Apoyo parcial de este trabajo fue proporcionado por el Instituto Nacional de Salud (R01GM100470 y 1R01GM095959-01A1; a MA y JDS) y una donación del Fondo Core del Instituto de Ciencias clínica y traslacional Indiana (financiado en parte por el NIH subvención # TR000006 UL1; a JDS).

1. Swarm Ensayo Preparación de Medios y Inoculación 4,5,7,8,11 <ol><li> Preparación de Medios NOTA: La composición del medio descrito a continuación es aplicable a P. aeruginosa estudios de formación zarcillo. Por favor, consulte las especificaciones de los medios de comunicación en la Tabla 1 para P. aeruginosa, B. subtilis, y M. ensayos de movilidad superficie xanthus. <ol><li> Mezclar 200 ml de FAB-menos (NH 4) 2 SO 4 medianas enjambre (Tabla de Materiales), 0,9 g de agar Noble, y 0,2 g de ácidos Casamino (Tabla 1) por agitación con una barra de agitación magnética. Use pequeños volúmenes (100-300 ml) para mejorar la coherencia entre los experimentos. </li><li> Autoclave la mezcla de 200 ml de agar / media utilizando un tiempo de exposición de 22 min, temperatura de exposición de 121,1 ° C, y una opción de ventilación rápida. Los ajustes de autoclave permiten la esterilización adecuada y la fusión de agar, pero evitar la caramelización agar. NOTA: agar Noble es propenso a caramelozación; la motilidad bacteriana se altera en agar caramelizado. </li><li> Inmediatamente después de que el ciclo de esterilización ha finalizado, cierre la tapa de la botella de medios para evitar la pérdida de agua por evaporación. Sin embargo, tenga en cuenta que taponado apretado puede causar un &quot;vacío de sellado&quot; efecto -como en la botella. </li><li> Enfriar los medios de comunicación a 50 ° C mientras se agitaba a temperatura ambiente (RT) y añadir 2 ml de solución estéril de glucosa 1,2 M. Como alternativa, coloque los medios de comunicación en una incubadora o baño de agua a 60 ° C hasta su utilización (hasta 15 horas más tarde), y proceder como se indica. Para evitar la formación de burbujas en los medios de comunicación, mezclar bien usando la barra de agitación magnética; burbujas en la superficie del agar impedirá incluso enjambre. NOTA: Para otros ensayos, añadir en este paso componentes sensibles al calor que no pueden ser esterilizados en autoclave, tales como nutrientes o colorantes adicionales, según sea necesario (por ejemplo, la adición de 8 l Invitrogen Syto 63 colorante por 100 ml de agar se fundió a la imagen de M. xanthus como se muestra en RepresentatiResultados ve, a continuación). La adición de algunos tintes puede afectar el comportamiento de enjambre de línea de base, que debe cotejarse con un control sin tinte. </li><li> En una campana de laboratorio, alícuota de 7,5 ml de medio estéril por 60 mm de diámetro de poliestireno plato Petri y mantener las placas en una sola capa (no apiladas). Para mayor superficie enjambre, alícuota de 25 ml de medio por 100 mm de diámetro placa de Petri. Es importante llenar los platos sobre una superficie plana horizontal. Utilice altura de los ojos de buey para comprobar si la superficie está nivelada. NOTA: Para P. ensayos aeruginosa, utilizando un volumen de medios específicos por placa mejorarán la coherencia y la reproducibilidad. Para B. subtilis y M. ensayos xanthus, vertiendo mano da resultados comparables a alícuotas de volumen específicos. </li></ol></li><li> Curado Plate <ol><li> Para platos pequeños (60 mm), permita que el medio de agar fundido para curar (tanto ajustado a semi-sólida y seca el exceso de líquido) en la campana al descubierto (es decir, sin tapas) durante 30 min. Ampliarplacas (100 mm) requieren un tiempo de curado más largo (véase la discusión). NOTA: Como alternativa, algunos ensayos pueden requerir placas para curar durante la noche en el banco de la parte superior (20-24 hr) cubierto (es decir, las tapas en) en una sola capa (Tabla 1). La enjambrazón es sensible tanto exceso y la insuficiencia de humedad. La humedad, flujo de aire, y la temperatura de cualquier laboratorio dado pueden requerir variación a la placa de curado para promover enjambre óptima de ustedes bacteria. </li><li> Inocular las placas inmediatamente después del período de secado ha terminado. No guarde las placas para su uso posterior. <ol><li> Realice la &quot;prueba de propagación de la tinta&quot; mediante la detección de una placa de ensayo con la mezcla de 10 l de 0,50% (vol / vol) India Ink Higgins Impermeable Negro y inóculo bacteriano 11. Si la mezcla de tinta / inóculo se propaga fácilmente (es decir, no conserva la forma de gota) en la superficie de los medios de comunicación, los medios de comunicación si necesitan más tiempo para secarse. NOTA: Para las especies que son particularmente sensibles a la humedad (&lt;em&gt; por ejemplo, P. aeruginosa), realice un rápido &quot;prueba de propagación de la tinta&quot; 11 para determinar si las placas son lo suficientemente seco. </li></ol></li></ol></li><li> Enjambre ensayo