Name: handling of the cotton rat in studies for the pre-clinical evaluation of oncolytic viruses
Uploaded: 2014-11-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
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Breanne Cuddington holds a fellowship from the Canadian Breast Cancer Foundation. This work was sponsored by operating grants from the Cancer Research Society and the Canadian Cancer Society Research Institute (formerly the Canadian Breast Cancer Research Alliance). We thank Ann Tollefson (Saint Louis University School of Medicine) for LCRT cells and Dr. Kathleen Delaney and Marion Corrick for technical assistance with cotton rat housing and sedation.

NOTA: Os protocolos utilizados foram aprovados pelo nosso Conselho de Ética de Pesquisa animal institucional da Universidade McMaster, de acordo com a Canadian Council on orientações de cuidados Animal. Os experimentos foram realizados nas instalações de McMaster University animal Central. 1. A cultura LCRT Cells <ol><li> Cultura de células LCRT em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina. Manter as células em frascos T-150 de cultura de tecidos a 37 ° C e 5% de CO 2. Células de passagem quando eles formam uma monocamada confluente a 90% (a cada 2-3 dias, a Figura 1). </li><li> 1x fosfato de pré-aquecer solução salina tamponada (PBS), 1x tripsina e meio num banho de água a 37 C ° durante 10 min antes da divisão das células. </li><li> Aspirar o meio do balão e lavar as células com 5 ml de PBS 1x. </li><li> Depois de enxaguar, aspirar PBS e incubaras células com 2 ml de 1x tripsina até células dissociar-se do frasco (~ 2 min). </li><li> Ressuspender as células em 8 ml de meio (para um total de suspensão de células 10 mL) e suavemente pipetar para cima e para baixo para quebrar aglomerados de células. </li><li> Manter as células em um frasco T-150 semeando 1 ml de suspensão de células para 24 ml de meio (para um total de 25 ml por T-150) e um balão de rocha suavemente de lado a lado. Manter as células a 37 ° C e 5% de CO 2 até separação seguinte. </li></ol> 2. Avaliação de replicação do vírus e citotoxicidade nas células LCRT <ol><li> Replicação do vírus NOTA: as construções de vírus que expressam um marcador fluorescente, tal como proteína fluorescente verde (GFP), sob o controlo de promotores virais endógenos facilitar a visualização da infecção pelo vírus e espalhado utilizando leitores de placas de fluorescência. <ol><li> Células LCRT semeado em placas de cultura, deixando um poço para contagem. Semear as células de modo a que eles vão ser de 80-90% de confluência no dia seguinte. Usar uma concentração de 10 5 cells / ml (100 ul por poço) para produzir o desejado confluência um dia mais tarde em placas de 96 poços de fundo plano. </li><li> No dia seguinte, pré-aquecer 1x PBS, 1x tripsina, meio completo e isento de soro em um banho de água a 37 C ° durante 10 min antes de se iniciar o experimento. </li><li> Aspirar o meio da contagem das células bem e lavar com 5 ml de PBS 1x por balançar-o sobre a superfície do poço. </li><li> Após lavagem, as células aspirado PBS e incubar com 2 ml de tripsina 1x até células dissociar-se do frasco (~ 2 min). </li><li> Ressuspender as células em um volume apropriado de meio completo para se obter uma densidade de células na gama contáveis ​​utilizando um hemocitómetro. Para garantir uma contagem de células preciso, misture bem a suspensão de células antes da inoculação do hemocitômetro por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Determinar o volume de caldo de vírus necessária para a infecção na desejada multiplicidade de infecção (MOI). Necessário Paque Unidades Formadoras (pfu) = número de células plaqueadas * MOI(Ufp / célula) Volume de estoque de vírus required = necessária UFP / virus estoque título (ufc / ml) </li><li> Prepare inoculo de vírus em meio isento de soro em tubos. Misture bem em vórtice ou pipeta antes de adicionar inóculo para as células. </li><li> Infectar as células durante 1 hora a 37 ° C, após o que se aplica uma sobreposição de manutenção de DMEM + FBS a 1%. </li><li> Placas de digitalização um e dois dias após a infecção (pi) para visualizar fluorescência da GFP. </li></ol></li><li> Virus Cytotoxicity NOTA: Realize o ensaio resazurina citotoxicidade sob condições de pouca luz como o composto é fotossensível. A forma das cavidades contendo só deve ser incluído para corrigir para a fluorescência de fundo. <ol><li> Prepara-se uma solução a 5% (v / v) de resazurina em PBS 1x. Misture a solução por pipetagem. </li><li> Aspirar o meio das células e aplicar a solução de 5% de resazurina. Incluir um médio bem contendo apenas para corrigir a fluorescência de fundo. </li><li> Incubar as células durante 30 min a 37 ° C, depoisque ler a fluorescência utilizando um leitor de placas de fluorescência (excitação 530 nm, emissão 595 nm). </li><li> Analisar dados em relação aos controles não infectados corrigindo para fluorescência de fundo. </li></ol></li></ol> 3. Habitação e Manuseio <ol><li> Habitação e Diet <ol><li> Ratos Casa de algodão individualmente para diminuir no combate em gaiolas de ratos de policarbonato contendo cama de roedores (1/8 &quot;cama sabugo de milho), uma seção de tubo de PVC não mais de 8 polegadas e nestlets como enriquecimento (Figura 2). </li><li> Use um cesto de aço securable para sentar overtop da gaiola e conter alimentos de roedores e uma garrafa de água. NOTA: Esta configuração permitirá gaiola para captura segura e fácil de os animais, com a colocação do tubo de enriquecimento contra a extremidade da gaiola ser da maior importância. </li></ol></li><li> Manipulação <ol><li> Lidar com ratos de algodão na parte da manhã, antes de rodadas por técnicos das instalações dos animais para evitar emocionante-los antesum procedimento. </li><li> Durante todos os procedimentos, usar luvas de couro grosso para proteção. </li><li> Como os animais permanecem principalmente nos tubos de enriquecimento, utilizá-los para transferir os ratos a uma