El protocolo rastrea simultáneamente las respuestas de enjambre bacteriano a diferentes concentraciones de inductores en un agar semisólido. Esto se logra de una manera rentable. Esta técnica de cribado de alto rendimiento niega la necesidad de agar con varias concentraciones de inductores para observar las respuestas microquimiotácticas.
La técnica está diseñada para el cribado de fármacos y también para observar las respuestas de SD del micropatógeno. Además, se puede utilizar para estudiar microrespuestas a varias señales bioquímicas en el huésped humano. Este método puede proporcionar información sobre la quimiotaxis bacteriana.
Las bacterias responderán a varias concentraciones de atrayentes químicos conocidos como quimiotaxis positiva o repelentes químicos conocidos como quimiotaxis negativa. Una configuración cuidadosamente preparada es esencial para evitar variaciones entre el ángulo de gel de la capa inferior para evitar el problema de reproducibilidad. Para comenzar, etiquete placas de Petri cuadradas de 13 por 13 centímetros con manchas y nombres de inductores.
Luego apoye los platos sobre el borde de las tapas. Agregue la solución de arabinosa al medio de capa inferior caliente. Agregue 40 mililitros de medio de capa inferior cálida.
Deje que el medio de la capa inferior se cure sin tapar durante una hora dentro de una campana de flujo laminar sin ser molestado. Una vez que la capa inferior esté completamente solidificada, retire las tapas y coloque las placas de Petri dentro de una campana de flujo laminar. Agregue 40 mililitros de medio de capa superior caliente utilizando un filtro de pipeta motorizado.
Cure las placas de doble capa cubiertas y sin perturbaciones durante una hora, luego guárdelas a cuatro grados centígrados durante 24 horas. Coloque el papel A4 marcado debajo de una placa de gradiente bien solidificada. Empuje el lado más ancho de la punta de una pipeta de 100 microlitros en la superficie media semisólida en la posición marcada y presione la punta de la pipeta hasta que llegue a la parte inferior del medio de la capa superior.
Cuando la punta toque la parte inferior, deje de aplicar cualquier fuerza vertical a la punta y gire suavemente la punta para aislar el contenido del pozo cilíndrico. Mueva horizontalmente la punta de la pipeta a lo largo de una pequeña distancia para permitir el flujo de aire en el lugar estrecho reservado. Presione la punta con el dedo índice para bloquear el flujo de gas dentro de la punta.
Tire de la punta hacia afuera verticalmente, manteniendo el contenido del pozo en la punta mientras lo extrae. Agregue 80 microlitros de la cultura de crecimiento durante la noche en cada pozo. Saque las placas de enjambre de la incubadora una a la vez cada 12 horas y colóquelas en el sistema de imágenes en gel.
Seleccione el modo de imagen en gel, exponga la placa de enjambre a la luz blanca y ajuste la distancia focal para obtener una vista clara de los enjambres. Mejore el brillo de los enjambres para una observación precisa ajustando el tiempo de exposición a 300 milisegundos. Ajuste el umbral para minimizar la interferencia de la luz de fondo.
Guarde el archivo de imagen para su posterior análisis. Registre el tiempo de imagen, el tipo de inductor, la orientación del degradado y las deformaciones en un archivo txt. Haga clic en Procesar y, a continuación, en Sombras para mejorar la nitidez de la imagen.
Haga clic en Procesar seguido de Lote para procesar la imagen. A continuación, procese una imagen como referencia haciendo clic en Proceso, Sombras y Sur. Haga clic en Proceso, Lote, Macro para abrir la ventana Proceso por lotes.
Busque los comandos que se muestran en la ventana. Escriba la dirección de carpeta de las imágenes originales en la dirección del archivo de salida haciendo clic en Procesar en la ventana Proceso por lotes. Utilice la herramienta de trazado de varitas para seleccionar enjambres individualmente y haga doble clic en la herramienta de trazado de varitas para ajustar la tolerancia hasta que la línea generada se ajuste correctamente al límite de enjambre.
Haga clic en Analizar, luego en Medir para exportar el valor del área. E.coli K12 YdeH se probó en placas de gradiente de arabinosa utilizadas para demostrar el proceso de enjambre de superficie con superposición entre pozos adyacentes. Una placa con tres pozos de prueba permitió la formación de límites no superpuestos.
La motilidad del enjambre de P.aeruginosa PAO1 YdeH se promovió con una mayor concentración de arabinosa a partir de la concentración más baja, pero se restringió gradualmente con concentraciones más altas de arabinosa. Las cepas de tipo salvaje K12 de E.coli probadas en placas de gradiente de resveratrol dentro del rango de concentración de cero a 400 microlitros mostraron una restricción modesta de la motilidad del enjambre con una concentración creciente de resveratrol. Las áreas de enjambre fueron cuantificadas por el software ImageJ.
La curva de enjambre mostraba las múltiples respuestas de concentración. La parte más crucial de este procedimiento es la fabricación de una placa de enjambre de doble capa con un rango de concentración específico de inductores. Este método permite a los investigadores investigar el enjambre de superficie inducido dentro de un rango de concentración específico y cuantificar los efectos de otros inductores y componentes en el enjambre.
