The authors would like to thank Dr. George Gittes for advice and expertise throughout this study. SSL was supported by an American Heart Association fellowship (11POST7330002). Further to this SSL and this study was supported by an NIDDK Mentored Research Scientist Development Award (DK096996) and by the Children&#8217;s Hospital of Pittsburgh.

NOTA: La Universidad de Pittsburgh Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión aprobó todos los experimentos. 1. Elaboración de Instrumentos Ultrasonido-microinyección y embriones <ol><li> Establecer el escenario, montaje, y la sonda (Figura 1), así como los instrumentos quirúrgicos (Figura 2). Solución salina tamponada (PBS) Place solución de fosfato (pH 7,4) en un baño a 37 ° C el calentamiento. Llenar aguja de microinyección completamente con aceite mineral, usando 1 ml jeringa conectada a un segundo G aguja flexible 25, a través de su base. </li><li> Fijar la aguja en la rotación de montaje del brazo, y la aguja vacía de solución de aceite mineral. Vuelva a llenar con 2,5 l de solución TL. Asegúrese de que no hay burbujas de aire dentro de la aguja de inyección. Gire el brazo de la aguja hacia la pared, fuera de los escenarios. </li><li> Anestesiar la madre embarazada en la cámara de anestesia mediante infusión continua de isoflurano. Cuando la madre está inconsciente, la transferencia de la anestesia para tubo nariz colocada en el caudal lado del escenario, y el lugar madre en posición supina, con el hocico en el tubo de la nariz para permitir la continuación de un estado totalmente anestesiado. </li><li> Extremidades de cinta en ángulos de 45 °, o con las manos y los pies descansados ​​y posicionados overtop ECG pestañas / monitor de temperatura. Es importante que la presa embarazada se monitoriza continuamente para asegurar que la anestesia es suficiente y que la pomada en aplicada a los ojos para reducir el secado. </li><li> Aplique el producto a través de la eliminación del vello inferior del abdomen de la madre, limpie suavemente con hisopos de algodón seco, y luego de nuevo con un 70% hisopos de algodón con etanol saturado para eliminar cualquier exceso de producto y el cabello. Asegúrese de limpiar la piel abdominal fuera de todo el pelo en el sitio de la incisión (Figura 3). </li><li> Realice una laparotomía en la madre embarazada utilizando pinzas y tijeras quirúrgicas finas. Tenga cuidado de no cortar ninguna vasos principales u órganos viscerales. Hacer primero, incisión recta de epidermis 1,5-2 cm por encima de la vagina y continuar cortar hacia las costillas para approximately 2-3 cm. Exponer la membrana subcutánea, busque la línea alba (&quot;línea blanca&quot;) (Figura 3), y corte paralela a la incisión inicial, a lo largo de la misma longitud, para exponer interno órganos viscerales y sáculos uterinos. </li></ol> 2. Extracción de embriones <ol><li> Utilice bastoncillos de algodón de 6 pulgadas de maniobrar madre y embriones. Presione suavemente (no la fuerza) en la piel con aplicador para manipular primer embrión de la apertura de la incisión. Después de la extracción del primer sáculo embrión, suave y lentamente tire del resto del cuerno uterino a través y hacia el exterior de la madre. Evite tirar intestino u otros órganos a través de la incisión en esta etapa. </li><li> Cuantificar los embriones y coloque suavemente cuerno uterino izquierdo de nuevo en madre. Entonces comenzar a colocar el cuerno uterino derecho de nuevo en madre a partir de la más lejana sáculo embrión de la vagina en el cuerno y se mueve hacia abajo. Continúe hasta que sólo dos embriones permanecen expuestos (Fifigura 4). Por último, los embriones de posición en una columna anterior y paralela a la línea de incisión, siendo consciente de no cortar la circulación uterina. </li><li> Coloque bloques de arcilla y posición entre los brazos y el cuerpo, así como las piernas y la cola. Asegúrese de que las superficies de arcilla son aproximadamente la altura de laparotomía. Moje la placa de Petri fenestrado con 37 ° C PBS. </li><li> Agarre extienden fórceps con la mano derecha y el plato de Petri fenestrado con la mano izquierda (fenestración paralelo a los embriones) y llevar cerrado fórceps ~ 5-cm a través de la fenestración, desde la parte superior de la placa de Petri. Fórceps abierto completamente sin desgarrar la malla fenestración. </li><li> Maniobra manos por encima de los embriones y enfocar la vista en los dos sáculos embrión. Sin (o poco) tocando sáculos con mallado fenestración o fórceps, deslice a través de ranura y fija una placa de Petri en el abdomen de la madre. Con pinzas todavía extendidos, manipular malla fenestrado para asentarlo en ambos lados y en la base de cada embrión (Figura 5 </strong&gt;) y tire de pinzas de apertura de hendidura. </li><li> Luego, coloque goma azul que contiene la pared en una placa de Petri, sin pellizcar o dañar embriones (Figura 6). Hacer bloques de arcilla estén equilibrando firmemente placa de Petri, embrión, y la pared que contiene goma. Por último, llenar