Name: handling of the cotton rat in studies for the pre-clinical evaluation of oncolytic viruses
Uploaded: 2014-11-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
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Breanne Cuddington holds a fellowship from the Canadian Breast Cancer Foundation. This work was sponsored by operating grants from the Cancer Research Society and the Canadian Cancer Society Research Institute (formerly the Canadian Breast Cancer Research Alliance). We thank Ann Tollefson (Saint Louis University School of Medicine) for LCRT cells and Dr. Kathleen Delaney and Marion Corrick for technical assistance with cotton rat housing and sedation.

HINWEIS: Die verwendeten Protokolle sind von unseren institutionellen Tierforschung Ethikrat an der McMaster University nach Canadian Council on Animal Care-Richtlinien zugelassen. Die Experimente wurden an der McMaster Universität Zentrale Tierlabor durchgeführt. 1. Die Kultivierung LCRT Cells <ol><li> Kultur LCRT Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin ergänzt. Pflegen Zellen in T-150 Gewebekulturkolben bei 37 ° C und 5% CO 2. Passage-Zellen, wenn sie sich bilden, eine 90% konfluente Monoschicht (alle 2-3 Tage, Abbildung 1). </li><li> Vorwärmen 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), 1x Trypsin und Medium in ein 37 ° C Wasserbad für 10 min vor dem Splitten der Zellen. </li><li> Aspirat Medium aus dem Kolben und spülen Zellen mit 5 ml 1x PBS. </li><li> Nach dem Abspülen absaugen PBS und InkubationZellen mit 2 ml 1X Trypsin bis Zellen dissoziiert aus dem Kolben (~ 2 min). </li><li> Zellen in 8 ml Medium (für insgesamt 10 ml Zellsuspension) und sanft Pipette auf und ab zu brechen Zellklumpen. </li><li> Pflegen Zellen in einem T-150-Kolben durch Impfen 1 ml Zellsuspension in 24 ml Medium (mit insgesamt 25 ml pro T-150) und Rock Kolben sanft von einer Seite zur anderen. Pflegen Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 bis zum nächsten Split. </li></ol> 2. Beurteilung der Virusreplikation und Zytotoxizität in LCRT Cells <ol><li> Virus-Replikation HINWEIS: Virus-Konstrukte ein Fluoreszenz-Tag zum Ausdruck, wie das grün fluoreszierende Protein (GFP), unter der Kontrolle der endogenen viralen Promotoren zu erleichtern Visualisierung von Virus-Infektion und verbreitet mit Fluoreszenz-Plattenleser. <ol><li> Seed LCRT Zellen in Kulturschalen, so dass ein gut für die Zählung. Samenzellen, dass sie 80-90% konfluent einen Tag mehr sein. Verwenden Sie eine Konzentration von 10 5 cells / ml (100 ul pro Vertiefung), um die gewünschte Konfluenz einen Tag später in 96-Well-Flachbodenplatten zu produzieren. </li><li> Am nächsten Tag, vorwärmen 1x PBS, 1x Trypsin, vollständig und serumfreien Medium in einem 37 ° C Wasserbad für 10 Minuten vor dem Start des Experiments. </li><li> Saugen Sie das Medium aus den Zählen gut und spülen Zellen mit 5 ml 1x PBS durch Schwenken über die Oberfläche des Brunnens. </li><li> Nach dem Abspülen absaugen PBS und Inkubation Zellen mit 2 ml 1x Trypsin, bis die Zellen distanzieren sich ausdrücklich von den Kolben (~ 2 min). </li><li> Die Zellen in dem entsprechenden Volumen von komplettem Medium auf eine Zelldichte innerhalb des Bereichs zählbaren Ausbeute unter Verwendung eines Hämocytometers. Um eine genaue Zellzahl zu gewährleisten, gründliche Durchmischung der Zellsuspension vor dem Impfen der Zählkammer durch Auf- und Abpipettieren. </li><li> Bestimmen das Volumen der Virusbestand für die Infektion in der gewünschten Multiplizität der Infektion (MOI) erforderlich. Erforderliche Paque bildenden Einheiten (pfu) = Anzahl der plattierten Zellen * MOI(Pfu / Zelle) Volumen der Virusstamm erforderlich = Pflicht pfu / Virus-Stamm Titer (pfu / ml) </li><li> Bereiten Virusinokulum in serumfreiem Medium in Röhrchen. Gründlich mischen durch Vortexen oder Pipettieren bevor Inokulum zu den Zellen. </li><li> Infizieren Zellen für 1 h bei 37 ° C, wonach Anwendung eines Wartungs Overlay DMEM + 1% FBS. </li><li> Scan-Platten ein und zwei Tage nach der Infektion (pi) auf GFP-Fluoreszenz sichtbar zu machen. </li></ol></li><li> Virus Zytotoxizität HINWEIS: Führen Sie die Resazurin Zytotoxizitätsassay bei schlechten Lichtverhältnissen, wie die Verbindung lichtempfindlich ist. Nur ein gut enthaltenden Medium sollte einbezogen werden, um für die Hintergrundfluoreszenz zu korrigieren. <ol><li> Eine 5% ige (v / v) Lösung von Resazurin in 1x PBS. Mischen Sie die Lösung mit einer Pipette. </li><li> Absaugen Medium von Zellen, und ziehen Sie die 5% Resazurin-Lösung. Fügen Sie ein gut haltigen Medium nur für Hintergrundfluoreszenz zu korrigieren. </li><li> Inkubieren Zellen für 30 min bei 37 ° C, nach demdie lesen Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzplattenlesegerät (Anregung 530 nm, Emission 595 nm). </li><li> Analysieren Daten relativ zu infizierten Kontrollen Korrektur Hintergrundfluoreszenz. </li></ol></li></ol> 3. Gehäuse und Handhabung <ol><li> Gehäuse und Diät <ol><li> Haus Baumwollratten einzeln in Bekämpfung in Polycarbonat Ratten Käfige Nager Betten (1/8 &quot;Maiskolben Betten), einen Teil der PVC-Schlauch nicht mehr als 8 Zoll und nestlets als Bereicherung (Abbildung 2), die zu verringern. </li><li> Verwenden Sie einen