nova gaiola durante a limpeza de rotina. Como alternativa, abrir a gaiola um pouco para permitir que o manipulador para chegar ao seu lado dentro, o animal pode ser contido por scruffing a pele um pouco acima dos ombros e empurrando para baixo. Cuidados prática para não usar força excessiva quando o animal pode morder a língua. </li><li> Seja paciente e use uma mão firme como os animais têm uma forte resposta de fuga ou luta e vai tentar evitar a captura por correr e saltar para fora da gaiola. É importante ressaltar que não lidar com os animais pelo rabo como degloving irá ocorrer. </li><li> Armadilha os animais em seus enriquecimentos câmaras de ar sobre manipulação directa. Isso diminui drasticamente os ferimentos e escapar. </li></ol></li></ol> 4. Capturar e Anestesia <ol><li> Captura <ol><li> Usar luvas de couro grosso para proteçãoião positivo durante todos os procedimentos. </li><li> Utilizar um grande recipiente de plástico transparente com furos para o ar e uma tampa, uma câmara de indução anestésica suficientemente grande para se encaixar no recipiente e um cone de nariz montado no tubo de saída de gás (Figura 3). </li><li> Trabalhar em pares para tornar o processo mais eficiente e para diminuir o tempo de exposição dos animais ao isoflurano, um anestésico por inalação. Certifique-se de um pesquisador é responsável pela abertura e recolocar a tampa de aço sobre a gaiola e a tampa da câmara de indução (manipulador # 1) e seu associado é responsável pela captura do animal no tubo e transporte para a câmara de indução (manipulador # 2). </li><li> Coloque a gaiola sobre uma superfície plana e remover a tampa exterior. Levantar o tabuleiro de alimentação de aço ligeiramente e manobrar-se lentamente o tubo de enriquecimento por isso é paralelo com os lados da caixa e contra as costas. Se necessário, utilizar um objecto para manobrar o tubo de enriquecimento sem abrir a gaiola para evitar que o animal se agita (manusearr # 1). </li><li> Se o animal torna-se agitado e deixa o tubo, dá tempo suficiente para que o animal relaxar e, mais uma vez se estabelecer no tubo (manipulador # 1). </li><li> Lentamente e deliberadamente levantar a aresta da tampa de aço do tubo de enriquecimento, mantendo a outra extremidade em contacto com a gaiola. Faça um espaço grande o suficiente para o recipiente de plástico (manipulador # 2). </li><li> Em um movimento rápido e suave, empurre o recipiente de plástico overtop do tubo de enriquecimento. Manter o recipiente de contacto com o lado da gaiola, prendendo o animal no tubo. Realize os passos 4.1.6 e 4.1.7, o mais rapidamente possível (manipulador # 2). </li><li> Retire a bandeja de alimentação de aço e dar a tampa do recipiente de plástico para manipulador # 2 (manipulador # 1). Deslize a tampa de plástico entre o lado da gaiola e do recipiente, sendo conscientes de apêndices do animal preso no processo. Não selar o recipiente, pois isso fará com que o próximo passo mais difícil (manipulador # 2). </li></ol></li><li> AnesthesIA <ol><li> Certifique-se o recipiente permanece fechado e transportar o animal à câmara de indução. Rapidamente colocar o animal na câmara e remover a tampa do recipiente com um movimento fluido (manipulador # 2). Abra e substitua imediatamente a tampa da câmara de indução (manipulador # 1). </li><li> Ligue o fluxo de isoflurano para a câmara de indução (5 L / min) e monitorizar o animal quanto a sinais de letargia, altura em que deslizam rapidamente o animal a partir do tubo e o recipiente, tanto a remoção da câmara de indução para facilitar a circulação do gás. </li><li> Quando o rato é completamente anestesiados, movê-la para a superfície de trabalho e colocar o nariz e boca para o cone de nariz (Figura 3). O rato é totalmente anestesiado quando ele não responde a uma pitada toe forte. </li><li> Coloque vet vaselina pomada oftálmica nos olhos do animal para evitar a secura e escoriações. Este é um passo essencial como ratos do algodão têm olhos grandes que podem ser propenso a infecção se ocorrer lesão. </li> &lt;li&gt; monitorizar cuidadosamente e manter uma taxa de respiração constante e garantir que o nariz do animal permanece no cone do nariz ao longo do procedimento de montagem. Ajustar o caudal de isoflurano apropriadamente. A quantidade de isoflurano necessária para anestesiar cada animal irá variar. </li><li> Pós-procedimento, devolver o animal para sua gaiola e garantir que ele recupere a mobilidade total e decúbito esternal. </li></ol></li></ol> 5. Preparação de Células LCRT para a Formação de Tumores subcutânea NOTA: Um balão T-150 de LCRT (90% de confluência) rende aproximadamente 2 x 10 7 células. Baseie o número de T-150 frascos necessários sobre o número total de células necessárias. Semente frascos adicionais para assegurar o número total de células necessárias é obtido e para acomodar células perdidas durante a preparação e os necessários para injecções extras. Mantenha as células no gelo sempre que possível para prolongar a viabilidade celular. <ol><li> Para colher as células, o meio aspirado a partir de um frascod células Lavar com 5 ml de 1x PBS. </li><li> Aspirar PBS e incubar as células com 2 ml de 1x tripsina até que as células dissociar-se do frasco (~ 2 min). </li><li> Ressuspender as células em 8 ml de meio (para um total de suspensão de células 10 mL) e suavemente pipetar para cima e para baixo para quebrar aglomerados de células. Continuar a colheita de células de frascos adicionais. </li><li> Piscina todos suspensões de células em um tubo cônico, cerca de 4 T-150s por tubo de 50 ml. </li><li> Centrifugar o tubo a 160 x g durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar o meio e ressuspender o sedimento de células no volume apropriado de PBS (10 ml de PBS por T-150) para se obter uma densidade de células na gama contáveis ​​utilizando um hemocitómetro. Para garantir uma contagem de células preciso, misture bem a suspensão de células antes de carregar o hemocitômetro por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Calcula-se