el plato de Petri con 37 ° C PBS hasta que los embriones se sumergen por completo (Figura 6), mientras que el control de fugas en el mallado fenestrado. </li></ol> Procedimiento 3. Inyección <ol><li> Etapa de inyección inferior con la madre y embriones abajo utilizando la perilla de ajuste de nivel Z (Figura 1) y luego gire la aguja de inyección y montaje en brazo y se alinea directamente con sonda de ultrasonido, con ½ aguja cm a la izquierda y debajo de la punta de la sonda (Figura 7) . Empuje aguja-brazo (no de la aguja) 45 ° lejos de la sonda. Tenga cuidado de no golpear la punta de la aguja con la sonda plato o una ecografía. </li><li> Levante etapa de inyección de nuevo a la altura original, con ultrasonido pbata directamente encima de la sonda embriones debe estar sumergida ligeramente y dentro de 3-4 mm de tejido embrionario. Utilice X &amp; Y mandos de ajuste etapa (Figura 8) para modificar la posición del embrión / madre / etapa de localizar sistemáticamente el corazón embrionario de latir. </li><li> Directamente Centro de pantalla del ultrasonido observar un objetivo central negro marcador dibujado (*). Busque ventrículo izquierdo (preferible) o atrio utilizando los botones de ajuste etapa X &amp; Y (Figura 8) y luego subir o bajar del escenario con el botón giratorio en la etapa de posicionar objetivo inyección con precisión sobre el marcador central negro en la pantalla del ultrasonido. </li><li> Utilice la perilla de ajuste etapa X para mover embrión hacia la derecha, fuera de la pantalla del ultrasonido. Vuelva a colocar la aguja de microinyección y el brazo en su lugar, ½ cm de distancia de y 90 ° a la sonda de ultrasonido (Figura 7). </li><li> El uso de microinyección montaje mandos de ajuste (Figura 9C-G), aguja posición con la punta claramente alDiseñada con el marcador central. Ajustar el ángulo de inyección (usando perillas en la figura 9C y EG), y X, Y, Z y vectores de micro-aguja para asegurar punta de la aguja se centra en el plano correcto. Repliegue aguja de microinyección usando únicamente el mando de &quot;inyección&quot; (Figura 9F), cuidado de no ajustar otras dimensiones. </li><li> De nuevo, usando únicamente el ajuste fino perilla etapa movimiento embrión X de nuevo bajo la sonda, con la meta exactamente en el punto central de la pantalla del ultrasonido. Asegúrese de que el ventrículo izquierdo es ahora exactamente en la misma X, Y, y Z avión. </li><li> A continuación, con montaje sólo la perilla de &quot;inyección&quot; en la microinyección, perfore lentamente embrión con la aguja de microinyección y llevar lentamente la punta hacia el ventrículo izquierdo. Inyectar la totalidad de 2,5 l de solución TL en el ventrículo izquierdo o hasta que suena la señal vacías, mediante la celebración de &quot;vacío&quot; y pulsando &quot;llenar&quot; una vez (Figuras 2A y B). En este momentode la inyección observar una sombra que emana de la punta de la aguja que es el TL entrar en la cámara cardiaca (Figura 10). A la inversa, retraer rápidamente aguja de microinyección girar la &quot;inyección&quot; perilla (Figura 9F) en la microinyección se monta cuando la inyección se ha completado. </li><li> Continúa en el próximo embrión y repita este procedimiento para los embriones restantes que siguen esta serie de pasos y finalmente colocar los embriones finales de nuevo en el abdomen de la presa. Cambie la anestesia a la caja de la cámara y mover suavemente madre aquí durante 15 minutos desde el momento de la última inyección. </li></ol> 4. La recolección de embriones y Análisis <ol><li> Sacrificar presa a través de la dislocación cervical. Ampliar la laparotomía para eliminar fácilmente los cuernos uterinos de la madre. Mantener los embriones dentro de saco uterino. Coloque embriones en PBS enfriado. </li><li> Diseccionar embriones de saco uterino (si el tejido cobrar necesaria para el genotipado) y coloque todo el embrión in 4% paraformaldehído (PFA) durante la noche, y luego en el 30% de sacarosa durante la noche, se congele en criostato seccionar medio. A continuación, corte la criosección y colocarlo en portaobjetos para el análisis inmunohistoquímico. Opcionalmente, utilice toallitas para todo el montaje por deshidratación en el 100% de metanol, después de la fijación en el 4% PFA. </li><li> Para el análisis inmunohistoquímico colocar los cryosections en PBS para eliminar la OCT. Entonces bloquear las secciones con 10% de suero normal de burro durante 30 min. A continuación, agregue PECAM anticuerpo primario a dilución 1: 100 la noche a 4 ° C. Al día siguiente, se lavan los portaobjetos en PBT 3 veces durante 10 minutos cada uno y agregar burro anti rata 594 secundaria e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. NOTA: Esta es una técnica muy exigente que requiere la optimización y coordinación de la ecografía y la microinyección. Hay una curva de aprendizaje muy grande en relación con esta técnica y requiere cuatro a seis semanas de inyecciones mentor antes de que uno se convierte en dominio. </li></ol>