sicherungsfähigen Stahlkorb zu überragen des Käfigs zu sitzen und enthalten Nagerfutter und eine Flasche Wasser. HINWEIS: Dieser Käfig Setup für einfache und sichere Erfassung der Tiere zu ermöglichen, mit der Platzierung der Anreicherung Rohr gegen das Ende des Käfigs Befinden von größter Bedeutung. </li></ol></li><li> Handhabung <ol><li> Griff Baumwollratten am Morgen, vor dem Runden von Tieranlage Techniker vor vermeiden spannende ihneneine Prozedur. </li><li> Bei allen Verfahren, tragen dicke Lederhandschuhe für den Schutz. </li><li> Da die Tiere vor allem in den Anreicherungsrohre bleiben, nutzen sie, um die Ratten während der routinemäßigen Reinigung in einen neuen Käfig übertragen. Alternativ öffnen Sie den Käfig leicht, damit der Handler, um ihre Hand in zu erreichen, kann das Tier dann durch scruffing die Haut direkt über den Schultern und schob sich zurückgehalten werden. Sorgfältig keine übermäßige Kraft verwenden, wie das Tier die Zunge beißen. </li><li> Seien Sie geduldig und verwenden Sie eine ruhige Hand, wie die Tiere haben eine starke Flug-oder-Kampf-Reaktion und werden versuchen, Gefangennahme durch Laufen und Springen aus dem Käfig zu vermeiden. Wichtig ist, dass keine Tiere behandeln Sie am Schwanz als degloving auftreten. </li><li> Fangen die Tiere in ihrer Anreicherungen Rohre über direktes Handling. Diese drastisch ab Verletzungen und Flucht. </li></ol></li></ol> 4. Erfassung und Anästhesie <ol><li> Erfassung <ol><li> Tragen Sie dicke Lederhandschuhe für schützenIon in allen Verfahren. </li><li> Verwenden Sie eine große durchsichtigen Kunststoff-Container mit Löchern für Luft und einem Deckel, einer Narkoseeinleitung Kammer groß genug sein, um den Behälter und einen Nasenkegel auf die Gasausgangsschlauch (Bild 3) ausgestattet passen. </li><li> Paarweise zusammenarbeiten, damit das Verfahren effizienter und um die Belichtungszeit der Tiere bis zu Isofluran Inhalationsanästhetikum verringern. Achten Sie darauf, ein Forscher ist zum Öffnen und Ersetzen der Stahlabdeckung auf dem Käfig und dem Deckel der Induktionskammer (Handler # 1) verantwortlich und ihre Mitarbeiter ist für die Aufnahme des Tieres in der Röhre und den Transport in die Induktionskammer zuständig (Handler # 2). </li><li> Setzen Sie den Käfig auf eine ebene Fläche und entfernen Sie den äußeren Deckel. Heben Sie die Stahleinzugsfach leicht und langsam manövrieren die Anreicherung Rohr so ​​parallel zu den Seiten des Käfigs und gegen die Rückseite ist. Verwenden Sie bei Bedarf ein Objekt, um die Anreicherung Rohr ohne Öffnen des Käfigs zu vermeiden Rühren der Tier manövrieren (GriffR # 1). </li><li> Wenn das Tier aufgeregt und verlässt das Rohr, lassen Sie genügend Zeit für das Tier zu entspannen und wieder in das Rohr (Handler # 1) zu begleichen. </li><li> Langsam und gezielt heben die Kante des Stahlabdeckung weitesten vom Anreicherungsrohr, wobei das andere Ende in Kontakt mit dem Käfig. Machen Sie einen Raum groß genug für die Kunststoffbehälter (Handler # 2). </li><li> In einer glatten, schnellen Bewegung, drücken Sie den Kunststoffbehälter überragen der Anreicherungsrohr. Halten den Kontakt des Behälters mit der Seite des Käfigs, Einfangen des Tieres in der Röhre. Führen Sie die Schritte 4.1.6 und 4.1.7 so schnell wie möglich (Handler # 2). </li><li> Entfernen Sie die Stahleinzugsfach und geben dem Kunststoffbehälterdeckel zu Handler # 2 (Handler # 1). Schieben Sie den Kunststoffdeckel von der Seite des Käfigs und dem Behälter, wenn ich denke an Anhängsel der gefangenen Tieres in den Prozess. Den Behälter nicht verschließen, da dies der nächste Schritt zu erschweren (Handler # 2). </li></ol></li><li> Anesthesia <ol><li> Sicherstellen, dass der Behälter bleibt geschlossen und zum Transport des Tieres in die Induktionskammer. Legen Sie schnell das Tier in der Kammer und entfernen Sie den Behälterdeckel in einer flüssigen Bewegung (Handler # 2). Öffnen und die Induktion Kammerdeckel sofort zu ersetzen (Handler # 1). </li><li> Schalten auf den Fluss von Isofluran mit der Induktionskammer (5 l / min) und zu überwachen, das Tier Anzeichen von Lethargie, an welchem ​​Punkt schnell gleiten das Tier aus dem Rohr und dem Behälter, Entfernen sowohl von der Induktionskammer zur Gaszirkulation ermöglichen. </li><li> Wenn die Ratten vollständig betäubt wird, bewegen sie auf die Arbeitsfläche und legen Sie die Nase und den Mund in den Nasenkegel (Abbildung 3). Die Ratte ist vollständig betäubt, wenn sie nicht mehr auf einem kräftigen Zehen Prise ist. </li><li> Zeigen Tierarzt Vaseline Augensalbe auf die Augen des Tieres bis zur Trockenheit und Schürfwunden zu verhindern. Dies ist ein wesentlicher Schritt, wie Baumwollratten haben große Augen, die für Infektionen anfällig sein kann, wenn Verletzung auftritt. </li> &lt;li&gt; sorgfältig zu überwachen und eine konstante Atemfrequenz und damit der Nase des Tieres in der Nasenkegel während des gesamten Verfahrens Montage bleibt. Die Durchflussmenge von Isofluran angemessen. Die Höhe der Isofluran erforderlich, um zu betäuben jedes Tier variieren. </li><li> Post-Verfahren, bringen Sie das Tier in seinen Käfig und sicherzustellen, dass er die volle Mobilität und Brustlage gewinnt. </li></ol></li></ol> 5. Herstellung