o número total de células: Número total de células colhidas = contagem de células (células / ml) x volume de ressuspensão (ml) </li><li> Determinaro volume de suspensão de células necessário para todas as injecções. Faça 2-3 doses extras por experimento. Um total de 5 x 10 5 células LCRT injectados subcutaneamente irá formar tumores palpáveis ​​dentro de 3-4 dias. Número total de células necessárias = 5 x 10 x 5 células número total de doses Suspensão de células volume requerido (ml) = (número total de células necessárias * soma dos volumes de injecção) / (número total de células colhidas) </li><li> Pipete o volume pretendido de suspensão de células para um tubo cónico contendo PBS e homogeneizar. Alíquotas individuais injecções (100 ul) em tubos Eppendorf. Manter tubos em gelo durante o procedimento de injeção. </li></ol> 6. Injeções Observação: executar procedimentos com dois pesquisadores, um para executar as injeções, enquanto os outros monitores taxa de respiração do animal e condição geral e sob anestesia. Use seringas de insulina (29 G x 1/2 &#39;, 0,3 ml) para todas as injeções e uma nova agulha paracada animal. <ol><li> As injecções subcutâneas <ol><li> Capturar e anestesiar o animal (secção 4). </li><li> Raspar o local da injecção usando cortadores. Pele de rato Cotton é grosso e requer um aparador afiada para obter uma superfície lisa para injectáveis. Limpar o local de injecção com etanol a 70% usando um cotonete de algodão e permitir que ela se evapore completamente antes de prosseguir. </li><li> Seringas de carga (29 G x 1/2 &#39;, 0,3 ml) com as células por elaboração lenta e progressivamente. Se as bolhas são súbito evidente a seringa com um pouco de força. Uma vez que as bolhas estão no topo do êmbolo de pressão até que o líquido está no topo da agulha. </li><li> Levantar a pele no local da injecção (referido como pele de acampamento) e inserir a agulha de bisel virado para cima. Certifique-se de que a agulha se move livremente sob a pele para evitar a injeção intramuscular. </li><li> Expelir o conteúdo da seringa lentamente e uniformemente. Retirar lado bisel da agulha para baixo. </li></ol></li><li> Injeções intratumoral <ol><li> Captura de umd anestesiar o animal (secção 4). </li><li> Limpar o local de injecção com etanol a 70% usando um cotonete de algodão e permitir que ela se evapore completamente antes de prosseguir. </li><li> Seringas de carga (29 G x 1/2 &#39;, 0,3 ml) com o inóculo do vírus através da elaboração lenta e progressivamente, mantendo a agulha na posição vertical. Se as bolhas são súbito evidente a seringa com um pouco de força. Uma vez que as bolhas estão no topo, em seguida, premir o êmbolo até que o líquido está no topo da agulha. </li><li> Inserir a agulha lado bisel para cima para dentro do tumor e expelir o conteúdo da seringa de maneira uniforme e lentamente, enquanto move a agulha num padrão de tipo ventilador, retirar parcialmente a agulha antes de cada movimento para evitar laceração do tumor. Retirar lado bisel da agulha para baixo. NOTA: Os tumores LCRT subcutâneas são, atingindo aproximadamente 100 mm3 em 5-7 dias de rápido crescimento. Para além disso, centros necróticos e hemorrágicos frequentemente se formam na superfície do tumor no prazo de vários dias e requerem cAmonitorização REFUL (Figura 4). </li></ol></li><li> As injecções intraperitoneais <ol><li> Capturar e anestesiar o animal (secção 4). </li><li> Limpe o local da injecção com 70% de etanol usando cotonetes e deixe-o evaporar completamente antes de prosseguir. </li><li> Seringas de carga (29 G x 1/2 &#39;, 0,3 ml) com a droga através da elaboração lenta e progressivamente. Se as bolhas são súbito evidente a seringa com um pouco de força. Uma vez que as bolhas estão no topo, em seguida, premir o êmbolo até que o líquido está no topo da agulha. </li><li> Insira a agulha no quadrante inferior direito do abdômen. Puxe o êmbolo para garantir que o sangue ou fezes não são aspirados, isso indica a colocação incorreta da agulha. Se isso ocorrer, retire a agulha e preparar uma nova seringa. Quando a agulha é colocada corretamente, expulsar conteúdo da seringa de forma uniforme e lentamente. </li></ol></li></ol> 7. Tumor Excisão e Necropsia <ol><li> Reunir e limpar alferramentas l com etanol 70% antes da eutanásia do animal. </li><li> Eutanásia o animal pelo método desejado, inalação de CO 2 (2 L / min, durante 5-10 min) é recomendado. Examine o animal para qualquer anormalidade na condição. </li><li> Colocar o animal em decúbito dorsal numa prancha de dissecação e limpar o animal com etanol a 70%. </li><li> Use uma pinça para levantar a pele na parte inferior do abdômen. Cortar através da pele e do músculo utilizando tesouras e fazer uma incisão média a todo o comprimento do animal (ânus para o queixo). </li><li> Cortar a caixa torácica, fazendo dois cortes, uma lateralmente para cima o lado da caixa torácica e um em frente ao esterno para expor o coração e os pulmões. Examine os lobos do pulmão por quaisquer metástases 27,29. </li><li> Examine todos os órgãos de anormalidades e registrar quaisquer mudanças na cor, tamanho e consistência. Se necessário, os órgãos incisão com um bisturi para examinar os tecidos internos. Especificamente, examinar o fígado, rins, baço e do trato gastrointestinal. </li><li> Inspecione os linfonodos para metástases e alargamento 27,29. </li><li> Para recolher o tumor, fazer incisões flanco acima e abaixo do tumor de tal modo que a pele pode ser puxada para fora do corpo, com uma pinça. Enquanto segura firmemente a pele com pinças, usar um bisturi para remover cuidadosamente o tumor por corte entre o tumor e derme (Figura 5). </li><li> Colocar imediatamente o tumor em um recipiente rotulado de 10% de formalina tamponada neutra. </li><li> Dependendo do tamanho do tumor, permitir 1-2 dias (≤ 2 mm, pequenos) ou 5-6 dias (&gt; 2 mm, grande) para a fixação, antes de se prepararem secções para análise histológica (Figura 6). </li></ol>