<ol>
	<li>Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+formation+of+microvasculature+in+the+developing+kidney.">Origins and formation of microvasculature in the developing kidney.</a> Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).</li><li>Sims-Lucas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Progenitors+Exist+within+the+Kidney+and+Lung+Mesenchyme.">Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme.</a> PloS one. 8 (6), e65993 (2013).</li><li>Dressler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+controls+and+cellular+behaviors+in+branching+morphogenesis+of+the+renal+collecting+system.">Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (5), 693-713 (2012).</li><li>Costantini, F., Kopan , R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+a+complex+organ:+branching+morphogenesis+and+nephron+segmentation+in+kidney+development.">Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development.</a> Dev Cell. 18 (5), 698-712 (2010).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+crosstalk+regulates+kidney+progenitor+cell+differentiation.">Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation.</a> Nat Cell Biol. 15 (9), 1035-1044 (2013).</li><li>Rymer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+blood+flow+and+oxygenation+drive+nephron+progenitor+differentiation.">Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).</li><li>Shah, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+mouse+blood+flow+and+oxygen+correlate+with+early+pancreatic+differentiation.">Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation.</a> Developmental biology. 349 (2), 342-349 (2011).</li><li>Andres, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB4+receptor+tyrosine+kinase+transgenic+mice+develop+glomerulopathies+reminiscent+of+aglomerular+vascular+shunts.">EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts.</a> Mech Dev. 120 (4), 511-516 (2003).</li><li>Wagner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+kidney+vascular+corrosion+casts+with+Nano-CT.">High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT.</a> Microsc Microanal. 17 (2), 215-219 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Anestesia Microinyección y marco de tiempo Con respecto a la anestesia de la madre, es esencial para mantener constante el flujo de aire (2-3 L / min) y a baja PSI. El flujo del sedante debe mantenerse a aproximadamente 1,75 a 2 L / min. Al mismo tiempo, los plazos en que las inyecciones se realizan deben ser monitoreados y controlados para con cada camada de cerca. Para cada camada el procedimiento de inyección debe mantenerse en 45 min. La importancia de este límite de tiempo es de suma...

