Este es un protocolo detallado para el montaje de plásmidos multigéneros utilizando el kit Yeast MoClo. Este método permite la clonación conveniente de una variedad de compañeros de clase multigénicos. Es ideal para generar una gran biblioteca de piezas relacionadas.
Comience configurando la mezcla de reacción de Golden Gate. Añadir 20 femtomoles de cada producto PCR y el vector de entrada, un microlitro de 10X T4 Ligase buffer, 0.5 microlitros de Esp3I, y 0.5 microlitros de ligasa T4. Agregue agua de doble destilación para llevar el volumen total a 10 microlitros.
A continuación, ejecute la reacción de clonación. Transforme toda la mezcla de reacción en la cepa alfa DH5 o células equivalentes de Escherichia coli químicamente competentes por choque térmico. Esparce las células en una placa lb con 35 microgramos por mililitro cloranfenicol.
Luego incubar la placa a 37 grados Celsius durante la noche. Después de 16 a 18 horas, saque el plato de la incubadora y déjelo a cuatro grados centígrados durante unas cinco horas para dejar que la proteína fluorescente verde supercarpeta o sfGFP se desarrolle para un color verde más intenso. Para examinar la placa, colóquela en un transilluminador de luz ultra-violeta o azul.
El sfGFP que contiene colonias fluorescencia bajo la luz UV. Las colonias verdes son negativas porque contienen la parte sin cortar plásmido. Las colonias blancas son probablemente positivas.
La clonación tiene éxito si hay colonias 30 a 100% blancas. Monte un vector intermedio con el conector izquierdo, la deserción sfGFP, el conector derecho, un marcador de selección de levadura, un origen de levadura de replicación y la pieza plásmida con un mRFP1, un origen E.coli y el gen resistente a la ampicilina. Realice la reacción de clonación como se describe en el manuscrito de texto.
Transforme toda la mezcla de reacción en la cepa alfa DH5 y luego extienda las células en una placa lb con 50 microgramos por mililitro de carbenicilina o ampicilina. Incuba a 37 grados centígrados durante la noche. Después de 16 a 18 horas, saque el plato de la incubadora.
La placa contendrá colonias de color rojo pálido y verde pálido. Manténgalo en cuatro grados centígrados durante unas cinco horas para que el mRFP1 y el sfGFP maduren. Utilice un transilluminador de luz UV o azul para identificar las colonias verdes que contienen el vector intermedio potencialmente correcto.
Sacando las colonias verdes en una placa de carbenicilina lb e incubar a 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, vuelva a salir en una placa de cloranfenicol e incubar a 37 grados centígrados durante la noche. Las colonias que crecen en placas de clorafeno contienen plásmidos desensensamblados.
Una vez que el vector intermedio se ha montado con éxito, proceda con el montaje de las unidades de transcripción. Este ensamblaje de cuatro piezas contiene el vector intermedio, un promotor, un CDS y un determinante. Purificar los plásmidos, registrar sus concentraciones y diluir cada plásmido a 20 femtomoles de ADN por microlitro.
Después de realizar la reacción de clonación, transforme toda la mezcla de reacción de clonación en las células competentes dh5 alfa o equivalente E.coli y colócalos en carbenicilina LBN. Luego incubar la placa a 37 grados Celsius durante la noche. Después de 16 a 18 horas, saque el plato de la incubadora y guárdalo a cuatro grados centígrados durante unas cinco horas para dejar que la sfGFP madure.
Utilice un uv o un transilluminador de luz azul para identificar las colonias blancas no fluorescentes que contienen las unidades de transcripción potencialmente correctas. Montar un vector intermedio para los plásmidos multigénicos como se describe en el manuscrito de texto. A continuación, transforme toda la mezcla de reacción de clonación en células alfa DH5 y échalas en lb con 50 microgramos por kanamicina mililitro.
Incuba la placa a 37 grados centígrados durante la noche. Realizar cribado a base de color rojo y verde, luego rayar y hacer crecer las colonias verdes en una placa de kanamycin lb para la pantalla de los antisamblies como se demostró anteriormente. A continuación, ensamblar el plásmido multi gen estableciendo una reacción de clonación como se describe en el manuscrito de texto.
Transforme toda la mezcla de reacción de clonación en células alfa DH5 y échalas en kanamycina lb. Incuba la placa a 37 grados centígrados durante la noche. A continuación, realice la proyección en verde y blanco como se describió anteriormente.
Este protocolo se utilizó para construir un plásmido multigénico integrador para interrumpir el locus ADE2. Se montaron cuatro plásmidos multigénicos replicativos y uno integrador. La proporción de colonias potencialmente correctas para la clonación de vectores intermedios fue del 1,83%Una vez clonado el plásmido intermedio, la tasa de éxito del montaje de plásmidos multigéneros del intermedio fue del 93,77%El número insignificante de colonias blancas positivas demuestra un conjunto subóptimo de plásmidos multigéneros.
Después de transformarse en levadura, las colonias productoras de betacaroteno y licopeno crecieron en el tercer día. Cuatro colonias de cada plato fueron rayadas en platos frescos y cultivadas durante dos días más. Los carotenoides fueron extraídos y cuantificados por espectrofotometría UV-Vis.
BTS1/ERG20 conduce a una producción 35 veces mayor de betacaroteno en comparación con la cepa solo con ERG20. Asimismo, la producción de licopeno es aproximadamente 16,5 veces mayor en la cepa con BTS1/ERG20 en comparación con ERG20 solamente. El plásmido integrador multigénico se utilizó para la interrupción del locus ADE2, ya sea con un ARN y sin ADN auxiliar o con gRNA y un plásmido integrativo multigénico como ADN auxiliar.
Después de tres o cuatro días, se observaron colonias rojas en la placa YPD con Nourseothricin, lo que indica que la ADE2 había sido interrumpida con éxito. Al intentar este método, lo más importante a recordar es medir las concentraciones de ADN con precisión y la pipeta cuidadosamente mientras se configura esta mezcla de reacción. Esta técnica permite a los investigadores en el campo de la ingeniería metabólica de levaduras estudiar un gran número de genes y promotores para maximizar el rendimiento del producto.