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	<li>Cervantes-Garcia, D., Ortiz-Lopez, R., Mayek-Perez, N., Rojas-Martinez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+virotherapy.">Oncolytic virotherapy.</a> Ann Hepatol. 7 (1), 34-45 (2008).</li><li>Vaha-Koskela, M. J., Heikkila, J. E., Hinkkanen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+viruses+in+cancer+therapy.">Oncolytic viruses in cancer therapy.</a> Cancer Lett. 254 (2), 178-216 (2007).</li><li>Abril, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+viral+and+host+factors+contribute+to+neurovirulence+of+bovine+herpesviruses+1+and+5+in+interferon+receptor-deficient+mice.">Both viral and host factors contribute to neurovirulence of bovine herpesviruses 1 and 5 in interferon receptor-deficient mice.</a> J Virol. 78 (7), 3644-3653 (2004).</li><li>Nakamichi, K., Matsumoto, Y., Otsuka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+infection+of+bovine+herpesvirus+1+in+non-permissive+murine+cells.">Defective infection of bovine herpesvirus 1 in non-permissive murine cells.</a> J Vet Med Sci. 63 (10), 1139-1142 (2001).</li><li>Boukhvalova, M. S., Blanco, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cotton+rat+sigmodon+hispidus+model+of+respiratory+syncytial+virus+infection.">The cotton rat sigmodon hispidus model of respiratory syncytial virus infection.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 372, 347-358 (2013).</li><li>Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+immunity+in+the+respiratory+tract+and+protection+from+bovine+herpesvirus+type+1+infection+by+different+routes+of+immunization+with+recombinant+adenovirus.">Induction of immunity in the respiratory tract and protection from bovine herpesvirus type 1 infection by different routes of immunization with recombinant adenovirus.</a> Viral Immunol. 11 (2), 79-91 (1998).</li><li>Hughes, T. C. R., Lilley, C. E., Ponce, R., Kaufman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+analysis+of+an+oncolytic+herpesvirus+encoding+granulocyte-macrophage+colony+stimulating+factor+for+the+treatment+of+malignant+melanoma.">Critical analysis of an oncolytic herpesvirus encoding granulocyte-macrophage colony stimulating factor for the treatment of malignant melanoma.</a> Journal of Oncolytic Virotherapy. 3, 11-20 (2014).</li><li>Jones, C., Chowdhury, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+biology+of+bovine+herpesvirus+type+1+(BHV-1),+its+role+as+a+cofactor+in+the+bovine+respiratory+disease+complex+and+development+of+improved+vaccines.">A review of the biology of bovine herpesvirus type 1 (BHV-1), its role as a cofactor in the bovine respiratory disease complex and development of improved vaccines.</a> Anim Health Res Rev. 8 (2), 187-205 (2007).</li><li>Jones, C., Chowdhury, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+herpesvirus+type+1+(BHV-1)+is+an+important+cofactor+in+the+bovine+respiratory+disease+complex.">Bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) is an important cofactor in the bovine respiratory disease complex.</a> Vet Clin North Am Food Anim Pract. 26 (2), 303-321 (2010).</li><li>Hushur, O., Takashima, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+bovine+herpesvirus+1+(BHV-1)+growth+in+non-permissive+cells+beyond+the+expression+of+immediate+early+genes.">Restriction of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) growth in non-permissive cells beyond the expression of immediate early genes.</a> J Vet Med Sci. 66 (4), 453-455 (2004).</li><li>Cuddington, B. P., Dyer, A. L., Workenhe, S. T., Mossman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+bovine+herpesvirus+type+1+infects+and+kills+breast+tumor+cells+and+breast+cancer-initiating+cells+irrespective+of+tumor+subtype.">Oncolytic bovine herpesvirus type 1 infects and kills breast tumor cells and breast cancer-initiating cells irrespective of tumor subtype.</a> Cancer Gene Ther. 20 (5), 282-289 (2013).</li><li>Cuddington, B. P., Mossman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permissiveness+of+Human+Cancer+Cells+to+Oncolytic+Bovine+Herpesvirus+1+Is+Mediated+in+Part+by+KRAS+Activity.">Permissiveness of Human Cancer Cells to Oncolytic Bovine Herpesvirus 1 Is Mediated in Part by KRAS Activity.</a> J Virol. 88 (12), 6885-6895 (2014).</li><li>Small, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+intravenous+CG7870,+a+replication-selective,+prostate-specific+antigen-targeted+oncolytic+adenovirus,+for+the+treatment+of+hormone-refractory,+metastatic+prostate+cancer.">A phase I trial of intravenous CG7870, a replication-selective, prostate-specific antigen-targeted oncolytic adenovirus, for the treatment of hormone-refractory, metastatic prostate cancer.</a> Mol Ther. 14 (1), 107-117 (2006).</li><li>Freytag, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+study+of+replication-competent+adenovirus-mediated+double+suicide+gene+therapy+for+the+treatment+of+locally+recurrent+prostate+cancer.">Phase I study of replication-competent adenovirus-mediated double suicide gene therapy for the treatment of locally recurrent prostate cancer.</a> Cancer Res. 62 (17), 4968-4976 (2002).</li><li>Benjamin, R., Helman, L., Meyers, P., Reaman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I/II+dose+escalation+and+activity+study+of+intravenous+injections+of+OCaP1+for+subjects+with+refractory+osteosarcoma+metastatic+to+lung.">A phase I/II dose escalation and activity study of intravenous injections of OCaP1 for subjects with refractory osteosarcoma metastatic to lung.