El sistema bacteriano CRISPR-Cas9 ha aumentado sustancialmente las opciones experimentales para los científicos de la vida. Sin embargo, varios enfoques CRISPR dependen de la entrega simultánea de múltiples ARN guías en celdas individuales. La clonación de ARNN de ensamblaje de cadenas permite la generación simple y rápida de vectores de expresión de GRNA multiplex en un solo paso de clonación.
Pero STAgR no sólo es simple, también es eficiente, barato y fácil de personalizar. Para comenzar, agregue las secuencias de N20 gRNA a las imprimaciones de amplificación hacia adelante para la cadena de ADN STAgR como voladizos. Agregue secuencias de ARNN de detección de cinco primos a la imprimación delantera, imprimación delantera de andamio, para un andamio convencional o a la imprimación delantera SAM para un andamio que contiene MS2.
A continuación, añada las secuencias de NRNA N20 de complemento inverso a las secuencias de imprimación inversa, eligiendo imprimaciones RP, dependiendo de los promotores y cadenas específicos utilizados. Para comenzar a generar los fragmentos de clonación individuales para Gibson Assembly, transfiera 10 microlitros del búfer de alta fidelidad a un tubo. Agregue un microlitro de 10 dNTP milimolar y 0,25 microlitros de ambos imprimadores de voladizo micromolar.
Agregue 10 nanogramos de la cadena de plantilla de ADN, o vector, y 1,5 microlitros de DMSO. Agregue suficiente agua para llevar el volumen final a 49,5 microlitros, y luego agregue 0,5 microlitros de polimerasa HF. Incubar las reacciones en un termociclo, como se describe en el protocolo de texto.
Después de esto, tome una alícuota de 5,5 microlitrotro de la reacción PCR. Añade tinte de carga a todas las alícuotas y cárguelo en un gel de 1% de agarosa. Cargue una escalera de ADN adecuada para el tamaño y ejecute el gel en un tampón adecuado de funcionamiento en gel a 120 voltios durante 30 minutos.
Mientras el gel está en funcionamiento, agregue cinco microlitros del tampón suministrado con la enzima de restricción, y 0,5 microlitros DpnI a los 44,5 microlitros restantes de reacción de PCR vectorial para eliminar la plantilla de plásmido residual utilizada durante la PCR. Incubar a 37 grados centígrados durante 30 a 60 minutos. Compruebe que el amplicons tenga el tamaño correcto.
Para comenzar la purificación del ADN, agregue 1,8 microlitros de cuentas magnéticas por un microlitro de producto PCR, y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Incubar a temperatura ambiente durante dos minutos. Usando un imán, separe las cuentas en fragmentos de ADN del líquido residual.
Enjuagar el pellet con 70%etanol sin resuspendándolo completamente, para lavar las cuentas. Repita este lavado una vez más. Con una pipeta, retire todo el etanol y deje que el pellet se seque.
A continuación, agregue de 15 a 20 microlitros de agua, y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar y disolver el pellet. Utilice un imán para separar las perlas del líquido. Transfiera el sobrenadante transparente a un tubo nuevo.
Después de esto, utilice un espectrofotómetro para determinar las concentraciones de ADN. En primer lugar, prepare el búfer de reacción isotérmica 5x como se detalla en el protocolo de texto. Para la Gibson Assembly Master Mix, combine 320 microlitros del tampón de reacción isotérmica 5x con 697 microlitros de agua.
Añadir 3 microlitros de T5 exonucleasa, 20 microlitros de ADN polimerasa y 160 mcirolitros de ligasa de ADN Taq. Transfiera 7,5 microlitros de la mezcla maestra de montaje a un tubo nuevo. A continuación, agregue 2,5 microlitros de inserción en vector, como se describe en el protocolo de texto.
Incubar las muestras a 50 grados centígrados durante 45 a 60 minutos. Después de esto, almacene muestras en hielo, o a 20 grados centígrados, para su posterior transformación. Cuando esté listo para transformar las bacterias, descongele las bacterias químicamente competentes TOP10 E. coli sobre hielo.