Inoculación <ol><li> Inocular 6 ml de medios de cultivo de caldo (véase la Tabla 1 para más detalles) con una colonia aislada de una (&lt;5 días de edad si se deja a temperatura ambiente) Lisogenia Broth (LB) cultivo en placa fresca. Incubar caldos de cultivo durante la noche (≤18 h) a 30 ° C o 37 ° C con agitación horizontal (240 rpm). </li><li> Inocular placas enjambre manchando con 1.5 l de caldo de cultivo durante la noche, o por &quot;meter&quot; el agar con un diente estéril recoger o aguja de inoculación de alambre. NOTA: Preferimos el último método, ya que disminuye la probabilidad de salpicando el inóculo y evita la adición de humedad adicional a la superficie enjambre. </li></ol></li><li> Enjambre Ensayo Incubación <ol><li> Para el ensayo en general, incubar las placas de ensayo enjambre a 30ºC o 37 ° C (o incluso 42 ° C para B. subtilis, Tabla 1): ésta es la bacteria específica. Invertir las placas durante la incubación de manera que el exceso de humedad se condensa en la tapa, no el agar. NOTA: La temperatura puede afectar el fenotipo, así como la cinética. Para P. enjambres aeruginosa, la incubación a 37 ° C conduce a un crecimiento más rápido y el enjambre de expansión de la incubación a 30 ° C; sin embargo, la morfología de estos enjambres a menudo difiere con este cambio en la temperatura. </li><li> Para time-lapse, incubar las placas enjambre a la temperatura adecuada antes de la transferencia en la estación de formación de imágenes (ver Tabla 1 para más detalles). NOTA: Esta incubación previa de imagen permite enjambres para iniciar su desarrollo y se establezcan antes de ser trasladado a un nuevo ambiente, que pueden o no ser óptimo para la motilidad enjambre. </li></ol></li></ol> 2. Imagen macroscópica de la superficie Motilidad Ensayos 7,8 &lt;ol&gt; <li> Para time-lapse, después de las pre-imágenes placas de ensayo enjambre período de incubación lugar en una placa de imagen clara dentro de un in vivo estación comercial de imágenes. Imagen hasta seis, 60 mm de diámetro o cuatro, 100 placas mm de diámetro a la vez. Dado que la cámara captura imágenes de debajo del plano de la imagen, invertir las placas de manera que la trayectoria óptica no está obstruido 8. Alternativamente, se incuban a 30 ° C o 37 ° C (Tabla 1) para la duración del experimento, y eliminar las placas para obtener imágenes de la incubadora a intervalos de tiempo establecidos. </li><li> Colocar las tapas de las placas de Petri en posición vertical sobre la parte superior de la contraparte placa que contiene el medio inoculado. Llenar las tapas de las cajas de Petri con agua para evitar el secado excesivo durante la exploración, y adjuntar toda la puesta en marcha usando otra bandeja clara para mantener la humedad durante todo el experimento. </li><li> Uso de Imagen Molecular (MI) de software 12, ensayo (s) de gestión a temperatura ambiente usando la imenvejecimiento ajustes que se describen en la Tabla 2. Para time-lapse, establecer un protocolo con las medidas y especificaciones necesarias. </li></ol> 3. Procesamiento e Interpretación de Datos 7,8 <ol><li> Procesamiento De Imágenes <ol><li> Utilice software de MI para exportar imágenes por lotes como archivos TIFF de 16 bits: Archivo&gt; Exportar o exportar varios&gt; Seleccionar archivo (s) para exportar y ubicación de exportación. </li><li> Utilice ImageJ para abrir una sola imagen o importar una serie de lapso de tiempo: <ol><li> Abrir una sola imagen: Archivo&gt; Abrir </li><li> Importación de lapso de tiempo de secuencia de imagen: Archivo&gt; Secuencia de importación, y seleccione &quot;Ordenar nombres numéricamente&quot;. <ol><li> Para los archivos de lapso de tiempo de mayor tamaño, seleccione &quot;Usar pila virtual&quot; en la ventana &quot;Importar Secuencia&quot; apilar las imágenes exportadas en las categorías adecuadas (es decir, GFP, RFP, etc.). </li></ol></li></ol></li><li> Si es necesario, cambiar las imágenes de archivos de 16 bits en archivos de 8 bits: Imagen&gt; Tipo&gt; 8-bit NOTA: Algunas herramientas ImageJ requieren imágenes de 8 bits. </li><li> Determinar si la señal de intensidad para una secuencia de imágenes o de lapso de tiempo necesita ser invertida. Coloque el cursor en un punto brillante en la imagen (por ejemplo, el crecimiento de la etiqueta fluorescente) y tenga en cuenta la intensidad de la señal &quot;Valor&quot; de la barra de herramientas ImageJ. Luego, coloque el cursor en un punto oscuro fuera del área de la placa y tomar nota de la intensidad de la señal. Si la intensidad de la señal para el punto oscuro es mayor que la intensidad de la mancha, la intensidad de señal de imagen necesita ser invertida (siga subetapas 1-2 abajo). <ol><li> Invierta las señales de intensidad: Editar&gt; Invertir </li><li> Invierta la tabla de búsqueda: Imagen&gt; Tablas de búsqueda&gt; Invertir LUT </li></ol></li><li> Reste el fondo: Proceso&gt; Reste fondo, y utilizar un &quot;Rodando radio de la