</a> Hum Gene Ther. 12 (12), 1591-1593 (2001).</li><li>Prince, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cotton+Rat+in+Biomedical+Research.">The Cotton Rat in Biomedical Research.</a> Animal Welfare Information Center Newsletter. 5 (2), 3-5 (1994).</li><li>Tsai, J. C., Garlinghouse, G., McDonnell, P. J., Trousdale, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+animal+model+of+adenovirus-induced+ocular+disease.+The+cotton+rat.">An experimental animal model of adenovirus-induced ocular disease. The cotton rat.</a> Arch Ophthalmol. 110 (8), 1167-1170 (1992).</li><li>Ginsberg, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+investigating+the+molecular+pathogenesis+of+adenovirus+pneumonia.">A mouse model for investigating the molecular pathogenesis of adenovirus pneumonia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (5), 1651-1655 (1991).</li><li>Russell, S. J., Peng, K. W., Bell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+virotherapy.">Oncolytic virotherapy.</a> Nat Biotechnol. 30 (7), 658-670 (2012).</li><li>Mossman, K. L., Saffran, H. A., Smiley, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+ICP0+mutants+are+hypersensitive+to+interferon.">Herpes simplex virus ICP0 mutants are hypersensitive to interferon.</a> J Virol. 74 (4), 2052-2056 (2000).</li><li>Mossman, K. L., Smiley, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+ICP0+and+ICP34.5+counteract+distinct+interferon-induced+barriers+to+virus+replication.">Herpes simplex virus ICP0 and ICP34.5 counteract distinct interferon-induced barriers to virus replication.</a> J Virol. 76 (4), 1995-1998 (2002).</li><li>Hummel, J. L., Safroneeva, E., Mossman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ICP0-Null+HSV-1+and+interferon+signaling+defects+in+the+effective+treatment+of+breast+adenocarcinoma.">The role of ICP0-Null HSV-1 and interferon signaling defects in the effective treatment of breast adenocarcinoma.</a> Mol Ther. 12 (6), 1101-1110 (2005).</li><li>Papp, Z., Middleton, D. M., Mittal, S. K., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunization+with+recombinant+adenoviruses:+induction+of+immunity+and+protection+of+cotton+rats+against+respiratory+bovine+herpesvirus+type+1+infection.">Mucosal immunization with recombinant adenoviruses: induction of immunity and protection of cotton rats against respiratory bovine herpesvirus type 1 infection.</a> J Gen Virol. 78 (11), 2933-2943 (1997).</li><li>Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+pre-existing+adenovirus-specific+immunity+on+immune+responses+induced+by+recombinant+adenovirus+expressing+glycoprotein+D+of+bovine+herpesvirus+type+1.">The effect of pre-existing adenovirus-specific immunity on immune responses induced by recombinant adenovirus expressing glycoprotein D of bovine herpesvirus type 1.</a> Vaccine. 17 (7-8), 933-943 (1999).</li><li>Mittal, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+systemic+and+mucosal+immune+responses+in+cotton+rats+immunized+with+human+adenovirus+type+5+recombinants+expressing+the+full+and+truncated+forms+of+bovine+herpesvirus+type+1+glycoprotein+gD.">Induction of systemic and mucosal immune responses in cotton rats immunized with human adenovirus type 5 recombinants expressing the full and truncated forms of bovine herpesvirus type 1 glycoprotein gD.</a> Virology. 222 (2), 299-309 (1996).</li><li>Steel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syngeneic+Cotton+Rat+Cancer+Model+for+Replicating+Adenoviral+Vectors.">Syngeneic Cotton Rat Cancer Model for Replicating Adenoviral Vectors.</a> Molecular Therapy. 13 (1), 123 (2006).</li><li>Toth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+rat+tumor+model+for+the+evaluation+of+oncolytic+adenoviruses.">Cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses.</a> Hum Gene Ther. 16 (1), 139-146 (2005).</li><li>Toth, K., Spencer, J. F., Wold, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocompetent,+semi-permissive+cotton+rat+tumor+model+for+the+evaluation+of+oncolytic+adenoviruses.">Immunocompetent, semi-permissive cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses.</a> Methods Mol Med. 130, 157-168 (2007).</li><li>Steel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocompetent+syngeneic+cotton+rat+tumor+models+for+the+assessment+of+replication-competent+oncolytic+adenovirus.">Immunocompetent syngeneic cotton rat tumor models for the assessment of replication-competent oncolytic adenovirus.</a> Virology. 369 (1), 131-142 (2007).</li><li>Workenhe, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenic+HSV-mediated+oncolysis+shapes+the+antitumor+immune+response+and+contributes+to+therapeutic+efficacy.">Immunogenic HSV-mediated oncolysis shapes the antitumor immune response and contributes to therapeutic efficacy.</a> Mol Ther. 22 (1), 123-131 (2014).</li><li>Sobol, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+antiviral+immunity+is+a+determinant+of+the+therapeutic+success+of+oncolytic+virotherapy.">Adaptive antiviral immunity is a determinant of the therapeutic success of oncolytic virotherapy.</a> Mol Ther. 19 (2), 335-344 (2011).</li><li>Prince, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cotton+Rat+in+Biomedical+Research.">The Cotton Rat in Biomedical Research.</a> Animal Welfare Information Center Newsletter. 5 (2), (1994).</li></ol>

