominantly fed by arterial blood flow. We have previously demonstrated that hepatic arterial delivery of oncolytic viruses results in safe and efficient transduction efficiency of multifocal HCC lesions, resulting in significant prolongation of survival in immune competent rats. This procedure closely mimics the application of transarterial embolization in patients, which is the standard palliative care provided to many HCC patients. The ability to administer tumor therapies through the hepatic artery in rats allows for a highly sophisticated preclinical model for evaluating novel viral vectors under development. Here we describe the detailed protocol for microdissection of the hepatic artery for infusion of oncolytic virus vectors to treat orthotopic HCC.

Oncolytic virotherapies are under development as novel therapeutics for the treatment of hepatocellular carcinoma (HCC). Here we describe a method for locoregional therapy of HCC via hepatic arterial administration of oncolytic virus.

Administración transarterial de virus oncolíticos para locorregional Terapia de HCC ortotópico en ratas

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis.  In recent years, oncolytic virotherapies have proven ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

Preclínica modelo murino ortotópico de cáncer de próstata humano

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers utilize a syringe pump to directly administer volatile anesthetics into a gas stream. Unlike a traditional vaporizer, it can be used at very low flow rates, making it ideal for use on mice and rats. 
The equipment's capability to use low flow rates could result in a substantial cost savings due to the reduced need for anesthetic agents, compressed gas, and charcoal scavenging filters1. A lower flow rate means less waste of anesthetic gas and likely reduces the risk of anesthetic exposure to laboratory personnel. Thus, the high levels of precision and safety associated with direct injection vaporizers, along with a reduced need for anesthetic agents, compressed gas, and charcoal filters are beneficial for research requiring small animal anesthesia. 
The goal of this protocol is to demonstrate the use of a syringe-driven direct injection vaporizer as part of a digital, low-flow anesthesia system. The direct injection vaporizer is capable of accurately delivering anesthesia at very low flow rates compared to a traditional vaporizer, making it a promising alternative for controlled gas anesthetic delivery to rodents.

Here, we present a protocol to more safely and efficiently administer anesthetic gas to mice using a digital, low flow anesthesia system utilizing a syringe-driven direct injection vaporizer.

El uso de un sistema de bajo flujo Anestesia digital para ratones y ratas

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause severe problems, such as abdominal cramping, bloody diarrhea, and weight loss, in affected individuals. Unfortunately, there is no cure yet, and treatments only aim to alleviate symptoms. Current treatments include anti-inflammatory and immunosuppressive drugs that may cause severe side effects. This warrants the search for alternative treatment options, such as nutritional supplements, that do not cause side effects. Before their application in clinical studies, such compounds must be rigorously tested for effectiveness and security in animal models. A reliable experimental model is the dextran sulfate sodium (DSS) colitis model in mice, which reproduces many of the clinical signs of ulcerative colitis in humans. We recently applied this model to test the beneficial effects of a nutritional supplement containing vitamins C and E, L-arginine, and &#969;3-polyunsaturated fatty acids (PUFA). We analyzed various disease parameters and found that this supplement was able to ameliorate edema formation, tissue damage, leukocyte infiltration, oxidative stress, and the production of pro-inflammatory cytokines, leading to an overall improvement in the disease activity index. In this article, we explain in detail the correct application of nutritional supplements using the DSS colitis model in C57Bl/6 mice, as well as how disease parameters such as histology, oxidative stress, and inflammation are assessed. Analyzing the beneficial effects of different diet supplements may then eventually open new avenues for the development of alternative treatment strategies that alleviate IBD symptoms and/or that prolong the phases of remission without causing severe side effects.

Current treatments of inflammatory bowel diseases (IBD) aim at alleviating disease symptoms but may cause severe side effects. Thus, alternative strategies are being investigated in animal colitis models. Here, we explain how the beneficial effects of diet supplements on clinical IBD signs are analyzed in such a colitis model.