Durante el desarrollo embrionario dos procesos discretos, pero simultáneas, vasculares tienen lugar: la angiogénesis, el proceso por el cual un recipiente crece de un vaso principal, y la vasculogénesis pre-existente, que es una formación de novo de los vasos a partir de progenitores endoteliales residenciales 1,2. Respectivamente, el primero es sinónimo de flujo de sangre, mientras que el último se cree que tener lugar en gran medida en ausencia de la misma. Simultáneamente a la formación de vasos sanguíneos, un proceso cíclico y dinámico de la síntesis renal de células progenitoras, la proliferación y la diferenciación comienza a desarrollarse en el día embrionario 9,5 (E9.5). En este punto la yema ureteral (UB) invade dorsal en los alrededores mesénquima metanéfrico (MM), y continúa hasta el nacimiento 3. Repetida de ramificación de la UB en condensación rápidamente mesénquima metanéfrico tapa comienza la formación de las unidades funcionales del riñón, la nefrona. Con cada nueva generación de la UB y nephron, las generaciones mayores son desplazados en regiones corticales y medulares interiores, donde luego se someten a más de maduración y diferenciación dentro de los entornos principalmente vascular-densos. Como se desprende de Dressler et al., 3, este proceso embriológico se precipita por la señalización inductiva, como diafonía entre UB y MM, y una miríada de factores extracelulares 3-6. Dos factores extracelulares recientemente investigados dentro del páncreas y los riñones incluyen el desarrollo de la tensión de oxígeno y el flujo sanguíneo 7,8. Este último será discutido en más detalle a continuación en relación con el desarrollo del riñón. Con el fin de exponer el papel inductivo que el flujo sanguíneo potencialmente juega en la diferenciación de células progenitoras nefrona, así como en otros procesos de organogénesis, métodos precisos y exactos de mapeo de flujo de sangre embrionaria es imprescindible. Los métodos alternativos para medir el flujo sanguíneo incluyen la prescripción de ultrasound de imágenes y resina yesos 9,10. En conclusión, estos modos se ha demostrado que ser inherentemente carente de su capacidad para dar a conocer simultáneamente yuxtaposiciones temporales y espaciales entre el flujo sanguíneo y diferenciación de células madre. Moldes de resina, por ejemplo, proporcionan un modelo válido de patrón embarcación dentro de los tejidos adultos, sin embargo en los vasos inmaduros, como con los puntos de tiempo embrionarias, los vasos son muy poco desarrollado y con goteras. Por lo tanto, la resina arroja fallar para mantener dentro de los vasos pequeños, a menudo porosa. Por estas aparentes obstáculos, entre otros, se optó por incorporar guiada por ultrasonido vivo intra-cardíacos lectina de tomate embrionario (TL) en microinyecciones en nuestras investigaciones sobre el desarrollo del riñón. En este procedimiento utilizamos una sonda de ultrasonido para guiar sincrónicamente una aguja montada micropipeta llena con 2,5 l de solución de TL en el ventrículo izquierdo de embriones de ratón en los puntos de E11.5, E13.5, E15.5, E17.5 y de tiempo. E170.5 es la última edad de desarrollo como las agujas no son lo suficientemente fuertes como para penetrar en el embrión más desarrollado. Las ventajas de este método de microinyección son abundantes. Microinyección guiada por ultrasonido permite la colocación precisa de una aguja de inyección dentro del ventrículo izquierdo embrionario, la expulsión pasiva y controlada de solución en el corazón de la animal, un daño mínimo al corazón y los tejidos circundantes, y la evitación de la insuficiencia cardiaca súbita y la muerte de la embrión antes de la perfusión de todo el cuerpo. Con el uso de un TL marcado con FITC, cualquier vasculatura perfundido mantendrá el marcador a lo largo de su membrana apical endotelial. En combinación con la inmunohistoquímica, utilizando Pecam (CD31, plaquetas molécula de adhesión celular endotelial) y varios otros marcadores vasculares, somos capaces de distinguir claramente entre los vasos perfundidos y un-perfundido, así como caracterizar cualquier tinción aberrante de los tejidos circundantes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="981">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:292px;">Company</td>
			<td style="width:164px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:225px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>022M4004V</td>
			<td>concentration 1:5000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pecam</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553370</td>
			<td>concentration 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FITC-Tomato Lectin</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>FL-1321</td>
			<td>concentration 2.5&#181;L / embryo</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat )</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>712-585-150</td>
			<td>concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjection Needle</td>
			<td>Origio Mid Atlantic Devices</td>
			<td>C060609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mineral Oil</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">BP26291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mL syringe</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">03-377-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Clay Blocks</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">HR4-326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical Tape</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">18-999-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">NC9763655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hair Removal Product</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">NC0132811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">11064-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Surgical Marking Pen</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">18000-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Right angle forceps (for hysterectomy)</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in utero intra-cardiac tomato-lectin injections on mouse embryos to gauge renal blood flow