The authors acknowledge there are no financial conflicts of interest related to this research.

Cotton rats are highly excitable and have a strong flight response. Therefore, special care should be taken to minimize any undue stress on the animal. The cage setup described will allow for safe and easy capture of the animals, with the placement of the enrichment tube being of the utmost importance. When setting up cages, ensure that the enrichment tubes meet the size and shape requirements, and are placed in proper orientation in the cage. It is also important to ensure that any technicians who might be aiding in ani...

Vírus Oncolíticos (OV) replicar selectivamente em células tumorais, explorando as diferenças bioquímicas entre células normais e tumorais 1,2. Existem dois tipos de VOs: aqueles que não necessitam de uma mutação para alcançar oncólise selectiva, referido como ocorrendo naturalmente vírus do tipo selvagem e as que devem ser modificadas para alcançar oncólise selectiva. A recolha de mutações dentro de um determinado tipo de tumor que determina a natureza da vantagem de crescimento selectivo sobre as células normais de um OV 2. A segurança e benefício de utilizar VOs foi demonstrada em ensaios clínicos 3-7. Apesar dos avanços no campo da virotherapy oncolytic existem lacunas entre os resultados pré-clínicos e clínicos, o que sugere que os melhores modelos são necessários para avaliar a eficácia antitumoral de VOs. Herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1) é um membro da família Herpesviridae, e Alphaherpesviridae subfamília. BHV-1 initiates bovina complexo de doença respiratória em bovinos, manifestando-se em uma ampla variedade de sintomas semelhante a um resfriado 8,9. BHV-1 liga-se receptores de ligação de entrada e utilizados pelo HSV-1, tais como o sulfato de heparano e Nectin-1 10. No entanto, se liga CD155 no lugar de Nectin-2 10. BHV-1 tem uma gama de hospedeiros muito estreito de tal modo que ele não é capaz de entrar e iniciar a replicação em células de murinos normais e transformadas 3,4,10 eficientemente. Isso faz com que a utilização de modelos murinos convencionais problemático. A capacidade oncolitica do BHV-1 tem sido demonstrada in vitro 11,12. BHV-1 tem sido mostrado para iniciar a replicação e matar células de tumor humano a partir de uma variedade de origens histológicos, incluindo células de cancro da mama e cancro da mama iniciar células 11,12. No entanto, a capacidade antitumoral do BHV-1 deve ser avaliada in vivo no contexto de um hospedeiro imunocompetente. Adenovirus humano (Ad), para os quaishá 57 sorotipos identificados, mais comumente causa doenças respiratórias em humanos. Vectores Ad Oncolíticos foram avaliados quanto à sua eficácia antitumoral com vários avançar para ensaios clínicos 13-15. Apesar dos dados pré-clínicos promissores, os resultados clínicos têm ficado aquém das expectativas. Modelos de xenoenxerto de tumor humano são tipicamente usadas para estudar a eficácia antitumoral de vectores Ad, embora eles exibem atenua as respostas imunes ao vírus 16,17. Além disso, os modelos de murino singeneicas são não-permissiva para infecção ad, tornando a avaliação de respostas imunitárias do hospedeiro, utilizando estes modelos impraticáveis ​​17,18. O sistema imunitário do hospedeiro tem sido identificada como o mecanismo pelo qual mais influente VOs provocar a morte das células tumorais 19. Respostas antitumorais entre tornados tolerantes e antigénio associado a um tumor não tornados tolerantes modelos (TAA) diferem entre si e podem ter grande impacto no sucesso da terapia OV. O HSV-1 OV KM100 (ICP0 N212VP16 em 1814 20) 20,21 provocou regressão do tumor em 80% dos murganhos portadores de tumor em um modelo de cancro mamário antigénio Polioma Médio T murinas 22. No entanto, em HER-2 modelos / neu, a eficácia antitumoral do KM100 variou entre 20% a regressão completa em camundongos singï¿½icos e estase tumor em transgênico, os ratos HER2-tolerantes. Juntos, esses dados destacam a importância de se avaliar plenamente VOs utilizando modelos animais que melhor recapitulam a paisagem imunológico humano para entender completamente o que caracteriza determinar o sucesso terapêutico. O rato de algodão (Sigmodon hispidus), indígena do Norte e América do Sul, é mais comumente usado como um modelo de infecção pelo vírus sincicial respiratório (como revistas em 5). Ratos do algodão, também são utilizados em-BHV-1 anti pesquisa de vacinação uma vez que recapitulam a patologia associada à doença respiratória bovina complexo 6,23. Além disso, o BHV-1 infecção de ratazanas do algodãoé imunogénica, induzindo mucosa sustentada e respostas imunitárias sistémicas 6,23-25. As linhas de células foram derivadas de fibrossarcoma espontânea e osteosarcomas da glândula mamária (LCRT) e osso (CCRT e VCRT), respectivamente 26. Ratos de algodão têm sido usados ​​para avaliar a eficácia in vivo de vectores Ad oncolíticos como eles são susceptíveis à infecção por Ad e exibem uma patologia semelhante à dos humanos 27-29. A utilização de modelos imunocomprometidos para a avaliação pré-clínica de VOs não são apenas menos indicativo de respostas clínicas para a terapia, mas eles não conseguem ter em conta o papel do sistema imunológico no viroterapia oncolítico 30,31. Portanto, o singeneicos e modelos de ratos tornados tolerantes algodão-tumorais de carcinoma da mama e osteossarcoma são modelos relevantes em que para avaliar a eficácia pré-clínica de VOs, tais como o BHV-1 e Ad que não pode ser estudado usando modelos murinos convencionais.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>May use any brand&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1X Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Can prepare in lab, filter to sterilize</td></tr><tr><td>200 mM L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>100x Antibiotic-Antimycotic&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Quality Biological Inc.</td><td>110-001-101HI</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>T-150cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; tissue culture flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-80</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>1X TypLE Express</td><td>Life Technologies</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>12-well cell culture plate, flat bottom</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td>May use any brand, must be tissue culture treated</td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>Life Technologies</td><td>DAL1025</td><td>May use an alternative reagent for determination of cell viability</td></tr><tr><td>8640 Teklad 22/5 Rodent diet</td><td>Harlan&amp;nbsp;</td><td>8640</td><td></td></tr><tr><td>1/8&amp;rdquo; corncob rodent bedding</td><td>Harlan</td><td>7092</td><td></td></tr><tr><td>Nestlets</td><td>Ancare</td><td>-</td><td>Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable</td></tr><tr><td>50 mL Conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>May use any brand, must be sterile</td></tr><tr><td>Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td>M60302</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td>Can prepare in lab</td></tr><tr><td>10 % Neutral Buffered Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood)</td><td>NAPCO</td><td>Model used not currently available</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>Model used not currently available&amp;nbsp;</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Reichert Bright-line Hemacytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>Typhoon Trio BioAnalyzer&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Model used not currently available&amp;nbsp;</td><td>May use any fluorescence plate reader</td></tr><tr><td>Tecan Safire&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Multi-detection Microplate Reader</td><td>Tecan</td><td>Model used not currently available&amp;nbsp;</td><td>May use any fluorescence plate reader</td></tr><tr><td>Allegra 6R benchtop centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>Table Top Anaesthesia machine</td><td>VetEquip</td><td>Model used not currently available&amp;nbsp;</td><td>May use any brand, must be portable</td></tr><tr><td>Wahl Peanut Mini Clippers</td><td>Wahl</td><td></td><td>May use any brand of small clippers</td></tr><tr><td>Insulin syringes 29 G x 1/2&#039;, 0.3 mL</td><td>BD</td><td>329464</td><td>May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat&amp;rsquo;s tough skin.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cotton swabs</td><td>MedPro</td><td>018-425</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>Sharp-Pointed Dissecting Scissors</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>Dissecting Tissue Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-41</td><td>May use any brand</td></tr></tbody></table>

handling of the cotton rat in studies for the pre-clinical evaluation of oncolytic viruses

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Devido à natureza extremamente excitável de ratos do algodão, sendo familiarizados com e utilizando processos optimizados para reduzir a tensão dos animais vai facilitar a sua utilização como um modelo animal de pré-clínico. O uso de técnicas de manejo adequadas também vai minimizar os riscos para o pesquisador. Ao usar ratos do algodão é imperativo para manter a calma. Os ratos são altamente excitáveis ​​e tentará escapar de sua gaiola. A utilização de um tubo de enriqu...