von LCRT Cells zur subkutanen Tumorentstehung ANMERKUNG: Eine T-150-Kolben LCRT (90% Konfluenz) ergibt ca. 2 x 10 7 Zellen. Basieren Sie die Anzahl der T-150-Kolben auf der Gesamtzahl der Zellen erforderlich erforderlich. Saatgut zusätzliche Kolben um die Gesamtzahl von Zellen erforderlich ist, erhalten zu gewährleisten und Zellen während der Herstellung und die für zusätzliche Injektionen benötigt verloren aufzunehmen. Halten Sie Zellen auf Eis, wenn möglich die Lebensfähigkeit der Zellen zu verlängern. <ol><li> Um Zellen, absaugen Medium aus dem Kolben eine Ernted rinse-Zellen mit 5 ml 1x PBS. </li><li> Absaugen PBS und Inkubation Zellen mit 2 ml 1x Trypsin, bis die Zellen distanzieren sich ausdrücklich von den Kolben (~ 2 min). </li><li> Zellen in 8 ml Medium (für insgesamt 10 ml Zellsuspension) und sanft Pipette auf und ab zu brechen Zellklumpen. Weiter zu Zellen von zusätzlichen Kolben ernten. </li><li> Pool alle Zellsuspensionen in einem konischen Rohr, etwa 4 T-150s pro 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifuge das Rohr bei 160 x g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Absaugen Medium und Zellpellet in dem entsprechenden Volumen PBS (10 ml PBS pro T-150), um eine Zelldichte in der abzählbaren Bereich ergeben mit einer Zählkammer. Um eine genaue Zellzahl zu gewährleisten, gründliche Durchmischung der Zellsuspension vor dem Laden der Zählkammer durch Auf- und Abpipettieren. </li><li> Berechnen der Gesamtzahl der Zellen: Gesamtzahl der Zellen geerntet = Zellzahl (Zellen / ml) x Resuspensionsvolumen (ml) </li><li> Bestimmendas Volumen der Zellsuspension für alle Injektionen erforderlich. Stellen 2-3 die Dosis pro Experiment. Insgesamt wurden 5 × 10 5 LCRT Zellen subkutan injiziert wird tastbaren Tumoren innerhalb von 3-4 Tagen zu bilden. Gesamtzahl der Zellen benötigt = 5 x 10 5 Zellen x Gesamtzahl der Dosen Volumen Zellsuspension benötigt (ml) = (erforderlich * Summe der Einspritzvolumina Gesamtzellen) / (Gesamtzahl der Zellen geerntet) </li><li> Pipettieren Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension in eine konische Röhrchen mit PBS und gründlich mischen. Aliquoten Einzeleinspritzungen (100 ul) in Eppendorf-Röhrchen. Während der Einspritzvorgang Röhrchen auf Eis halten. </li></ol> 6. Injektionen HINWEIS: Führen Sie die Verfahren mit zwei Forscher, ein, um die Injektionen, während die anderen Monitore Atmungsrate der Tiere und den allgemeinen Zustand, während unter Narkose durchzuführen. Verwenden Insulinspritzen (29 G x 1/2 &quot;, 0,3 ml) für alle Injektionen und eine neue Nadel fürjedes Tier. <ol><li> Subkutane Injektionen <ol><li> Zu erfassen und zu betäuben das Tier (Abschnitt 4). </li><li> Rasieren Sie die Injektionsstelle mit Klipper. Baumwollratten Fell ist dick und erfordert eine scharfe Schneid um eine glatte Oberfläche für Injektionszwecke zu erhalten. Reinigen Sie die Injektionsstelle mit 70% Ethanol mit einem Wattestäbchen und lassen Sie es vollständig, bevor Sie fortfahren verdampfen. </li><li> Last Spritzen (29 G x 1/2 &quot;, 0,3 ml) mit den Zellen durch die Erstellung von langsam und stetig. Wenn Blasen liegen auf der Hand Flick die Spritze mit etwas Kraft. Sobald die Blasen an der Spitze drücken Sie den Kolben, bis die Flüssigkeit ist an der Spitze der Nadel. </li><li> Heben Sie die Haut an der Injektionsstelle (wie Haut Zelten bezeichnet), und führen Sie die Nadel Kegel Seite nach oben. Achten Sie darauf, die Nadel bewegt sich frei unter der Haut zu vermeiden, die Injektion intramuskulär. </li><li> Vertreibung der Inhalt der Spritze langsam und gleichmäßig. Ziehen Sie die Nadel Kegelseite nach unten. </li></ol></li><li> Intratumorale Injektionen <ol><li> Erfassen Sie eind betäuben das Tier (Abschnitt 4). </li><li> Reinigen Sie die Injektionsstelle mit 70% Ethanol mit einem Wattestäbchen und lassen Sie es vollständig, bevor Sie fortfahren verdampfen. </li><li> Last Spritzen (29 G x 1/2 &quot;, 0,3 ml) mit dem Virus Inoculum durch die Erstellung von langsam und stetig, während die Nadel in einer aufrechten Position halten. Wenn Blasen liegen auf der Hand Flick die Spritze mit etwas Kraft. Sobald die Blasen an der Spitze Push dann Kolben, bis die Flüssigkeit an der Spitze der Nadel. </li><li> Führen Sie die Nadel Kegelseite nach oben in den Tumor und die Inhalte der Spritze auszustoßen langsam und gleichmäßig während der Bewegung der Nadel in einem fächerförmigen Muster, teilweise Zurückziehen der Nadel vor jeder Bewegung Platzwunde des Tumors zu verhindern. Ziehen Sie die Nadel Kegelseite nach unten. HINWEIS: Die subkutane LCRT Tumoren schnell wachsenden und erreichte etwa 100 mm 3 in 5-7 Tagen sind. Weiterhin bilden nekrotischen und hämorrhagische Zentren oft auf der Oberfläche des Tumors innerhalb von mehreren Tagen und erfordern caReful Überwachung (Abbildung 4). </li></ol></li><li> Intraperitoneale Injektionen <ol><li> Zu erfassen und zu betäuben das Tier (Abschnitt 4). </li><li> Reinigen Sie die Injektionsstelle mit 70% Ethanol mit Wattestäbchen und lassen Sie es vollständig, bevor Sie fortfahren verdampfen. </li><li> Last Spritzen (29 G x 1/2 &quot;, 0,3 ml) mit dem Medikament durch die Erstellung von langsam und stetig. Wenn Blasen liegen auf der Hand Flick die Spritze