bola&quot; con un radio de píxeles que es la mitad de una de las dimensiones de la imagen (por ejemplo, 1.000 píxeles para una p 2.000 x 2.000Ixel imagen). </li><li> Artificialmente colorear una secuencia de imágenes o time-lapse: Imagen&gt; tablas de búsqueda, y seleccione el color apropiado de las opciones de la lista. </li><li> Para las películas con dos o más canales, combinar y equilibrar los colores antes de guardar como una película (Image Processing, Paso 8). Para fusionar imágenes juntas, abierto todas las pilas de imagen en ImageJ, a continuación, seleccione Imagen&gt; Color&gt; Combinar Canales, y asignar cada pila a un canal de color. </li><li> Guardar secuencia de lapso de tiempo como AVI o QuickTime Movie: Archivo&gt; Guardar como, y elegir el formato y las especificaciones que desee. </li></ol></li><li> Análisis De Los Datos <ol><li> La adquisición de Zona de Crecimiento de la superficie bacteriana para cuantificar Expansión Tarifa <ol><li> Abrir imagen (s) en ImageJ </li><li> Para calcular el diámetro de la placa en píxeles, dibujar una línea a través del centro de una placa de ensayo con la herramienta &quot;Straight&quot; de la y medir su longitud: Analizar&gt; Medida </li><li> La unidad de medida predeterminada en ImageJ es la pixel. Obtener un factor de conversión dividiendo el diámetro de la placa de ensayo (por ejemplo, 60 para una placa de 60 mm) por la longitud de píxel obtenido en la etapa anterior. </li><li> Cambie la unidad de medida de píxel a mm: Imagen&gt; Propiedades <ol><li> Cambie la &quot;Unidad de longitud&quot; a &quot;mm&quot;, y el &quot;Pixel Ancho&quot;, &quot;Pixel Altura&quot; y &quot;Profundidad Voxel&quot; para el factor de conversión calculado en el paso anterior. Seleccione la casilla de &quot;Global&quot; para mantener este factor de conversión a través de múltiples imágenes. NOTA: Si ImageJ se cierra y vuelve a abrir, o el campo de visión de una imagen se cambia (es decir, una imagen se ha ampliado más que otro), el factor de conversión debe ser recalculado. Alternativamente, lleve a cabo todos los análisis en píxeles y después se convierte en mm. </li></ol></li><li> Para cada cuadro, rastrear y medir el área enjambre con la función &quot;Selección a mano alzada&quot; en la barra de herramientas para rastrear el ouTLINE del enjambre y medir el área usando: Analizar&gt; Medida. Esto generará un registro de las mediciones que se pueden guardar para su posterior análisis en Microsoft Excel o programas similares: Archivo&gt; Guardar como </li></ol></li><li> Adquirir bacteriana Intensidad Crecimiento superficial para cuantificar la superficie Tasa de Crecimiento <ol><li> Una vez que el fondo se resta (Image Processing, Paso 5), utilice el último fotograma de la secuencia para determinar el área máxima de enjambre (Análisis de Datos, paso 1). </li><li> Utilice la opción &quot;Oval&quot; herramienta de selección de la barra de herramientas para dibujar un cuadro alrededor de la superficie de crecimiento bacteriano. </li><li> Establecer la medida de intensidad de los píxeles de la caja utilizando decir: Analizar&gt; Medidas Set y seleccione &quot;Mean valor de gris&quot;. </li><li> Para obtener mediciones de la señal de intensidad para cada fotograma de la secuencia de lapso de tiempo, mientras que en el primer fotograma de la secuencia de ir a: Analizar&gt; Medida. Esto generará un registro de las mediciones que se pueden guardar para su posterior análisis en Microsoft Excel o programas similares: Archivo&gt; Guardar como </li></ol></li><li> Alternativa a la sección anterior (Análisis de Datos Paso 2). Utilice el plugin ImageJ Macros de configurar y ejecutar un crecimiento en superficie guión medida de intensidad en Macros. <ol><li> Configuración de un script de medición automatizada para analizar varios fotogramas simultáneamente: Plugin&gt; Nuevo&gt; Macro y pegue el guión previsto (abajo) en la caja y guardar como archivo de texto ImageJ Macros: Archivo&gt; Guardar y guarde en la carpeta de aplicaciones ImageJ bajo &quot; macros &quot;. numberOfFrames = N for (i = 0; i &lt;numberOfFrames; i ++) { ejecutar (&#39;Medida&#39;); ejecutar (&#39;Next rebanada [&gt;]&#39;); } NOTA: Aquí la variable &quot;N&quot; está para un número indefinido de marcos. </li><li> Editar los &quot;numberOfFrames&quot; en el plugin macros para cada experimento para reflejar el número de fotogramas en la secuencia de imágenes antes de ejecutar el script. Uso: Plugin&gt; Macros&gt;Editar, e introduzca el número correcto de los fotogramas de la secuencia y guardar (Archivo&gt; Guardar). </li><li> Siga subetapas 1-3 en Análisis de Datos Paso 2, y si bien en el primer fotograma de la secuencia de ejecutar el complemento de Macros: Plugin&gt; Macros&gt; Ejecutar. Esto generará un registro de las mediciones que se pueden guardar para su posterior análisis en Microsoft Excel o programas similares: Archivo&gt; Guardar como </li></ol></li></ol></li></ol>