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Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

Manuseio do Rato Cotton em Estudos para a avaliação pré-clínica de Vírus Oncolíticos

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

9.3K visualizações.  McMaster University. Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model. 

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Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus replication. Here we present the application of this technology to uncovering host targets that specifically modulate the replication of Maraba virus, an oncolytic rhabdovirus, and vaccinia virus with the goal of enhancing therapy. While the protocol has been tested for use with oncolytic Maraba virus and oncolytic vaccinia virus, this approach is applicable to other oncolytic viruses and can also be utilized for identifying host targets that modulate virus replication in mammalian cells in general. This protocol describes the development and validation of an assay for high-throughput RNAi screening in mammalian cells, the key considerations and preparation steps important for conducting a primary high-throughput RNAi screen, and a step-by-step guide for conducting a primary high-throughput RNAi screen; in addition, it broadly outlines the methods for conducting secondary screen validation and tertiary validation studies. The benefit of high-throughput RNAi screening is that it allows one to catalogue, in an extensive and unbiased fashion, host factors that modulate any aspect of virus replication for which one can develop an in vitro assay such as infectivity, burst size, and cytotoxicity. It has the power to uncover biotherapeutic targets unforeseen based on current knowledge.

Here we describe a protocol for employing high-throughput RNAi screening to uncover host targets that can be manipulated to enhance oncolytic virus therapy, specifically rhabodvirus and vaccinia virus therapy, but it can be readily adapted to other oncolytic virus platforms or for discovering host genes that modulate virus replication generally.

Rastreio de RNAi todo o genoma para identificar fatores do hospedeiro que modulam o vírus Oncolíticos terapia

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Pesquisa do câncer

A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while animals are engaged in learning and memory tasks. The approach combines pharmacogenetics (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) with a behavioral paradigm (sensory preconditioning) that is designed to distinguish between different forms of learning. Specifically, viral-mediated delivery is used to express a genetically modified inhibitory G-protein coupled receptor (the Designer Receptor) into a discrete brain region in the rodent. Three weeks later, when designer receptor expression levels are high, a pharmacological agent (the Designer Drug) is administered systemically 30 min prior to a specific behavioral session. The drug has affinity for the designer receptor and thus results in inhibition of neurons that express the designer receptor, but is otherwise biologically inert. The brain region remains silenced for 2-5 hr (depending on the dose and route of administration). Upon completion of the behavioral paradigm, brain tissue is assessed for correct placement and receptor expression. This approach is particularly useful for determining the contribution of individual brain regions to specific components of behavior and can be used across any number of behavioral paradigms.

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while rats are engaged in learning and memory tasks. The approach combines pharmacogenetics (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) with a behavioral paradigm (sensory preconditioning) that is designed to distinguish between different components of learning.

Um método para a atividade neural remotamente Silenciando em Roedores Durante fases distintas de Aprendizagem

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while animals are engaged in learning and ...

Comportamento

Transarterial Administration of Oncolytic Viruses for Locoregional Therapy of Orthotopic HCC in Rats

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis. In recent years, oncolytic virotherapies have proven themselves to be potentially powerful tools to fight malignancy. Due to the unique dual blood supply in the liver, it is possible to apply therapies locally to orthotopic liver tumors, which are predominantly fed by arterial blood flow. We have previously demonstrated that hepatic arterial delivery of oncolytic viruses results in safe and efficient transduction efficiency of multifocal HCC lesions, resulting in significant prolongation of survival in immune competent rats. This procedure closely mimics the application of transarterial embolization in patients, which is the standard palliative care provided to many HCC patients. The ability to administer tumor therapies through the hepatic artery in rats allows for a highly sophisticated preclinical model for evaluating novel viral vectors under development. Here we describe the detailed protocol for microdissection of the hepatic artery for infusion of oncolytic virus vectors to treat orthotopic HCC.

Oncolytic virotherapies are under development as novel therapeutics for the treatment of hepatocellular carcinoma (HCC). Here we describe a method for locoregional therapy of HCC via hepatic arterial administration of oncolytic virus.

Transarterial Administração de Oncolíticos Vírus para loco-regional Terapia de Ortotópico HCC em Ratos

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis.  In recent years, oncolytic virotherapies have proven ...

Medicina

Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach

Transgenic animal models are fundamentally important for modern biomedical research. The incorporation of foreign genes into early mouse or rat embryos is an invaluable tool for gene function analysis in living organisms. The standard transgenesis method is based on microinjecting foreign DNA fragments into a pronucleus of a fertilized oocyte. This technique is widely used in mice but remains relatively inefficient and technically demanding in other animal species. The transgene can also be introduced into one-cell-stage embryos via lentiviral infection, providing an effective alternative to standard pronuclear injections, especially in species or strains with a more challenging embryo structure. In this approach, a suspension that contains lentiviral vectors is injected into the perivitelline space of a fertilized rat embryo, which is technically less demanding and has a higher success rate. Lentiviral vectors were shown to efficiently incorporate the transgene into the genome to determine the generation of stable transgenic lines. Despite some limitations (e.g., Biosafety Level 2 requirements, DNA fragment size limits), lentiviral transgenesis is a rapid and efficient transgenesis method. Additionally, using female rats that are mated with a fertile male strain with a different dominant fur color is presented as an alternative to generate pseudopregnant foster mothers.

This article aims to provide the methodology for lentiviral transgenesis in rat embryos using multiple injections of a virus suspension into the zygote perivitelline space. Female rats that are mated with a fertile male strain with a different dominant fur color is used to generate pseudopregnant foster mothers.

