Nuestra investigación se centra en las neuronas y los circuitos del sistema somatosensorial implicados en la narración de los efectos analgésicos de la acupuntura sobre el dolor visceral mientras intentamos ajustar las respuestas neuronales de la neuro DRG a los estímulos de la acupuntura. Los métodos tradicionales, como la electrograbación, no pueden examinar de manera eficiente el número suficiente de células y los vínculos celulares específicos distintivos para identificar las neuronas sensibles viscerales o somáticas in vivo. El estudio de las funciones de la neurona DRG en el efecto analgésico de la acupuntura ha sido difícil debido a las limitaciones tecnológicas.
Introdujimos un enfoque general para observar la responsabilidad de una neurona DRG número seis en la simulación intracolónica y de acupuntura in vivo. El protocolo describe los procedimientos para observar la actividad de las neuronas DRG in vivo en respuesta a la entrada somática y de vísceras. Se trata de una mejora con respecto al estudio anterior, que solo se centró en estudiar las respuestas de las neuronas en L5 DRG bajo los estímulos somáticos.
En el futuro, con la configuración adecuada, las imágenes CAS DRG in vivo se pueden realizar en segmentos torácicos o cervicales, proporcionando una herramienta más poderosa para estudiar la nocicepción visceral y los efectos de la acupuntura. Este método es esencial para que los investigadores de acupuntura aprendan. Para comenzar, coloque el ratón traqueostomizado en posición prona sobre la almohadilla térmica.
Haz una incisión de siete centímetros de largo en la línea media de la espalda baja y extiéndela desde la quinta lumbar hasta la primera vértebra sacra. Luego, haga a un lado con cuidado los músculos longissimus lumborum para exponer las apófisis espinosas de las tres vértebras. Mueva las partes internas del longissimus lumbarum bilateral, los músculos de la columna lumbar dorsal y los músculos semiespinales lumbares dorsales para exponer los tres procesos articulares y mamilares sucesivos con el segmento de registro en el medio de las vértebras.
Ahora, inmovilice firmemente al animal con pinzas dentales en las apófisis articulares bilaterales de las vértebras vecinas. Utilice pinzas de rongeur para extirpar las apófisis articulares y mamilares izquierdas o derechas de las cuatro o seis vértebras lumbares. Exponga cuidadosamente el seis DRG lumbar izquierdo o derecho después de limpiar los tejidos conectivos por encima de él.
Asegúrese de mantener el epineurio intacto en el lado elegido de las seis vértebras lumbares. Cubra las áreas expuestas de DRG con pequeñas bolas de algodón empapadas en solución salina para mantener la condición activa. Ahora, conecte el sistema de administración de anestesia de bajo flujo a la cánula traqueal para intubar a los ratones.
Coloque al animal con el DRG expuesto en una almohadilla térmica situada en la etapa de una pinza espinal personalizada. Usando dos pinzas en las columnas vertebrales de las vértebras vecinas, asegure al animal para minimizar el movimiento durante la prueba. Luego, reemplace las bolas de algodón mojadas con solución salina hasta que el área quirúrgica esté adecuadamente limpia.
Inserte la pinza espinal personalizada en la platina del microscopio diseñada a medida. Para la obtención de imágenes, coloque una lente de objetivo aéreo de larga distancia de trabajo de un microscopio confocal sobre el DRG expuesto. Capture pilas Z de lapso de tiempo de los cuatro o seis DRG lumbares intactos con una resolución de 25 micrómetros por paso y 512 por 512 o 1.024 por 1.024 píxeles.
Realice la exploración XYZT del DRG con cuatro a ocho pilas, que abarcan de uno a tres estados basales, dos a tres estímulos de acupuntura o distensión colorrectal visceral y uno a dos estados posteriores a los estímulos. A continuación, aplique estímulos de cepillado o pellizco en la parte baja de la espalda, la extremidad trasera o la pata trasera del animal para evaluar el campo receptivo más sensible de las neuronas DRG de las que se obtienen las imágenes. Administre estímulos de acupuntura manualmente o utilizando un estimulador de puntos de acupuntura y nervios disponible en el mercado.
Emplee la distensión colorrectal con un manómetro de presión de aire de fabricación propia para inducir estímulos viscerales. Utilizando un microscopio confocal, mida el aumento de la fluorescencia verde del GCaMP neuronal al unirse al calcio intracelular después de estímulos somáticos o viscerales. Usando un software de imágenes, aclare el video usando la opción de color.
Delinee manualmente las células visibles y determine el tamaño de las células y la intensidad de fluorescencia relativa. Expresar la intensidad de fluorescencia como una relación entre el aumento de la fluorescencia máxima evocada y el nivel basal. Las seis neuronas DRG lumbares generalmente carecen de fluorescencia GFP basal, posiblemente influenciada por los niveles de expresión de GCaMP y el daño quirúrgico.
Los estímulos de distensión colorrectal indujeron un aumento rápido y transitorio de la fluorescencia de GCaMP. Se observaron respuestas similares con la aplicación de electroacupuntura BL25. Los mapas de calor y los gráficos de líneas mostraron las respuestas de todas las neuronas encerradas en un círculo a la distensión colorrectal y a la electroacupuntura BL25.
El histograma muestra los diámetros de las neuronas que responden a la distensión colorrectal y a la electroacupuntura BL25.