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Las tasas de publicación de este artículo fueron parcialmente patrocinado por Bruker Corporation.

El logro de la enjambrazón reproducible en un laboratorio puede ser un reto, como ensayos de enjambres son muy sensibles a los factores ambientales, como la humedad y los nutrientes disponibles. El aspecto más crítico de una superficie de ensayo de placa de la motilidad es la humedad en la superficie del agar. Antes de la inoculación, los medios de enjambre deben ser lo suficientemente seco para evitar que las células bacterianas de nadar a través de la superficie del líquido, pero no tan seco como para inhibir la motilidad enjambre 5. La incubación debe tener lugar en un entorno suficientemente húmedo: demasiado poca humedad puede dar lugar a la desecación de ensayo durante la incubación, mientras que el exceso de humedad puede conducir a la superficie artificial o artefactos difusión. A menos que una incubadora con control de humedad está a la mano, incubadora y humedad de laboratorio pueden variar dramáticamente. En consecuencia, un depósito adicional de agua, un humidificador, o un deshumidificador dentro de la incubadora podrían ser necesarias para evitar el exceso de secado o la acumulación de exceso de humedad mientras se mantiene la relative humedad cercana al 80%. El mantenimiento de esta humedad ideal puede resultar difícil si los cambios de humedad estacionales son significativos. Si este es el caso, el protocolo de ensayo enjambre requerirá algunos ajustes para tener en cuenta los cambios estacionales de humedad. Hemos encontrado que la modificación del tiempo de secado medios enjambre es la forma más sencilla para ajustar los cambios de humedad estacionales. Vigilancia de la humedad constante, tanto dentro como fuera de la incubadora, se recomienda. Además, se recomienda que los investigadores calibrar y validar sus instrumentos, incubadoras, escalas, etc. errores como de menor importancia en la temperatura, volumen o cantidades de los componentes del medio pueden afectar la reproducibilidad de estos ensayos. También debe tenerse en cuenta que el tipo y tamaño de la placa usada en el ensayo pueden afectar a la humedad placa, y por lo tanto enjambre. Placas herméticos no ventilar el exceso de humedad, favoreciendo así la natación motilidad. En contraste, las placas de libro abierto permiten demasiada humedad se escape. Un plato Petriproporciona un entorno ideal, ya que ventila fuera suficiente exceso de humedad para evitar que el líquido se acumule, pero retiene la humedad suficiente para evitar que los medios de comunicación se sequen. Este método detalla un protocolo de ensayo de la motilidad superficie que permite la formación de imágenes de alta calidad. Para mantenerse separado para platos de imágenes de 60 mm de diámetro están llenas de 7,5 ml de medio de agar agar. Si no se requiere formación de imágenes se detalla, volúmenes de hasta 20 ml también pueden proporcionar resultados reproducibles. Mientras que la motilidad enjambre se puede lograr en una amplia gama de concentraciones de agar, el rango óptimo de agar requerido para enjambre depende de la especie. En general, las concentraciones más altas de agar inhiben la motilidad enjambre, y por consiguiente el tiempo necesario para producir una imagen-listo enjambre aumenta. P. aeruginosa general pulula sobre las concentraciones de agar entre 0,4-0,7% 1, sin embargo, nos encontramos con que la enjambrazón óptima se produce en un rango mucho más estrecho (0,4-0,5%). Otros, como el B. subtilis y S. entéricoun enjambre en el 0,6% de agar, y Vibrio parahaemolyticus en el 1,5% de agar 10. La concentración de agar requerido se determina por el tipo y marca de agar. Agares de mayor pureza, como agar Noble, mejoran fuertemente pululando en P. aeruginosa y se prefieren sobre agar granulado 13,14. Sin embargo, estas versiones purificadas de agar también son más propensos a la caramelización durante el ciclo de esterilización en autoclave; dependiendo del instrumento, una secuencia abreviada / modificado esterilización (para alterar posiblemente el ciclo de escape para evitar la exposición prolongada al calor) puede ser necesaria para preparar los medios enjambre utilizando agar Noble. Composición de los medios de comunicación también juega un papel en el fenotipo observado enjambre 3. P. aeruginosa estudios de motilidad enjambre se realizan generalmente utilizando medios nutrientes mínimos. Preferimos FAB medio de 4,8 (Tabla de Materiales), pero otros medios, como la M9, LB, o ligeras variaciones a estos medios de comunicación comunes,se han utilizado con éxito 9,15,16. Formación Tendril se logra mejor en FAB medio mínimo suplementado con glucosa como fuente de carbono y casaminoácidos (CAA), pero sin una fuente de nitrógeno adicional (es decir, (NH 4) 2 SO 4) 6,13. Si la formación zarcillo o la morfología no es el foco principal del estudio, a continuación, FAB medio mínimo (Tabla de Materiales; Tabla 1) carente de CAA se recomienda de manera que los efectos de las fuentes de carbono específicas y / o nutrientes adicionales pueden ser estudiados en detalle. Otras especies, tales como B. subtilis (presentada aquí), son enjambres versátiles, capaces de enjambre en LB y agar granulado. Estas especies pululan fácilmente, requiriendo sólo ~ 10 horas para desarrollar un enjambre completo. Esta tasa enjambre rápido hace siguiendo la progresión del enjambre potencialmente difícil, pero nuestro protocolo hace que tal seguimiento muy factible. La capacidad de realizar time-lapse enjambre proporciona una Sustanciacial facilidad en la adquisición de datos enjambre, particularmente de tales enjambres ávidos. Se introduce un e integral, el protocolo de dos fases sólida y directrices encaminadas a mejorar la ejecución y la reproducibilidad de la investigación motilidad superficie bacteriana y hemos hecho hincapié principalmente aspectos importante examinar enjambre flagelar mediada. Este protocolo de ensayo enjambre detalla aspectos importantes de la composición de los medios y la manipulación de placas de motilidad superficie para proporcionar una mayor consistencia y reproducibilidad dentro y entre los grupos de investigación. Esto mejorará la base de la comparación entre los diferentes estudios de investigación. Además, el enfoque presentado y el protocolo proporciona los medios para hacer que la investigación en enjambre y la superficie de la motilidad menos susceptible a las variaciones ambientales haciendo investigadores conscientes de que tales factores afectan a su trabajo y proporcionar posibles soluciones (por ejemplo, ¿cómo pequeños cambios en agar afectan enjambre 4,5 ). Además, el protocolo proporciona acuantificar aspectos macroscópicos de enjambrazón, proporciona una oportunidad para medir muchos atributos de crecimiento de la superficie bacteriana que antes eran imposible de cuantificar. No hemos examinado todas las bacterias móviles de superficie en el desarrollo de este protocolo. Como tal, se espera que se requerirán modificaciones de protocolo para las especies no se presentan aquí. La eficacia de este protocolo está restringido por los límites inherentes de los equipos y materiales empleados. Por ejemplo, los estudios relacionados con la temperatura hasta el momento con la estación de formación de imágenes Bruker no son posibles, ya que el control de temperatura no es una característica del equipo. Además, el uso de colorantes (tales como Rojo Nilo para teñir ramnolípidos) puede tener limitaciones cinéticas y de concentración 8. Esta técnica se basa fuertemente en el procesamiento y análisis de imágenes digitales; mejora de automatización de análisis de datos (por ejemplo, usando macros adicionales en función de script ImageJ) reduciría el tiempo necesario para el análisisy expandir la utilidad de los datos. Por último, debido a la robustez del protocolo de imágenes, aplicaciones futuras deberían tener como objetivo la ampliación de esta técnica para examinar las superficies de crecimiento menos uniformes que son más relevantes para las superficies colonizadas por bacterias ambientales y patógenos.