A continuación, agregue cinco microlitros de la Gibson Mix a 50 microlitros de bacterias competentes, y mezcle moviendo suavemente la parte inferior del tubo. Incubar sobre hielo durante 30 minutos. Coloque el tubo en un baño de agua celsius de 42 grados o un bloque de calor durante 45 segundos para calentar la bacteria.
Luego, vuelve a poner los tubos en hielo. Añadir 250 microlitros de medio SOC a las bacterias, y dejar que se recuperen a 37 grados Celsius en una incubadora de temblores durante 30 a 45 minutos. Después de que las bacterias se han recuperado, platéjelas en placas de agar 1.5%LB que contienen 100 microgramos por mililitro ampicilina.
Incubar las placas a 37 grados centígrados durante la noche. Para empezar, prepare al menos dos conjuntos de 200 tubos de reacción PCR microlitro para cada construcción. Llene uno de los conjuntos de tubos de reacción con 100 microlitros LB medio, que contiene 100 microgramos por mililitro de ampicilina.
Usando una punta de pipeta estéril, rasque el material biológico de una colonia bacteriana y extiéndalo en la parte inferior de un tubo de reacción PCR vacío de 200 microlitriles. Transfiera inmediatamente la punta de la pipeta al segundo tubo de reacción correspondiente que contenga el medio LB. Gire la punta para asegurarse de que algunas de las bacterias se transfieren a los medios LB.
Incubar a 37 grados centígrados para su uso posterior. A continuación, prepare 10 microlitros de PCR Master Mix por tubo de reacción, como se describe en el protocolo de texto. Agregue 10 microlitros de la PCR Master Mix a los tubos de reacción PCR etiquetados, sin los medios LB.
Usando un termociclador, incubar las reacciones como se describe en el protocolo de texto. Después de esto, agregue tinte de carga a los fragmentos amplificados, y cárguelos en un gel de 1% de agarosa. Cargue una escalera de ADN adecuada para el tamaño y ejecute el gel en un tampón adecuado de funcionamiento en gel a 120 voltios durante 30 minutos.
Calcular el tamaño teórico del amplicon sumando los tamaños individuales de los promotores usados, los andamios de GRNA y el número de secuencias N20. A partir de los resultados de la PCR de la colonia, identifique los clones bacterianos, en función del tamaño correcto de la banda, y si es probable que albergan vectores correctos. Utilizando el cultivo correspondiente de 100 microlitios, inocular un cultivo de LB nocturno de 2,5 mililitros que contenga 100 microgramos por mililitro ampicilina.
Incubar a 37 grados centígrados durante 12 horas. A continuación, utilice un mini-kit de plásmido comercial para extraer el ADN del plásmido, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En este procedimiento, la clonación de GRNA de ensamblaje de cadena se utiliza para generar rápidamente plásmidos de expresión de GRNA.
Un resultado típico de los PCR usados para obtener las piezas STAgR se ve aquí. Los seis amplicons representan piezas lineales de ADN, cada una de las que contiene las secuencias individuales de gRNA N20 en sus extremos. La columna vertebral del plásmido se extiende con las secuencias de apuntamiento de gRNA1 y gRNA6, y por lo tanto posee las superposiciones requeridas a otros dos PCR para el ensamblaje Gibson.
Después de la purificación, se puede lograr un rendimiento de ADN de al menos un microgramo para vectores e inserciones. Después de Gibson Assembly, la transformación bacteriana resulta en 100 a 700 colonias bacterianas. El análisis representativo de 22 colonias bacterianas, a través de la PCR de colonia siguiendo un protocolo STAgR con seis casetes de GRNA, indica que siete clones muestran el tamaño de amplicon esperado para el montaje completo.
Los otros clones probablemente recibieron vectores STAgR, que contienen de uno a cinco casetes de GRNA, mientras que un clon está completamente vacío. Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en pocas horas. Realizado correctamente, permite la generación de una multitud de vectores de expresión de ARNN multiplex en menos de una semana de trabajo.
Al intentar este procedimiento, es importante prestar atención a la asignación correcta y la combinación de imprimaciones de voladizo N20. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión sobre cómo crear sus propios vectores de expresión de ARN guía multiplex.