mit etwas Kraft. Sobald die Blasen an der Spitze Push dann Kolben, bis die Flüssigkeit an der Spitze der Nadel. </li><li> Führen Sie die Nadel in den rechten unteren Quadranten des Bauches. Ziehen Sie den Kolben, um sicherzustellen, dass Blut oder Kot wird nicht angesaugt ist, zeigt dies eine falsche Platzierung der Nadel. Wenn dies der Fall ist, ziehen Sie die Nadel und bereiten eine neue Spritze. Wenn die Nadel richtig eingesetzt, Inhalt der Spritze auszustoßen gleichmäßig und langsam. </li></ol></li></ol> 7. Tumorentfernung und Necropsy <ol><li> Sammeln und Reinigen all Werkzeuge mit 70% igem Ethanol vor der Euthanasie der Tiere. </li><li> Euthanize das Tier durch das gewünschte Verfahren wird CO 2 Inhalation (2 l / min 5-10 min) empfohlen. Untersuchen Sie das Tier für alle Anomalien in Körperkondition. </li><li> Legen Sie das Tier in Rückenlage auf einer Dissektion Bord und reinigen Sie das Tier mit 70% Ethanol. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um die Haut am Unterbauch zu heben. Schnitt durch die Haut und Muskeln mit einer Schere und eine mediale Inzision entlang der Länge des Tieres (Anus bis zum Kinn). </li><li> Schneiden Sie den Brustkorb, indem zwei Schnitte, eine seitlich an der Seite des Brustkorbs und eine über dem Brustbein, um das Herz und die Lunge aus. Untersuchen Sie die Lungenlappen für Metastasen 27,29. </li><li> Überprüfen Sie alle Organe auf Anomalien untersuchen und etwaige Änderungen in Farbe, Größe und Konsistenz. Falls erforderlich, einschneiden die Organe mit einem Skalpell zu inneren Geweben zu untersuchen. Insbesondere prüft die Leber, Nieren, Milz und Magen-Darm-Traktes. </li><li> Überprüfen Sie die Lymphknoten Metastasen und Erweiterung 27,29. </li><li> Um den Tumor zu sammeln, müssen Flanke Einschnitte oberhalb und unterhalb des Tumors, so dass sich die Haut vom Körper mit einer Pinzette herausgezogen werden. Während Festhalten der Haut mit einer Pinzette, mit einem Skalpell vorsichtig den Tumor, indem zwischen dem Tumor und Dermis (Abbildung 5). </li><li> Sofort setzen Sie den Tumor in einem beschrifteten Behälter von 10% neutral gepuffertem Formalin. </li><li> Abhängig von der Größe des Tumors, 1-2 Tage (≤ 2 mm, klein) oder 5-6 Tage (&gt; 2 mm, groß) zur Befestigung vor Vorbereitungsabschnitte für die histologische Analyse (Abbildung 6). </li></ol>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+pre-existing+adenovirus-specific+immunity+on+immune+responses+induced+by+recombinant+adenovirus+expressing+glycoprotein+D+of+bovine+herpesvirus+type+1.">The effect of pre-existing adenovirus-specific immunity on immune responses induced by recombinant adenovirus expressing glycoprotein D of bovine herpesvirus type 1.</a> Vaccine. 17 (7-8), 933-943 (1999).</li><li>Mittal, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+systemic+and+mucosal+immune+responses+in+cotton+rats+immunized+with+human+adenovirus+type+5+recombinants+expressing+the+full+and+truncated+forms+of+bovine+herpesvirus+type+1+glycoprotein+gD.">Induction of systemic and mucosal immune responses in cotton rats immunized with human adenovirus type 5 recombinants expressing the full and truncated forms of bovine herpesvirus type 1 glycoprotein gD.</a> Virology. 222 (2), 299-309 (1996).</li><li>Steel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syngeneic+Cotton+Rat+Cancer+Model+for+Replicating+Adenoviral+Vectors.">Syngeneic Cotton Rat Cancer Model for Replicating Adenoviral Vectors.</a> Molecular Therapy. 13 (1), 123 (2006).</li><li>Toth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+rat+tumor+model+for+the+evaluation+of+oncolytic+adenoviruses.">Cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses.</a> Hum Gene Ther. 16 (1), 139-146 (2005).</li><li>Toth, K., Spencer, J. F., Wold, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocompetent,+semi-permissive+cotton+rat+tumor+model+for+the+evaluation+of+oncolytic+adenoviruses.">Immunocompetent, semi-permissive cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses.</a> Methods Mol Med. 130, 157-168 (2007).</li><li>Steel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocompetent+syngeneic+cotton+rat+tumor+models+for+the+assessment+of+replication-competent+oncolytic+adenovirus.">Immunocompetent syngeneic cotton rat tumor models for the assessment of replication-competent oncolytic adenovirus.</a> Virology. 369 (1), 131-142 (2007).</li><li>Workenhe, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenic+HSV-mediated+oncolysis+shapes+the+antitumor+immune+response+and+contributes+to+therapeutic+efficacy.">Immunogenic HSV-mediated oncolysis shapes the antitumor immune response and contributes to therapeutic efficacy.</a> Mol Ther. 22 (1), 123-131 (2014).</li><li>Sobol, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+antiviral+immunity+is+a+determinant+of+the+therapeutic+success+of+oncolytic+virotherapy.">Adaptive antiviral immunity is a determinant of the therapeutic success of oncolytic virotherapy.</a> Mol Ther. 19 (2), 335-344 (2011).</li><li>Prince, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cotton+Rat+in+Biomedical+Research.">The Cotton Rat in Biomedical Research.</a> Animal Welfare Information Center Newsletter. 5 (2), (1994).</li></ol>