La formación y la perfusión de desarrollar vasos sanguíneos renales (aparte de los glomérulos) han sido poco estudiados en gran medida. Como vasculatura se desarrolla a través de la angiogénesis (la cual es la ramificación fuera de los grandes vasos) y vasculogénesis (de novo la formación de vasos), técnicas de mapeo de perfusión como moldes de resina, vivo de imágenes de ultrasonido en y micro-disección se han limitado en la demostración de las relaciones íntimas entre estos dos procesos y estructuras renales en desarrollo en el embrión. Aquí se describe el procedimiento de In Utero intra-cardíacos guiadas por ultrasonido marcados con FITC microinyecciones lectina de tomate en embriones de ratón para medir la ontogenia de la perfusión renal. Tomate lectina (TL) se perfundió todo el embrión y los riñones cosechado. Los tejidos fueron co-teñidos para diversas estructuras renales que incluyen: progenitores nefrona, estructuras nefrona, el epitelio uretral y la vasculatura. A partir de E13.5 vasos de gran calibre se perfundieron, sin embargo periféricavasos permanecieron no perfundido. Por E15.5 y E17.5, pequeños vasos periféricos, así como glomérulos comenzado a ser perfundido. Esta técnica experimental es fundamental para estudiar el papel de la vasculatura y el flujo sanguíneo durante el desarrollo embrionario.

Formación Vascular precede flujo en el desarrollo del riñón Una mayoría de tejido embrionario (incluyendo el riñón) contiene una vasculatura densa (ambos no perfundido y perfundidos), incluso en los primeros puntos de tiempo embrionarias. Para un mejor calibre y analizar el flujo de sangre dentro del riñón en desarrollo se utilizó un método de In Utero microinyecciones intracardiaco embrionarias. Con el uso de un ultrasonido de alta resolución para identificar el corazón embriona...

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In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

En Utero Inyecciones intra-cardiaca-lectina de tomate en embriones de ratón para medir el flujo sanguíneo renal

The formation and perfusion of developing renal blood vessels (apart from glomeruli) are greatly understudied. As vasculature develops via angiogenesis ...

in-utero-intra-cardiac-tomato-lectin-injections-on-mouse-embryos-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

9.6K vistas.  Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC. This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

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Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or &#945;v&#946;3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Here, we present a protocol to inject ultrasound microbubble contrast agents into living, isolated late-gestation stage murine embryos. This method enables the study of perfusion parameters and of vascular molecular markers within the embryo using contrast-enhanced high-frequency ultrasound imaging.

