Hola a todos, mi nombre es Dr.Bipasha Bose. Trabajo como profesor asociado y a cargo en el Centro de Células Madre y Medicina Regenerativa, Centro de Investigación Yenepoya, Universidad Yenepoya, Mangalore, India. Ahora vamos a demostrar cómo detectar la presencia de ROS es decir, especies reactivas de oxígeno"en los cultivos vivos de las superficies oculares del ratón que han estado expuestas a varias dosis de radiación ultravioleta-C.
La ventaja de esta técnica es que aquí podemos detectar simultáneamente la presencia de especies reactivas de oxígeno, células vivas y muertas, sin necesidad de tener células Vester. El principio de esta técnica reside esencialmente en la permeabilidad celular viva del tinte DCFDA. DCFDA es un tinte incoloro permeante de células vivas, que durante el estrés oxidativo es actuado por las oxidasas intracelulares y se convierte en DCF fluorescente verde.
Por lo tanto, la florescencia verde nos permite detectar la presencia de especies reactivas de oxígeno en las células vivas. Por otro lado, el yoduro propidium es un tinte permeante de células muertas exclusivamente que fluoriza de color rojo. Es un tinte intercalante de doble cadena de ADN.
Sin embargo, el tinte Hoechst es permeante tanto para las células vivas como muertas. Es una mancha nuclear de color azul. Por lo tanto, este es un método muy simple en el que podemos detectar la presencia de especies reactivas de oxígeno en cultivos a largo plazo de una manera dependiente del tiempo junto con la evaluación de células muertas.
Punto de placa dos millones de células por 35 milímetros platos de cultivo. Las células que estamos aplicando son las células de la superficie ocular del ratón. Elimine el volumen máximo de medios de cada uno de los platos de cultivo celular.
Deje atrás alrededor de 500 microlitros de medios de cultivo celular en estrecho contacto con las células. La cantidad mínima de medios evitará el secado de las células. Sin embargo, el propósito de una cantidad mínima de medios es permitir la máxima penetración de la exposición a la UVC.
Tome las células bajo una fuente UV, puede ser un reticulante UV, o puede ser cualquier otra fuente ultravioleta-C. Exponga las células a diferentes dosis de radiación UVC como uno, 10, 100, 1.000 y 10.000 julios por metro cuadrado. Cuando las células han expuesto a la radiación ultravioleta-C, las tapas deben estar en la posición abierta.
Esto permitirá la máxima penetración del ultravioleta-C a las células y por lo tanto mostrar la dosis óptima-respuesta de las células a la radiación ultravioleta-C. Lleve las células a la campana de flujo de aire laminar y reponga cada uno de los platos con dos mililitros de medios completos. Este medio completo contiene 20%suero bovino fetal en DMEM, complementado con suplementos como 1%aminoácidos mínimos no esenciales, y también 1%antibiótico que es penicilina y estreptomicina.
Después, después de reponer con el volumen máximo, es decir, dos mililitros de medios completos, devolver las placas a la incubadora e incubar durante un período de tres horas con el fin de ver los efectos tempranos de la radiación ultravioleta-C. Preparar el medio de tinción celular en vivo en los últimos 15 minutos de tres horas después de la incubación de células UVC. Los medios de tinción se preparan en 10%FBS que contiene DMEM precaliente a 37 grados.
Para hacer 10 mililitros de medios de tinción, primero añadir cinco microlitro de DCFDA de un stock de 10 mililitros para obtener una concentración final de cinco micromolares. Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. En segundo lugar, añadir cinco microlitrados de solución de Hoechst de una acción de 10 miligramos por ml para obtener una concentración final de cinco microgramos por ml.
Ahora mezcle bien pipeteando arriba y abajo. Por último añadir 200 microlitros de yoduro de propídio de un stock de un miligramo por ml para obtener una concentración final de 20 microgramos por ml. Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
Ahora la solución de tinción está lista para su uso. Después de tres horas de incubación después de la exposición a la UVC, retire las placas de la incubadora de CO2. Aspirar los medios de cada uno de los platos que han sido expuestos a varias dosis de UVC como uno, 10, 100, 1,000, y 10.000 julios por metro cuadrado.
Ahora agregue dos mililitros de medios de tinción de células vivas recién preparados a cada uno de los platos suavemente desde los lados de los platos. Vuelva a colocar las placas en la incubadora de CO2 e incubar durante 15 minutos para la tinción de células vivas. Después de 15 minutos de incubación en los medios de tinción de células vivas, retire los medios de tinción de cada uno de los platos que contienen células expuestas a diferentes dosis de radiación ultravioleta-C.
Reponer las células con dos mililitros de medios completos. Ahora las celdas están listas para su visualización. Ahora coloque las celdas de control bajo el campo brillante del imager fluorescente.
Las células parecen normales ya que son células de control. Bajo el campo azul podemos las células totales fluorescing. Bajo el campo verde muestra la generación ROS.
Puesto que estas son celdas de control, no hay ROS generado. Bajo el campo rojo, las células muertas teñidas de yoduro propidium son visibles. A continuación, mantenga los rayos UV expuestos 100 julios por metro cuadrado bajo el campo brillante.