The authors acknowledge there are no financial conflicts of interest related to this research.

Cotton rats are highly excitable and have a strong flight response. Therefore, special care should be taken to minimize any undue stress on the animal. The cage setup described will allow for safe and easy capture of the animals, with the placement of the enrichment tube being of the utmost importance. When setting up cages, ensure that the enrichment tubes meet the size and shape requirements, and are placed in proper orientation in the cage. It is also important to ensure that any technicians who might be aiding in ani...

Onkolytischer Viren (OV) selektiv in Tumorzellen zu replizieren, indem biochemische Unterschiede zwischen normalen und Tumorzellen 1,2. Es gibt zwei Arten von OVs: solche, die keine Mutation an selektiven Onkolyse zu erreichen, die als natürlich vorkommende Wildtyp-Viren und solche, die dazu entworfen sind, um eine selektive Onkolyse erzielen. Die Sammlung von Mutationen in einem bestimmten Tumortyp bestimmt die Art der selektiven Wachstumsvorteil gegenüber normalen Zellen für eine OV 2. Die Sicherheit und der Vorteil der Verwendung OVs wurde in klinischen Studien 3-7 gezeigt. Trotz Fortschritten auf dem Gebiet der onkolytischen Virotherapie existieren Lücken zwischen präklinischen und klinischen Ergebnissen, was darauf hindeutet, dass eine bessere Modelle werden benötigt, um die Antitumor-Wirksamkeit von OVs bewerten. Bovine Herpesvirus Typ 1 (BHV-1) ist ein Mitglied der Familie Herpesviridae und Alphaherpesviridae Subfamilie. BHV-1 initiates Atemwegserkrankungen beim Rind Komplex bei Rindern, manifestiert sich in einer Vielzahl von Symptomen ähnlich einer Erkältung 8,9. BHV-1 bindet durch HSV-1 verwendet Befestigung und Eintrittsrezeptoren, wie Heparansulfat und Nectin-1 10. Jedoch bindet CD155 an die Stelle der Nectin-2 10. BHV-1 hat einen sehr engen Wirtsbereich, so dass er nicht in der Lage, effizient ein und initiiert die Replikation in normalen und transformierten Mäusezellen 3,4,10 ist. Dies macht den Einsatz von herkömmlichen murinen Modellen problematisch. Onkolytisches Kapazität von BHV-1 wurde in vitro 11,12 nachgewiesen. BHV-1 wurde gezeigt, dass die Replikation in einer Vielzahl von histologischen Ursprungs, einschließlich Brustkrebszellen und Brustkrebszellen initiieren 11,12 initiieren und zu töten menschlichen Tumorzellen. Jedoch muss die Antitumor Kapazität von BHV-1 in vivo im Kontext eines immunkompetenten Wirts ausgewertet werden. Menschliche Adenovirus (Ad), für welcheEs gibt 57 identifizierte Serotypen, am häufigsten verursacht Atemwegserkrankungen beim Menschen. Onkolytischen Ad-Vektoren wurden für ihre Antitumorwirksamkeit mit mehreren fort in klinischen Studien 13 bis 15 bewertet worden. Trotz vielversprechender präklinischer Daten haben klinische Ergebnisse hinter den Erwartungen zurück. Menschliche Tumor Xenotransplantatmodellen werden typischerweise verwendet, um die Antitumor-Wirksamkeit von Ad Vektoren zu untersuchen, obwohl zeigen sie abgeschwächt Immunreaktionen auf den Virus 16,17. Darüber hinaus sind syngenen Mausmodell nicht-permissiven zur Ad-Infektion, so dass die Auswertung der Wirtsimmunreaktionen mit diesen Modellen unpraktisch 17,18. Der Host-Immunsystem als der einflussreichste Mechanismus, durch den OVs entlocken Tumorzelltod 19 identifiziert. Antitumor-Antworten zwischen tolerierten und nicht-tolerierten Tumor-assoziiertes Antigen (TAA) Modelle unterscheiden und kann stark Einfluss auf den Erfolg der OV-Therapie. Das HSV-1 OV KM100 (ICP0 N212VP16 1814 20) 20,21 ausgelöst Tumorrückgang bei 80% der tumortragenden Mäusen in einem murinen Polyoma Mittel T-Antigen Brustkrebsmodell 22. Doch in HER-2 / neu-Modelle, die Antitumor-Wirksamkeit von KM100 variiert zwischen 20% vollständige Regression in syngenen Mäusen und Tumor Stase in transgenen, HER2-toleranten Mäusen. Zusammen stellen diese Daten unterstreichen die Bedeutung einer vollständigen Auswertung OVs anhand von Tiermodellen, die am besten zu rekapitulieren das menschliche Immunsystem Landschaft zu verstehen, welche Funktionen bestimmen den Therapieerfolg. Die Baumwollratte (Sigmodon hispidus), heimisch in Nord- und Südamerika, wird am häufigsten als ein Modell der RS-Virus-Infektion (wie in 5 überprüft). Baumwollratten sind auch in anti-BHV-1-Impfung Forschung verwendet, da sie die