Muchas bacterias se mueven sobre superficies utilizando diversos medios de auto-propulsión. Algunos fenotipos de motilidad se pueden investigar en el laboratorio usando los ensayos de placa que se ven afectados por el medio líquido asociado con la composición de ensayo de placa de semi-sólido. Un subconjunto de la superficie útil ensayos de placa motilidad implica además un aire de gas fase típicamente habitación. En consecuencia, el resultado de cualquier ensayo de la motilidad superficie en particular, exige un cuidadoso control de la interfaz de tres fases: la superficie sólida ambiental local, el medio ambiente líquido y propiedades de entorno gas. El modo de la motilidad más comúnmente estudiado en un ensayo de este tipo de tres fases se conoce como un enjambre. Motilidad enjambre es el movimiento grupo coordinado de las células bacterianas que son impulsados ​​por sus flagelos a través de películas líquidas delgadas sobre superficies 1. Se estudia normalmente en laboratorios utilizando los ensayos de placa semi-sólidos que contienen 0,4% -0,8% (p / v) de agar 1. Una serie depatógenos humanos explotan este comportamiento motilidad para explorar y colonizar el huésped humano. Por ejemplo, Proteus mirabilis utiliza la motilidad enjambre de ascender en la uretra, alcanzando y colonizar la vejiga y los riñones 2. Motilidad enjambrazón es generalmente considerado como un paso precursor de la formación del biofilm, la causa principal de la patogénesis de muchos patógenos humanos 3. El fenotipo enjambre es muy variada entre las especies bacterianas; el éxito experimental y reproducibilidad dependen en gran medida de factores tales como la composición de nutrientes, el tipo de agar y la composición, el protocolo de esterilización (por ejemplo, esterilización en autoclave), semi-sólida de curado medios de comunicación, y de la humedad ambiente (por ejemplo, cambios estacionales), entre otros 3-5. La variabilidad de las respuestas de la motilidad de superficie hace hincapié en los problemas encontrados en estos estudios y los medios de influencia significativa y el medio ambiente pueden ejercer. Para algunas especies que pululan, como Pseudomonas, mot enjambreility puede ocurrir en una variedad de composiciones de medios, aunque el fenotipo observado y acompañando tasa de expansión enjambre variarán en gran medida 3. Combinados, estos factores pueden hacer estudios de motilidad superficie extremadamente desafiante. La variabilidad estacional dentro de un laboratorio puede influir en estos ensayos de tres fases: ensayos pueden funcionar mejor en el aire húmedo del verano y peor en el aire seco del invierno. Aquí presentamos las pautas generales para evitar algunos de los desafíos más notables cuando se realizan estudios de superficie de la placa de la motilidad. Para algunos estudios de la motilidad de la superficie, el desarrollo de fenotipos específicos es de gran interés. La mayoría, aunque no en todos los estudios publicados para examinar enjambre de P. aeruginosa muestran la formación de zarcillos o fractales que irradian desde un centro de inoculación 3-9. Las diferencias entre P. aeruginosa cepas se han documentado 5,8, pero gran parte de la presencia o ausencia de zarcillos pueden ser atribuidos a la especific medio y el protocolo usado para estos ensayos de placa de la motilidad enjambre. Aquí se incluyen los detalles sobre cómo promover enjambres zarcillo de formación para P. aeruginosa. Debido P. aeruginosa es sólo una de las muchas bacterias que pululan, también incluimos detalles de nuestro método para examinar enjambre de Bacillus subtilis y vuelo sin motor de Myxococcus xanthus. Como P. aeruginosa, la investigación actual sobre B. subtilis y M. xanthus abarca una variedad de temas como los investigadores están trabajando para discernir los aspectos de la esporulación, la motilidad, la respuesta al estrés, y el comportamiento de transición 1,10. Hay una necesidad de cuantificar los patrones y la dinámica del comportamiento específico (s) para estas células en grupos enjambre. Adquisición de datos de la motilidad de superficie, el análisis y la interpretación puede ser engorroso y cualitativa. Hemos desarrollado un protocolo para el análisis macroscópico detallada de enjambres bacterianas que ofrece además a pulular morfología de zona y size (por ejemplo, diámetro), información dinámica cuantitativa sobre tasa de expansión enjambre y distribución bacteriana o la densidad de bioproductos 7. Además, este método puede tomar ventaja de las proteínas fluorescentes disponibles, luminiscencia, y colorantes para obtener una visión global de las interacciones bacterianas 8, así como para realizar un seguimiento de la síntesis de bioproductos (por ejemplo, P. aeruginosa ramnolípido 7,8) dentro de un enjambre.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials table</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Amount</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagentsa:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAB Minimal Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare every ~4 weeks. Top to 1 L with nanopure H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td>2 g</td>
			<td>Not used in P. aeruginosa tendril formation studies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td>9 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>3 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH8014</td>
			<td>3 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 x 6H2O solution (198 g/L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33</td>
			<td>1 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 x 2H2O solution (14 g/L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79</td>
			<td>1 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace metal solution (see below)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>1 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Metal Solution:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Top to 1 L with nanopure H2O. Maintain in a glass bottle, stirring and covered with foil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaSO4 x 2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255548</td>
			<td>200 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnSO4 x H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7634</td>
			<td>20 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4 x 5H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C493</td>
			<td>20 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z4750</td>
			<td>20 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6768</td>
			<td>10 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaMoO4 x 2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6646</td>
			<td>10 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A74</td>
			<td>5 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7002</td>
			<td>200 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTT Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare as needed. Top to 100 ml with nanopure H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1 M solution (adjust to pH 8.0)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0234</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 8.0 and filter sterilize (0.2 &#956;m pore).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4, 1 M solution (adjust to pH 7.6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td>0.1 ml</td>
			<td>Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 7.6 and filter sterilize (0.2 &#956;m pore).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65</td>
			<td>0.8 ml</td>
			<td>Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Filter sterilize (0.2 &#956;m pore).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casitone</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>225930</td>
			<td>1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional Reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>240230</td>
			<td>2 % (wt/vol)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td>30 mM for overnight broth cultures; 12 mM for swarm media</td>
			<td>Prepare a 1.2 M filter sterilized stock solution in nano pure H2O. Add to media after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids (CAA)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J851</td>
			<td>0.10 % (wt/vol)</td>
			<td>Recommended for P. aeruginosa tendril formation studies. Add to media prior to autoclaving.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Noble</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5431</td>
			<td>0.45 % (wt/vol)</td>
			<td>Preferred Noble agar for P. aeruginosa surface motility studies. Add to media prior to autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Noble&#160;</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>10907</td>
			<td>1.50 % (wt/vol)</td>
			<td>Used in M. xanthus surface motility studies. Not recommended for P. aeruginosa motility studies. Add to media prior to autoclaving.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Granulated</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423</td>
			<td>0.60 % (wt/vol)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Higgins Waterproof Black India Ink</td>
			<td>Higgins</td>
			<td>HIG44201</td>
			<td>0.50 % (vol/vol)</td>
			<td>Mix ink with inoculum to test swarm media surface moisture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO&#174; 64 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-11346</td>
			<td></td>
			<td>Use 4 &#956;l (for P. aeruginosa) or 8 &#181;l (for M. xanthus) of SYTO&#174; 64 per 100 ml of molten agar (added after autoclaving).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relevant Materials and Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, sterile, 150 mm x 15 mm (Dia.x H)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, sterile, 100 mm x 15 mm (Dia.x H)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, sterile, 60 mm x 15 mm (Dia.x H)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Vivo Xtream</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use for the macroscopic imaging of surface motility studies. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker MI software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">aSee MSDS of reagents for handeling and disposal information.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays

La motilidad superficie bacteriana, tales como enjambre, se examina comúnmente en el laboratorio usando los ensayos de placa que requieren concentraciones específicas de agar y, a veces inclusión de nutrientes específicos en el medio de crecimiento. La preparación de tales medios y condiciones de crecimiento explícitas superficie sirve para proporcionar las condiciones favorables que permiten no sólo el crecimiento de bacterias, pero la motilidad coordinada de las bacterias más de estas superficies dentro de películas líquidas delgadas. La reproducibilidad de la placa de enjambre y otros ensayos de placa de motilidad superficie puede ser un gran desafío. Especialmente para los más &quot;enjambres templados&quot; que muestran la motilidad sólo dentro de los rangos de agar de 0,4% -0,8% (p / v), cambios menores en el protocolo o entorno de laboratorio puede influir mucho en los resultados del ensayo de enjambre. &quot;Humectabilidad&quot;, o contenido de agua en la interfase líquido-sólido-aire de estos ensayos de placa, a menudo es una variable clave para ser controlado. Un reto adicional en la evaluación de la enjambrazón es cómo cuantificar observed diferencias entre dos (o más) experimentos. A continuación te detallamos un protocolo de dos fases versátil para preparar y ensayos imagen enjambre. Incluimos directrices para eludir los retos comúnmente asociados con la preparación de medios de ensayo de enjambre y cuantificación de los datos de estos ensayos. En especial, demostramos nuestro método utilizando bacterias que expresan los periodistas genéticas fluorescentes o bioluminiscentes como proteína verde fluorescente (GFP), luciferasa (operón lux), o manchas celulares para permitir imágenes ópticas-time lapse. Además, demuestran la capacidad de nuestro método para rastrear competir especies que pululan en el mismo experimento.