Geração de ratos transgênicos usando uma abordagem vetorial lentiviral

Transgenic animal models are fundamentally important for modern biomedical research. The incorporation of foreign genes into early mouse or rat embryos is ...

Bioengenharia

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), optogenetics, cre-lox targeting, etc. The purpose of this manuscript is to aid the investigator attempting expansive central nervous system (CNS) gene transfer in the rat via tail vein injection of AAV. Wide-scale expression is relevant for conditions with widespread pathology, and a rat model is significant due to its greater size and physiologic similarities to humans compared to mice. In this example application, a wide-scale neuronal transduction is used to mimic a neurodegenerative disease that affects the entire spinal cord, amyotrophic lateral sclerosis (ALS). The efficient wide-scale CNS transduction can also be used to deliver therapeutic protein factors in pre-clinical studies. After a post-injection expression interval of several weeks, the effects of the transduction are evaluated. For a green fluorescent protein (GFP) control vector, the amount of GFP in the cerebellum is estimated quickly and reliably by a basic imaging program. For motor disease phenotypes that are induced by the ALS related protein transactive response DNA-binding protein of 43 kDa (TDP-43), the deficits are scored by escape reflex and rotarod. Beyond disease modeling and gene therapy, there are diverse potential applications for the wide-scale gene targeting described here. The expanded use of this method will aid in expediting hypothesis testing in the neurosciences and neurogenetics.

Methods for a wide-scale central nervous system gene delivery in the rat are covered. In this example, the purpose is to mimic a disease that affects the entire spinal cord. The widespread transduction can be used to deliver a therapeutic protein to the CNS from a one-time, peripheral administration.

Métodos e dicas para administração intravenosa de vírus Adeno-associado aos ratos e avaliação do sistema nervoso Central transdução

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Neurociência

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. Establishment of the EcoHIV infected rat model for studies of drug abuse and neurocognitive disorders, would be beneficial in the study of neuroHIV and HIV-1 associated neurocognitive disorders (HAND). In the present study, we demonstrate the successful creation of a rat model of active HIV infection using chimeric HIV (EcoHIV). First, the lentiviral construct of EcoHIV was packaged in cultured 293 FT cells for 48 hours. Then, the conditional medium was concentrated and titered. Next, we performed bilateral stereotaxic injections of the EcoHIV-EGFP into F344/N rat brain tissue. One week after infection, EGFP fluorescence signals were detected in the infected brain tissue, indicating that EcoHIV successfully induces an active HIV infection in rats. In addition, immunostaining for the microglial cell marker, Iba1, was performed. The results indicated that microglia were the predominant cell type harboring EcoHIV. Furthermore, EcoHIV rats exhibited alterations in temporal processing, a potential underlying neurobehavioral mechanism of HAND as well as synaptic dysfunction eight weeks after infection. Collectively, the present study extends the EcoHIV model of HIV-1 infection to the rat offering a valuable biological system to study HIV-1 viral reservoirs in the brain as well as HAND and associated comorbidities such as drug abuse.

Here, we present a protocol to establish a new rat model of active HIV infection using chimeric HIV (EcoHIV), which is critical for enhancing our understanding of HIV-1 viral reservoirs in the brain and offering a system to study HIV-associated neurocognitive disorders and associated comorbidities (i.e., drug abuse).

Um modelo de rato de infecção cerebral ecohiv

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Monitoramento retículo endoplasmático homeostase do cálcio Usando um<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Biologia

Viral Transgene Expression in Rodent Hearts and the Assessment of Cardiac Arrhythmia Risk

Heart disease is the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Due to the ease of handling&#160;and abundance of transgenic strains, rodents have become essential models for cardiovascular research. However, spontaneous lethal cardiac arrhythmias that often cause mortality in heart disease patients are rare in rodent models of heart disease. This is primarily due to the species differences in cardiac electrical properties between human&#160;and rodents and poses a challenge to the study of cardiac arrhythmias using rodents. This protocol describes an approach to enable efficient transgene expression in mouse and rat ventricular myocardium using echocardiography-guided intramuscular injections of recombinant virus (adenovirus and adeno-associated virus). This work also outlines a method to enable reliable assessment of cardiac susceptibility to arrhythmias using isolated, Langendorff-perfused mouse and rat hearts with both adrenergic and programmed electrical stimulations. These techniques are critical for studying heart rhythm disorders associated with adverse cardiac remodeling after injuries, such as myocardial infarction.

The present protocol describes methods for transgene expression in rat and mouse hearts by direct intramyocardial injection of the virus under echocardiography guidance. Methods for the assessment of the susceptibility of hearts to ventricular arrhythmias by the programmed electrical stimulation of isolated, Langendorff-perfused hearts are also explained here.

Expressão Transgênica Viral em Corações de Roedores e Avaliação do Risco de Arritmia Cardíaca

Heart disease is the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Due to the ease of handling&#160;and abundance of transgenic strains, rodents ...

Establishing an Active HIV Infection in a Rat Model

Source: Li, H., McLaurin, et al. <a href="https://app.jove.com/v/62137">A Rat Model of EcoHIV Brain Infection.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates the procedure of injecting chimeric HIV viruses into the cortex of a rat&#39;s brain, where the virus RNA integrates into the host genome, replicates, and spreads to establish an active HIV infection in the experimental model.

Estabelecendo uma infecção ativa pelo HIV em um modelo de rato

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neuropathology

Infectious Diseases

Targeting Liver Tumors with Oncolytic Viruses via the Hepatic Artery

Source: Altomonte, J. et al., <a href="https://app.jove.com/v/53757">Transarterial Administration of Oncolytic Viruses for Locoregional Therapy of Orthotopic HCC in Rats.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2016)
The video demonstrates locoregional delivery of oncolytic viruses through hepatic arterial injection as a therapeutic approach for hepatocellular carcinoma. These viruses selectively replicate in tumor cells, inducing cell lysis and releasing tumor cell-associated antigens. This process triggers immunogenic cell death, inducing an anti-tumor response.

Manuseio do Rato Cotton em Estudos para a avaliação pré-clínica de Vírus Oncolíticos

Resumo

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