Analizar los efectos beneficiosos de los suplementos nutricionales sobre las funciones epitelial intestinal de barrera durante Experimental Colitis

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include supporting mastication and deglutition, as well as taste-sensing and phonetics. Accordingly, the strength and volume of the tongue can impact the ability of vertebrates to accomplish basic activities such as feeding, communicating, and breathing. Human patients with sleep apnea have enlarged tongues, characterized by reduced muscle tone and increased intramuscular fat that can be visualized and quantified by magnetic resonance imaging (MRI). The abilities to measure force generation and viscoelastic properties of the tongue constitute important tools for obtaining functional information to correlate with imaging data. Here, we present techniques for measuring tongue force production in anesthetized Zucker rats via electrical stimulation of the hypoglossal nerves and for determining the viscoelastic properties of the tongue by applying passive Lissajous force/deformation curves.

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

We describe a surgical procedure in an anesthetized rat model for determining the muscle tone and viscoelastic properties of the tongue. The procedure involves specific stimulation of the hypoglossal nerves and application of passive Lissajous force/deformation curves to the muscle.

Evaluación in vivo de las propiedades mecánicas y viscoelásticas de la lengua de rata

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

A Pre-Clinical Porcine Model of Orthotopic Heart Transplantation

Fifty-years following the first successful report, cardiac transplantation remains the gold-standard treatment for eligible patients with advanced heart failure. Multiple small-animal models of heart transplantation have been used to study the acute and long-term effects of novel therapies. However, few are tested and demonstrated success in clinical trials. It is of critical importance to evaluate new therapies in a clinically relevant large-animal model for efficient and reliable translation of basic studies&#39;&#160;findings. Here, we describe a pre-clinical large-animal (porcine) model of orthotopic heart transplantation that has been firmly established and previously used to investigate novel cardioprotective strategies. This procedure focuses on acute ischemia-reperfusion injury and is a reliable method to investigate novel interventions which have been tested and validated in smaller experimental models, such as the murine model. We demonstrate its usefulness in assessing cardiac performance during the early post-transplantation period and other potential possibilities enabled by the model.

Here, we describe a pre-clinical large-animal (porcine) model of orthotopic heart transplantation that has been firmly established and utilized to investigate novel cardioprotective strategies.

Un modelo preclínico porcino de trasplante ortotópico de corazón

Fifty-years following the first successful report, cardiac transplantation remains the gold-standard treatment for eligible patients with advanced heart ...

Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after circulatory death (DCD) is a solution to address this limited availability, but due to a period of prolonged warm ischemia and the risk of tissue injury, its routine use in cardiac transplantation is seldom seen. In this manuscript we provide a detailed protocol closely mimicking current clinical practices in the context of DCD with continuous monitoring of heart function, allowing for the evaluation of novel cardioprotective strategies and interventions to decrease ischemia-reperfusion injury.
In this model, the DCD protocol is initiated in anesthetized Lewis rats by stopping ventilation to induce circulatory death. When systolic blood pressure drops below 30 mmHg, the warm ischemic time is initiated. After a pre-set warm ischemic period, hearts are flushed with a normothermic cardioplegic solution, procured, and mounted onto a Langendorff ex vivo heart perfusion system. Following 10 min of initial reperfusion and stabilization, cardiac reconditioning is continuously evaluated for 60 min using intraventricular pressure monitoring. A heart injury is assessed by measuring cardiac troponin T and the infarct size is quantified by histological staining. The warm ischemic time can be modulated and tailored to develop the desired amount of structural and functional damage. This simple protocol allows for the evaluation of different cardioprotective conditioning strategies introduced at the moment of cardioplegia, initial reperfusion and/or during ex vivo perfusion. Findings obtained from this protocol can be reproduced in large models, facilitating clinical translation.

This protocol shows a simple and flexible approach for the evaluation of new conditioning agents or strategies to increase the feasibility of cardiac donation after circulatory death.

Modelo preclínico de donación cardíaca después de la muerte circulatoria

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after ...