Pathologie, die mit Atemwegserkrankungen beim Rind komplexen 6,23 verbunden rekapitulieren. Weiterhin BHV-1-Infektion von Baumwollrattenimmunogen und induziert anhalt Schleimhaut und systemische Immunreaktionen 6,23-25. Zelllinien wurden aus spontanen Fibrosarkom und Osteosarkom der Brustdrüse (LCRT) und Knochen (CCRT und VCRT) bzw. 26 abgeleitet. Baumwollratten wurden verwendet, um die in vivo Wirksamkeit von onkolytischen Ad Vektoren zu bewerten, da sie anfällig für Ad-Infektion sind und eine ähnliche Pathologie an Menschen 27-29. Die Verwendung von immun Modelle für die präklinische Bewertung OVS sind nicht nur weniger anzeigt klinische Ansprechen auf die Therapie, aber sie berücksichtigen nicht die Rolle des Immunsystems bei onkolytischen Virotherapie 30,31 statt. Daher ist die syngene Tumor tolerisiert Baumwollrattenmodell des Mammakarzinoms und Osteosarkom relevant sind Modelle, in denen die präklinische Wirksamkeit OVs wie BHV-1 und Ad die unter Verwendung herkömmlicher Mausmodellen nicht untersucht werden können, zu bewerten.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>May use any brand&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1X Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Can prepare in lab, filter to sterilize</td></tr><tr><td>200 mM L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>100x Antibiotic-Antimycotic&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Quality Biological Inc.</td><td>110-001-101HI</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>T-150cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; tissue culture flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-80</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>1X TypLE Express</td><td>Life Technologies</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>12-well cell culture plate, flat bottom</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td>May use any brand, must be tissue culture treated</td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>Life Technologies</td><td>DAL1025</td><td>May use an alternative reagent for determination of cell viability</td></tr><tr><td>8640 Teklad 22/5 Rodent diet</td><td>Harlan&amp;nbsp;</td><td>8640</td><td></td></tr><tr><td>1/8&amp;rdquo; corncob rodent bedding</td><td>Harlan</td><td>7092</td><td></td></tr><tr><td>Nestlets</td><td>Ancare</td><td>-</td><td>Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable</td></tr><tr><td>50 mL Conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>May use any brand, must be sterile</td></tr><tr><td>Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td>M60302</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td>Can prepare in lab</td></tr><tr><td>10 % Neutral Buffered Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood)</td><td>NAPCO</td><td>Model used not currently available</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>Model used not currently available&amp;nbsp;</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Reichert Bright-line Hemacytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>Typhoon Trio BioAnalyzer&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Model used not currently available&amp;nbsp;</td><td>May use any fluorescence plate reader</td></tr><tr><td>Tecan Safire&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Multi-detection Microplate Reader</td><td>Tecan</td><td>Model used not currently available&amp;nbsp;</td><td>May use any fluorescence plate reader</td></tr><tr><td>Allegra 6R benchtop centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>Table Top Anaesthesia machine</td><td>VetEquip</td><td>Model used not currently available&amp;nbsp;</td><td>May use any brand, must be portable</td></tr><tr><td>Wahl Peanut Mini Clippers</td><td>Wahl</td><td></td><td>May use any brand of small clippers</td></tr><tr><td>Insulin syringes 29 G x 1/2&#039;, 0.3 mL</td><td>BD</td><td>329464</td><td>May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat&amp;rsquo;s tough skin.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cotton swabs</td><td>MedPro</td><td>018-425</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>Sharp-Pointed Dissecting Scissors</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>Dissecting Tissue Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-41</td><td>May use any brand</td></tr></tbody></table>