La variación en la placa preparación puede influir mucho en la motilidad enjambre. El curado o secado tiempo tras verter sobre medio de agar fundido afecta la delgada película de líquido presente en ensayos de movilidad de superficie y la motilidad bacteriana a través del tiempo. Los cambios en la composición de nutrientes también afectan enjambre de varias bacterias. La Figura 1A muestra un efecto a corto plazo de tiempo de secado sobre difusión de tinta de la India y difusión de un inóculo inicial de Bacillus subtilis 11. La Figura 1B muestra el efecto del tiempo de secado y espectáculos Figura 1C los efectos del sulfato de amonio [(NH4) 2 SO 4] sobre el desarrollo zarcillo posterior por un enjambre P. aeruginosa 5. Datos cuantificables se pueden obtener a partir de imágenes de punto final de la motilidad superficie utilizando múltiples estrategias de formación de imágenes. La figura 2 muestra los resultados de crecimiento de superficie representativos de <em&gt; P. su imagen GFP fluorescencia asociada aeruginosa enjambre y; B. subtilis enjambre y su imagen bioluminiscencia asociada; y la imagen de fluorescencia rojo asociado de SYTO crecimiento superficie Myxococcus xanthus y las células teñidas-64. La expansión de adquisición de datos más allá de la inspección y de formación de imágenes de los resultados de punto final permite el estudio del comportamiento dinámico (s) para las bacterias que crecen en la superficie. Figura 3 7 muestra un ejemplo de P. aeruginosa agrupan (fotografiada para las células que expresan GFP) y su producción ramnolípido asociado (imagen usando Rojo Nilo mancha de lípidos) -la cuantificación de los datos de estas imágenes también se muestra para mostrar la velocidad de expansión de P. aeruginosa enjambre. Video 1 muestra un time-lapse de B. subtilis enjambre imagen usando la luminiscencia de una cepa expresando lux. Video 2 8 muestra un time-lapse de P. aeruginosa </em&gt; Typhimurium (verde-expresando GFP) y Salmonella enterica serovar (lux-rojo expresar) en un ensayo de enjambre competitivo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52338/52338fig1.jpg" /> Figura 1: Ejemplos de factores en la preparación de ensayo de la motilidad superficie que afectan los resultados de ensayo Efecto de (A) el tiempo de secado agar en humedad de la superficie de agar y difusión de inóculo para B.. subtilis (Ref 8), (B) de tiempo de secado agar en P. aeruginosa agrupan (Reproducido de la referencia 5 con permiso), y (C) la presencia o ausencia de sulfato de amonio en P. aeruginosa enjambre y formación zarcillo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52338/52338fig2.jpg" /> Figura 2: Alternaticinco enfoques para el crecimiento superficial de imágenes y la motilidad de las bacterias usando un Bruker imagen (derecha) Estación de imágenes Bruker. Side imagen de la cara de una cámara (izquierda) por y mostrando (A) P. aeruginosa expresar (B) B. GFP-fotografiado usando los ajustes de fluorescencia verde, subtilis expresan bioluminiscencia lux reportero-fotografiado usando la configuración de luminiscencia, y (C) M. xanthus teñidas con SYTO 64 Imaged-utilizando la configuración de Red Fluorescencia II. Ver Tabla 2 para ajustar detalles. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52338/52338fig3.jpg" /> Figura 3:. El análisis cualitativo y cuantitativo de un ensayo de la motilidad superficie (A) Time-lapse análisis de la distribución de la densidad celular, la producción ramnolípido (mancha de lípidos Rojo Nilo imagen usando la fluorescencia rojaYo ajustes; barra de escala = 15 mm), y (B) la cuantificación de la tasa de expansión a partir de imágenes de distribución de la densidad celular de un P. enjambre aeruginosa. (Reproducido de la referencia 6 con el permiso.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52338/52338vid1.mov" target="_blank">Video 1.</a> Time-lapse de una B. subtilis enjambre. B. subtilis expresar lux y grabado con los ajustes de luminiscencia. Ver Tabla 2 para ajustar detalles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52338/52338vid2.mov" target="_blank">Video 2.</a> la competencia entre especies visualizado por time-lapse. Enjambres de P. aeruginosa (verde; expresando GFP y grabado con los ajustes de fluorescencia verde) y S. enterica serovar Typhimurium (rojo; exprescantar lux y grabado con los ajustes de luminiscencia). Ver Tabla 2 para ajustar detalles. (Reimpresión con permiso de la Ref. 7) <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> P. aeruginosa </td><td> P. aeruginosa estudios de formación zarcillo </td><td> B. subtilis </td><td> M. xanthus </td></tr><tr><td> Caldo durante la noche medios de cultivo </td><td> FAB más 30 mM de glucosa </td><td> FAB más 30 mM de glucosa </td><td> LIBRAS </td><td> CTT </td></tr><tr><td> Caldo durante la noche la temperatura de incubación cultura </td><td> 37 ° C </td><td> 37 ° C </td><td> 37 ° C </td><td> 30 horas a 30 ° C </td></tr><tr><td> Medios Swarm </td><td> FAB </td><td> FAB menos (NH 4) 2 SO 4 </td><td> 2% (peso / vol) LB </td><td> CTT </td></tr><tr><td>Medios Swarm: componentes adicionales </td><td> 12 mM de glucosa una </td><td> 10% (p / v) CAA, 12 mM de glucosa una </td><td> n / a </td><td> SYTO® 64 un </td></tr><tr><td> Tipo de Agar </td><td> Agar, Noble </td><td> Agar, Noble </td><td> Agar granulado </td><td> Agar, Noble Affymetrix </td></tr><tr><td> Agar concentración (peso / vol) </td><td> 0,45% </td><td> 0,45% </td><td> 0,60% </td><td> 1,50% </td></tr><tr><td> Tamaño de la placa Swarm </td><td> 60 mm </td><td> 60 mm </td><td> 100 mm </td><td> 150 mm </td></tr><tr><td> Volumen de los medios por placa </td><td> 7,5 ml </td><td> 7,5 ml </td><td> Vertido Mano </td><td> Vertido Mano </td></tr><tr><td> Ajuste del soporte Swarm método / secado </td><td> Capucha; placas descubiertas </td><td> Capucha; placas descubiertas </td><td> Mesas de trabajo; placas cubiertas </td><td> Mesas de trabajo; placas cubiertas </td></tr><tr><td> Ajuste del soporte Swarm / tiempo de secado </td><td> 30 min </td><td> 30 min </td><td> Durante la noche (20 -24 h) </td><td> Durante la noche (20 -24 h) </td></tr><tr><td> Enjambre de la temperatura de incubación de ensayo </td><td> 30 o 37 ° C </td><td> 30 ° C </td><td> 37 ° C </td><td> 30 ° C </td></tr><tr><td> La incubación para la imagen de lapso de tiempo </td><td> 30 ° C durante al menos 4 hr </td><td> 30 ° C durante al menos 4 hr </td><td> 37 ° C durante 2 horas </td><td> RT durante 12 horas </td></tr><tr><td> Time-lapse longitud de captura </td><td> 24 hr </td><td> 24 hr </td><td> 10 hr </td><td> 66 hr </td></tr><tr><td> Ajuste Time-lapse </td><td> 1 cuadro / 10 min </td><td> 1 cuadro / 10 min </td><td> 1 cuadro / 6 min </td><td> 1 cuadro / 10 min </td></tr><tr><td colspan="3"> un añadido después de la esterilización en autoclave. </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1:. Especificaciones para Surface Motilidad Preparación muestra Incluye superficieespecificaciones de preparación de ensayo de la motilidad de P. aeruginosa, B. subtilis, y M. xanthus. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Señal </td><td> La fluorescencia verde </td><td> Red de fluorescencia I </td><td> Red Fluorescencia II </td><td> Luminiscencia </td></tr><tr><td> La proteína o el tinte </td><td> Proteína de fluorescencia verde (GFP) </td><td> proteína mCherry o Rojo Nilo ramnolípido mancha </td><td> SYTO® 64 </td><td> Luciferasa de operón lux </td></tr><tr><td> Longitud de onda de excitación (nm) </td><td> 480 ± 10 </td><td> 540 ± 10 </td><td> 590 ± 10 </td><td> De Descuento </td></tr><tr><td> Longitud de onda de emisión (nm) </td><td> 535 ± 17.5 </td><td> 600 ± 17,5 </td><td> 670 ± 17.5 </td><td> Sin filtro </td></tr><tr><td> Tiempo de exposición (s)</td><td> 30 </td><td> 60 </td><td> 60 </td><td> 240 </td></tr><tr><td> parada f- </td><td> 4.0 </td><td> 4.0 </td><td> 2.5 </td><td> 1.1 </td></tr><tr><td> FOV (mm) </td><td> 190 </td><td> 190 </td><td> 140 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> Plano focal (mm) </td><td> 27.5 </td><td> 27.5 </td><td> 12.2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Agrupación (píxeles) </td><td> Ninguno </td><td> 2 x 2 </td><td> Ninguno </td><td> 8 x 8 </td></tr></tbody></table> Tabla 2: Imágenes Especificación especificaciones de la estación de formación de imágenes Bruker para fluorescencia roja y verde, y las imágenes de luminiscencia de crecimiento de superficie bacteriana..

Watch this Scientific Journal Video about Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays at JoVE.com

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Preparación, Imaging, y cuantificación de la superficie bacteriana Motilidad ensayos

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

preparation-imaging-quantification-bacterial-surface-motility

Research

JoVE Journal

Biology

23.6K vistas.  University of Notre Dame. Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques. 