Bajo el campo azul, y también podemos ver el número de celda total bajo el campo azul. Sin embargo, cuando exponemos al campo verde, se ven las células positivas DCFDA, y también se ven las células muertas positivas de PI. Finalmente, coloque la dosis máxima de UV, es decir, 10.000 julios por metro cuadrado celdas expuestas, bajo el campo brillante.
Podemos ver morfología celular anormal. Sin embargo, bajo el campo azul podemos ver celdas azules totales. Bajo el campo verde, se observan células positivas DCFDA fluorestrando verde que indican la generación de ROS.
Cuando las células se exponen al campo rojo, todas las células estaban flúor de color rojo que indica un gran número de muerte celular cuando las células son tratadas con 10.000 julios por metro cuadrado de dosis UV. Ahora organice las imágenes capturadas en varios canales en un único panel de imágenes compuestas correspondiente a las dosis ultravioleta-C y los controles no expositados. Las imágenes se organizan en un único panel en grupo.
Primero, el campo brillante. Segundo, la mancha nuclear azul Hoechst. Tercero, tinción de yoduro de propídico en cuanto a núcleos muertos.
Cuarto, DCFDA para células positivas ROS. Y en quinto lugar, la imagen fusionada. Cuando nos fijamos en la primera y la segunda fila de imágenes, que es el control sin exponer y las células expuestas a la dosis UVC de un julio por metro cuadrado, observamos que no había NI PI ni células positivas ROS que se habían iluminado, lo que indica una ausencia completa de ROS y muerte celular en controles no expuestos y una dosis UVC tan baja de un julio por metro cuadrado.
Ahora llegando a la tercera fila de imágenes compuestas de las celdas que fueron expuestas a 100 julios por metro cuadrado. Un porcentaje muy bajo de células, alrededor del 10% fueron positivos para PI y DCFDA a esta dosis, lo que indica una baja cantidad de generación de ROS y muerte celular. Ahora pasamos a una dosis más alta de exposición a la radiación UVC, es decir, 1.000 julios por metro cuadrado como se indica en la cuarta fila de la imagen compuesta.
Aquí, alrededor del 70% de las células fueron positivas para PI y DCFDA. Finalmente, pasamos a la dosis más alta de exposición a UVC, es decir, 10.000 julios por metro cuadrado como se representa en la quinta fila de la imagen compuesta. Aquí se encontraron que casi el 100% de las células fueron positivas para PI y DCFDA, lo que indica una muerte de 100% células y generación de ROS a esta dosis particular de UVC.
Transfiera las imágenes al software de imágenes. Primero abra la imagen azul que indica los núcleos manchados de Hoescht, que es el número total de células. Abra la herramienta de conteo y haga clic en cada una de las celdas de una en una para tener el número.
Ahora abra la imagen capturada bajo el canal rojo que indica las celdas muertas positivas del PI. Abra la herramienta de recuento y haga clic en cada uno de los puntos rojos que indican el recuento de las celdas muertas positivas de PI. Una vez terminado el conteo de las celdas muertas, haga clic en el canal verde capturado celdas y abra la herramienta de conteo y haga clic en cada una de las manchas verdes que indican las celdas que muestran la generación ROS.
Complete el conteo de las células verdes capturadas bajo el canal verde, y luego usando la fórmula enumerar el porcentaje de muerte celular por daño UVC y porcentaje de la producción de ROS por daño UVC. Esto se calcula utilizando el número de fórmula simple de células positivas de PI, es decir, las células fluoresteas rojas, divididas por el número de celdas positivas de Hoechst multiplicadas por 100. El porcentaje de producción de ROS por daño UV se calcula utilizando la fórmula, el número de células DCFDA positivas o fluorescentes verdes, dividido por el número de células positivas de Hoechst multiplicadas por 100.
Una vez que tenga ambos porcentajes, es decir, el porcentaje de muerte celular y el porcentaje de producción de ROS, utilice estos valores para trazar un gráfico de barras. El eje X indica la dosis de UV, mientras que el eje Y indica el porcentaje de células. Las barras verdes indican el porcentaje de generación de ROS, mientras que la barra roja indica el porcentaje de muerte celular.
Tras el análisis, es evidente que en la dosis UVC 100 julios hay 10%ROS célula generadora, así como una muerte de 10%células. Mientras que en la dosis UVC 10 elevado a tres julios por metro cuadrado, 70%células exhibieron generación ROS, así como la muerte celular. Mientras que a la dosis más alta de UVC, que es 10 elevado a cuatro julios por metro cuadrado, alrededor de 100%células exhibieron muerte celular, así como la producción de ROS.
Por lo tanto, se puede concluir que existe una fuerte correlación positiva entre la generación de ROS y la muerte celular. En conclusión, esta técnica es muy útil para la evaluación simultánea de especies reactivas de oxígeno, células vivas y muertas en el cultivo de eventos vivos y normales. Esta técnica también es útil para la evaluación limitada de especies reactivas de oxígeno, células vivas y muertas, en cultivos a largo plazo que han estado expuestos a diversos agentes dañinos celulares como la radiación ultravioleta, o agentes químicos.
Y esta técnica también puede guiar a un investigador para determinar el momento óptimo para la cosecha de las células como 50%ROS, 75%ROS, así y así sucesivamente como puede haber para muchas aplicaciones aguas abajo, tales como QR a PCR y western blotting.