handling of the cotton rat in studies for the pre-clinical evaluation of oncolytic viruses

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Durch die extrem erregbarer Natur der Baumwollratten, da kennen und Verwendung von Verfahren optimiert, um die Belastung der Tiere zu reduzieren wird bei der Nutzung als präklinischen Tiermodell zu erleichtern. Verwendung der richtigen Handhabungstechniken minimiert auch die Gefahr für die Forscher. Bei der Verwendung von Baumwollratten ist es unerlässlich, ruhig zu bleiben. Die Ratten wurden leicht erregbar und versucht, ihren Käfig entkommen. Verwendung eines Anreicherungsrohr und nest...

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Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

Die Handhabung der Baumwolle Ratte in Studien für die präklinische Bewertung onkolytischer Viren

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

9.3K Aufrufe.  McMaster University. Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model. 

Serie: Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus replication. Here we present the application of this technology to uncovering host targets that specifically modulate the replication of Maraba virus, an oncolytic rhabdovirus, and vaccinia virus with the goal of enhancing therapy. While the protocol has been tested for use with oncolytic Maraba virus and oncolytic vaccinia virus, this approach is applicable to other oncolytic viruses and can also be utilized for identifying host targets that modulate virus replication in mammalian cells in general. This protocol describes the development and validation of an assay for high-throughput RNAi screening in mammalian cells, the key considerations and preparation steps important for conducting a primary high-throughput RNAi screen, and a step-by-step guide for conducting a primary high-throughput RNAi screen; in addition, it broadly outlines the methods for conducting secondary screen validation and tertiary validation studies. The benefit of high-throughput RNAi screening is that it allows one to catalogue, in an extensive and unbiased fashion, host factors that modulate any aspect of virus replication for which one can develop an in vitro assay such as infectivity, burst size, and cytotoxicity. It has the power to uncover biotherapeutic targets unforeseen based on current knowledge.

Here we describe a protocol for employing high-throughput RNAi screening to uncover host targets that can be manipulated to enhance oncolytic virus therapy, specifically rhabodvirus and vaccinia virus therapy, but it can be readily adapted to other oncolytic virus platforms or for discovering host genes that modulate virus replication generally.

Genomweiten RNAi-Screening, Host Faktoren zu identifizieren, die onkolytische Viren Therapie zu modulieren

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Forschung

Krebsforschung

A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while animals are engaged in learning and memory tasks. The approach combines pharmacogenetics (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) with a behavioral paradigm (sensory preconditioning) that is designed to distinguish between different forms of learning. Specifically, viral-mediated delivery is used to express a genetically modified inhibitory G-protein coupled receptor (the Designer Receptor) into a discrete brain region in the rodent. Three weeks later, when designer receptor expression levels are high, a pharmacological agent (the Designer Drug) is administered systemically 30 min prior to a specific behavioral session. The drug has affinity for the designer receptor and thus results in inhibition of neurons that express the designer receptor, but is otherwise biologically inert. The brain region remains silenced for 2-5 hr (depending on the dose and route of administration). Upon completion of the behavioral paradigm, brain tissue is assessed for correct placement and receptor expression. This approach is particularly useful for determining the contribution of individual brain regions to specific components of behavior and can be used across any number of behavioral paradigms.

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while rats are engaged in learning and memory tasks. The approach combines pharmacogenetics (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) with a behavioral paradigm (sensory preconditioning) that is designed to distinguish between different components of learning.

Ein Verfahren zum Fern Silencing neuronale Aktivität in Nagetiere Während diskreter Phasen des Lernens

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while animals are engaged in learning and ...

Verhalten

Transarterial Administration of Oncolytic Viruses for Locoregional Therapy of Orthotopic HCC in Rats

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis. In recent years, oncolytic virotherapies have proven themselves to be potentially powerful tools to fight malignancy. Due to the unique dual blood supply in the liver, it is possible to apply therapies locally to orthotopic liver tumors, which are predominantly fed by arterial blood flow. We have previously demonstrated that hepatic arterial delivery of oncolytic viruses results in safe and efficient transduction efficiency of multifocal HCC lesions, resulting in significant prolongation of survival in immune competent rats. This procedure closely mimics the application of transarterial embolization in patients, which is the standard palliative care provided to many HCC patients. The ability to administer tumor therapies through the hepatic artery in rats allows for a highly sophisticated preclinical model for evaluating novel viral vectors under development. Here we describe the detailed protocol for microdissection of the hepatic artery for infusion of oncolytic virus vectors to treat orthotopic HCC.

Oncolytic virotherapies are under development as novel therapeutics for the treatment of hepatocellular carcinoma (HCC). Here we describe a method for locoregional therapy of HCC via hepatic arterial administration of oncolytic virus.

Transarterial Verwaltung von onkolytischen Viren für lokoregionale von Orthotopische HCC bei Ratten

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis.  In recent years, oncolytic virotherapies have proven ...

Medizin

Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach

Transgenic animal models are fundamentally important for modern biomedical research. The incorporation of foreign genes into early mouse or rat embryos is an invaluable tool for gene function analysis in living organisms. The standard transgenesis method is based on microinjecting foreign DNA fragments into a pronucleus of a fertilized oocyte. This technique is widely used in mice but remains relatively inefficient and technically demanding in other animal species. The transgene can also be introduced into one-cell-stage embryos via lentiviral infection, providing an effective alternative to standard pronuclear injections, especially in species or strains with a more challenging embryo structure. In this approach, a suspension that contains lentiviral vectors is injected into the perivitelline space of a fertilized rat embryo, which is technically less demanding and has a higher success rate. Lentiviral vectors were shown to efficiently incorporate the transgene into the genome to determine the generation of stable transgenic lines. Despite some limitations (e.g., Biosafety Level 2 requirements, DNA fragment size limits), lentiviral transgenesis is a rapid and efficient transgenesis method. Additionally, using female rats that are mated with a fertile male strain with a different dominant fur color is presented as an alternative to generate pseudopregnant foster mothers.

This article aims to provide the methodology for lentiviral transgenesis in rat embryos using multiple injections of a virus suspension into the zygote perivitelline space. Female rats that are mated with a fertile male strain with a different dominant fur color is used to generate pseudopregnant foster mothers.

Generierung transgener Ratten mit einem Lentiviral Vector Ansatz

Transgenic animal models are fundamentally important for modern biomedical research. The incorporation of foreign genes into early mouse or rat embryos is ...