Video: Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Investigación

Biología

Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility in isolated segments of guinea pig distal colon. The complete system consists of a computer, video camera, illuminated organ bath, peristaltic and heated water bath circulating pumps, and custom GIMM software to record and analyze data. Compared with traditional methods of monitoring colonic peristalsis, the GIMM system allows for continuous, quantitative evaluation of motility. The guinea pig distal colon is bathed in warmed, oxygenated Krebs solution, and fecal pellets inserted in the oral end are propelled along the segment of colon at a rate of about 2 mm/sec. Movies of the fecal pellet proceeding along the segment are captured, and the GIMM software can be used track the progress of the fecal pellet. Rates of propulsive motility can be obtained for the entire segment or for any particular region of interest. In addition to analysis of bolus-induced motility patterns, spatiotemporal maps can be constructed from captured video segments to assess spontaneous motor activity patterns. Applications of this system include pharmacological evaluation of the effects of receptor agonists and antagonists on propulsive motility, as well as assessment of changes that result from pathophysiological conditions, such as inflammation or stress. The guinea pig distal colon propulsive motility assay, using the GIMM system, is straightforward and simple to learn, and it provides a reliable and reproducible method of assessing propulsive motility.

Gastrointestinal Motility Monitor GIMM

Evaluation of colonic motility in the guinea pig distal colon with the Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM) is a straightforward and simple to learn approach to quantitatively evaluate propulsive motility in the gastrointestinal tract.

Monitor de la motilidad gastrointestinal (GIMM)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

Avidez detección basada en la interacción extracelular (AVEXIS) para la detección escalable de extracelular de baja afinidad interacciones ligando-receptor

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

Super-resolución de imagen de la maquinaria de división bacteriana

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Lectura granel simple de Digital ácidos nucleicos Cuantificación ensayos

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

Dinámica de oligomerización de receptores de superficie celular en células vivas mediante la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total combinada con análisis de número y brillo

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations of bacteria move over large distances in characteristic tendril-shaped communities over the course of hours. Swarming is sensitive to several factors including medium moisture, humidity, and nutrient content. In addition, the collective stress response, which is observed in P. aeruginosa that are stressed by antibiotics or bacteriophage (phage), repels swarms from approaching the area containing the stress. The methods described here address how to control the critical factors that affect swarming. We introduce a simple method to monitor swarming dynamics and the collective stress response with high temporal resolution using a flatbed document scanner, and describe how to compile and perform a quantitative analysis of swarms. This simple and cost-effective method provides precise and well-controlled quantification of swarming and may be extended to other types of plate-based growth assays and bacterial species.

We detail a simple method to produce high-resolution time-lapse movies of Pseudomonas aeruginosa swarms that respond to bacteriophage (phage) and antibiotic stress using a flatbed document scanner. This procedure is a fast and simple method for monitoring swarming dynamics and may be adapted to study the motility and growth of other bacterial species.

Imágenes de lapso de tiempo de enjambres bacterianos y la respuesta colectiva al estrés

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and cell debris, through bulk endocytosis. This pathway plays an essential role in a variety of cellular processes, including the regulation of immune responses and cancer cell metabolism. Given this importance in biological function, examining cell culture conditions can provide valuable information by identifying regulators of this pathway and optimizing conditions to be employed in the discovery of novel therapeutic approaches. The study describes an automated imaging and analysis technique using standard laboratory equipment and a cell imaging multi-mode plate reader for the rapid quantification of the macropinocytic index in adherent cells. The automated method is based on the uptake of high molecular weight fluorescent dextran and can be applied to 96-well microplates to facilitate assessments of multiple conditions in one experiment or fixed samples mounted onto glass coverslips. This approach is aimed at maximizing reproducibility and reducing experimental variation while being both time-saving and cost-effective.

Automated assays using multi-well microplates are advantageous approaches for identifying pathway regulators by allowing the assessment of a multitude of conditions in a single experiment. Here, we have adapted the well-established macropinosome imaging and quantification protocol to a 96-well microplate format and provide a comprehensive outline for automation using a multi-mode plate reader.

Imágenes y análisis automatizados para la cuantificación de macropinosomas marcados fluorescentemente

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can be used to visualize and quantify competitive interactions between different bacterial strains at the single-cell level. The protocol described here provides methods for advanced approaches in slide preparation on both upright and inverted epifluorescence microscopes, live-cell and time-lapse imaging techniques, and quantitative image analysis using the open-source software FIJI. The approach in this manuscript outlines the quantification of competitive interactions between symbiotic Vibrio fischeri populations by measuring the change in area over time for two coincubated strains that are expressing different fluorescent proteins from stable plasmids. Alternative methods are described for optimizing this protocol in bacterial model systems that require different growth conditions. Although the assay described here uses conditions optimized for V. fischeri, this approach is highly reproducible and can easily be adapted to study competition among culturable isolates from diverse microbiomes.

This manuscript describes a method for using single-cell fluorescence microscopy to visualize and quantify bacterial competition in coculture.

Cuantificación de la competencia interbacteriana utilizando imágenes de fluorescencia unicelular

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...

Visualizing Bacterial Motility Based on a Color Reaction

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or dissemination of many pathogenic species. Therefore, it is important to detect bacterial motility. Bacterial growth conditions, such as oxygen, pH, and temperature, can affect bacterial growth and the expression of bacterial flagella. This can lead to reduced motility or even loss of motility, resulting in the inaccurate evaluation of bacterial motility. Based on the color reaction of 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) by intracellular dehydrogenases of living bacteria, TTC was added to traditional semisolid agar for bacterial motility detection. The results showed that this TTC semisolid agar method for the detection of bacterial motility is simple, easy to operate, and does not involve large and expensive instruments. The results also showed that the highest motility was observed in semisolid medium prepared with 0.3% agar. Compared with the traditional semisolid medium, the results are easier to evaluate and more accurate.

Here, we present a protocol to detect bacterial motility based on a color reaction. Key advantages of this method are that it is easy to evaluate and more accurate, and does not require specialized equipment.

Visualización de la motilidad bacteriana basada en una reacción de color

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or ...