Imágenes de contraste en embriones de ratón Uso de alta frecuencia de ultrasonido

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex Utero electroporación y organotípicos rebanada Cultura de ratón Hipocampo Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

Análisis cuantitativo de la expresión de la proteína para el Estudio de la especificación del linaje de ratón de preimplantación de embriones

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Deficitaria y en el enfoque de ganancia de función de investigar la célula destino temprano Determinantes de preimplantación embriones de ratón

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

Los estudios de estructura-función en las células madre embrionarias de ratón Usando mediada por recombinasa Cambio de Cassette

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualización de la placa notocordal en embriones de ratón Gastrulating con microscopía electrónica e inmunofluorescencia de Monte todo y nodo

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

Un método In Vivo para el estudio de integridad de barrera Hematotesticular ratón

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). This is a critical process that occurs throughout the lifespan of organisms, and disruption of the molecular pathways involved during embryogenesis can have catastrophic long-term consequences. For a multitude of reasons, zebrafish (Danio rerio) has become a model organism to study hematopoiesis. Zebrafish embryos develop externally, and by 7 days postfertilization (dpf) have produced most of the subtypes of definitive blood cells that will persist for their lifetime. Assays to assess the number of hematopoietic cells have been developed, mainly utilizing specific histological stains, in situ hybridization techniques, and microscopy of transgenic animals that utilize blood cell-specific promoters driving the expression of fluorescent proteins. However, most staining assays and in situ hybridization techniques do not accurately quantitate the number of blood cells present; only large differences in cell numbers are easily visualized. Utilizing transgenic animals and analyzing individuals with fluorescent or confocal microscopy can be performed, but the quantitation of these assays relies on either counting manually or utilizing expensive imaging software, both of which can make errors. Development of additional methods to assess blood cell numbers would be economical, faster, and could even be automated to quickly assess the effect of CRISPR-mediated genetic modification, morpholino-mediated transcript reduction, and the effect of drug compounds that affect hematopoiesis on a large scale. This novel assay to quantitate blood cells is performed by dissociating whole zebrafish embryos and analyzing the amount of fluorescently labelled blood cells present. These assays should allow elucidation of molecular pathways responsible for blood cell generation, expansion, and regulation during embryogenesis, which will allow researchers to further discover novel factors altered during blood diseases, as well as pathways essential during the evolution of vertebrate hematopoiesis.

This assay is a simple method to quantitate hematopoietic cells in developing embryonic zebrafish. Blood cells from dissociated zebrafish are subjected to flow cytometry analysis. This allows the detection of blood defects in mutant animals and after genetic modification.

Uso de la citometría de flujo para detectar y cuantificar la formación de sangre alterada en el pez cebra en desarrollo

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

Fundición vascular de pulmones de ratón postnatales tempranos y adultos para imágenes micro-CT

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. Platforms have been recently developed for highly robust and prolonged ex utero culture of mouse embryos from egg-cylinder stages until advanced organogenesis. These platforms enable appropriate and faithful development of pregastrulating embryos (E5.5) until the hind limb formation stage (E11). Late gastrulating embryos (E7.5) are grown in rotating bottles in these settings, while extended culture from pregastrulation stages (E5.5 or E6.5) requires a combination of static and rotating bottle cultures. In addition, sensitive regulation of O2 and CO2 concentration, gas pressure, glucose levels, and the use of a specific ex utero culture medium are critical for proper embryo development. Here, a detailed step-by-step protocol for extended ex utero mouse embryo culture is provided. The ability to grow normal mouse embryos ex utero from gastrulation to organogenesis represents a valuable tool for characterizing the effect of different experimental perturbations during embryonic development.

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

An enhanced platform for whole-embryo culture allows continuous and robust ex utero development of postimplantation mouse embryos for up to six days, from pregastrulation stages until advanced organogenesis. In this protocol, we detail the standard procedure for successful embryo culture using static plates and rotating bottle systems.