Biotechnik

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), optogenetics, cre-lox targeting, etc. The purpose of this manuscript is to aid the investigator attempting expansive central nervous system (CNS) gene transfer in the rat via tail vein injection of AAV. Wide-scale expression is relevant for conditions with widespread pathology, and a rat model is significant due to its greater size and physiologic similarities to humans compared to mice. In this example application, a wide-scale neuronal transduction is used to mimic a neurodegenerative disease that affects the entire spinal cord, amyotrophic lateral sclerosis (ALS). The efficient wide-scale CNS transduction can also be used to deliver therapeutic protein factors in pre-clinical studies. After a post-injection expression interval of several weeks, the effects of the transduction are evaluated. For a green fluorescent protein (GFP) control vector, the amount of GFP in the cerebellum is estimated quickly and reliably by a basic imaging program. For motor disease phenotypes that are induced by the ALS related protein transactive response DNA-binding protein of 43 kDa (TDP-43), the deficits are scored by escape reflex and rotarod. Beyond disease modeling and gene therapy, there are diverse potential applications for the wide-scale gene targeting described here. The expanded use of this method will aid in expediting hypothesis testing in the neurosciences and neurogenetics.

Methods for a wide-scale central nervous system gene delivery in the rat are covered. In this example, the purpose is to mimic a disease that affects the entire spinal cord. The widespread transduction can be used to deliver a therapeutic protein to the CNS from a one-time, peripheral administration.

Methoden und Tipps für die intravenöse Gabe von Adeno-assoziierten Virus an Ratten und Bewertung des zentralen Nervensystems Transduktion

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Neurowissenschaften

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. Establishment of the EcoHIV infected rat model for studies of drug abuse and neurocognitive disorders, would be beneficial in the study of neuroHIV and HIV-1 associated neurocognitive disorders (HAND). In the present study, we demonstrate the successful creation of a rat model of active HIV infection using chimeric HIV (EcoHIV). First, the lentiviral construct of EcoHIV was packaged in cultured 293 FT cells for 48 hours. Then, the conditional medium was concentrated and titered. Next, we performed bilateral stereotaxic injections of the EcoHIV-EGFP into F344/N rat brain tissue. One week after infection, EGFP fluorescence signals were detected in the infected brain tissue, indicating that EcoHIV successfully induces an active HIV infection in rats. In addition, immunostaining for the microglial cell marker, Iba1, was performed. The results indicated that microglia were the predominant cell type harboring EcoHIV. Furthermore, EcoHIV rats exhibited alterations in temporal processing, a potential underlying neurobehavioral mechanism of HAND as well as synaptic dysfunction eight weeks after infection. Collectively, the present study extends the EcoHIV model of HIV-1 infection to the rat offering a valuable biological system to study HIV-1 viral reservoirs in the brain as well as HAND and associated comorbidities such as drug abuse.

Here, we present a protocol to establish a new rat model of active HIV infection using chimeric HIV (EcoHIV), which is critical for enhancing our understanding of HIV-1 viral reservoirs in the brain and offering a system to study HIV-associated neurocognitive disorders and associated comorbidities (i.e., drug abuse).

Ein Rattenmodell der EcoHIV-Gehirninfektion

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Überwachung Endoplasmatischen Reticulum Calciumhomöostase Mit ein<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Biologie

Viral Transgene Expression in Rodent Hearts and the Assessment of Cardiac Arrhythmia Risk

Heart disease is the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Due to the ease of handling&#160;and abundance of transgenic strains, rodents have become essential models for cardiovascular research. However, spontaneous lethal cardiac arrhythmias that often cause mortality in heart disease patients are rare in rodent models of heart disease. This is primarily due to the species differences in cardiac electrical properties between human&#160;and rodents and poses a challenge to the study of cardiac arrhythmias using rodents. This protocol describes an approach to enable efficient transgene expression in mouse and rat ventricular myocardium using echocardiography-guided intramuscular injections of recombinant virus (adenovirus and adeno-associated virus). This work also outlines a method to enable reliable assessment of cardiac susceptibility to arrhythmias using isolated, Langendorff-perfused mouse and rat hearts with both adrenergic and programmed electrical stimulations. These techniques are critical for studying heart rhythm disorders associated with adverse cardiac remodeling after injuries, such as myocardial infarction.

The present protocol describes methods for transgene expression in rat and mouse hearts by direct intramyocardial injection of the virus under echocardiography guidance. Methods for the assessment of the susceptibility of hearts to ventricular arrhythmias by the programmed electrical stimulation of isolated, Langendorff-perfused hearts are also explained here.

Virale Transgenexpression in Nagetierherzen und die Bewertung des Risikos für Herzrhythmusstörungen

Heart disease is the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Due to the ease of handling&#160;and abundance of transgenic strains, rodents ...

Establishing an Active HIV Infection in a Rat Model

Source: Li, H., McLaurin, et al. <a href="https://app.jove.com/v/62137">A Rat Model of EcoHIV Brain Infection.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates the procedure of injecting chimeric HIV viruses into the cortex of a rat&#39;s brain, where the virus RNA integrates into the host genome, replicates, and spreads to establish an active HIV infection in the experimental model.

Etablierung einer aktiven HIV-Infektion im Rattenmodell

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neuropathology

Infectious Diseases

Targeting Liver Tumors with Oncolytic Viruses via the Hepatic Artery

Source: Altomonte, J. et al., <a href="https://app.jove.com/v/53757">Transarterial Administration of Oncolytic Viruses for Locoregional Therapy of Orthotopic HCC in Rats.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2016)
The video demonstrates locoregional delivery of oncolytic viruses through hepatic arterial injection as a therapeutic approach for hepatocellular carcinoma. These viruses selectively replicate in tumor cells, inducing cell lysis and releasing tumor cell-associated antigens. This process triggers immunogenic cell death, inducing an anti-tumor response.

Die Handhabung der Baumwolle Ratte in Studien für die präklinische Bewertung onkolytischer Viren

Zusammenfassung

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