Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la barrera de los análisis de sangre de los campos de la biología sobre los candidatos a genes, los virus o las toxinas ambientales que pueden afectar la función o integridad de la barrera de los análisis de sangre. Tres días antes de la cirugía, tratar al menos tres ratones macho C57Black/6 de ocho semanas de edad diariamente con un cloruro de cadmio de cinco miligramos por kilogramo de peso corporal a través de la inyección intraperitoneal. El día de la cirugía, coloque un tejido limpio sobre un área quirúrgica esterilizada con etanol al 75% y establezca un calentador termostático en 37 grados centígrados.
Coloque un ratón anestesiado sobre el tejido y luego confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del final. Afeitar el cabello abdominal con una afeitadora, y desinfectar la piel expuesta con 75%etanol. Haga una incisión cutánea de un centímetro por encima de las glándulas preputiales para exponer la pared abdominal, y use pequeños fórceps para levantar la piel para hacer una incisión de 0,5 centímetros en el peritoneo.
Utilice los fórceps para buscar almohadillas de grasa alrededor del epidídimo y testis, tirando cuidadosamente de las almohadillas de grasa para exponer un testículo unido. Coloque un pedazo de papel de nueve centímetros debajo de las almohadillas de grasa y los testículos, y cargue una pipeta de microinyección con solución de inulina-FITC recién preparada. Conecte la pipeta a una unidad microempresador y utilice un microscopio de disección para insertar suavemente la punta de la pipeta de microinyección debajo de la túnica albuginea.
Gire lentamente la palanca de operación para entregar 20 microlitros de la inulina-FITC en el intersticio de los testículos. Si la entrega es exitosa, los testículos se volverán de color verde-amarillo brillante. Inmediatamente devolver los testículos a la cavidad abdominal, e inyectar los testículos contralaterales con 20 microlitros de PBS, a continuación, cerrar la piel con una sutura quirúrgica.
Y coloque el ratón sobre la almohadilla de calor de un calentador termostático. 40 minutos después de la inyección, utilice tijeras afiladas para recoger los testículos de cada ratón y lave los tejidos en un mililitro de PBS helado. A continuación, fijar los testículos en 4%paraformaldehído a cuatro grados Celsius durante 12 a 24 horas seguido de tres lavados en 1,5 mililitros de 1%PBS por lavado.
Después de 30%deshidratación de sacarosa durante la noche, transfiera las muestras a marcos de incrustación individuales y cubra los tejidos con un compuesto de temperatura de corte óptimo. Ajuste la temperatura de un criostato a 20 grados Celsius negativos y coloque los fotogramas en el criostato durante unos 10 minutos hasta que el PTU esté congelado. A continuación, llene cada marco de incrustación con OCT fresco hasta que todo el testis esté cubierto en cada molde.
Cuando la segunda capa de OCT se haya congelado, adquiera secciones transversales de cinco micrómetros de espesor de cada testículo, capturando las secciones de tejido en diapositivas de microscopio de vidrio a medida que se obtienen. Para tomar una imagen de las muestras, primero caliente los portaobjetos en una caja humidificada a temperatura ambiente. Después de 10 minutos, lave los portaobjetos tres veces en solución salina fresca tamponada por comprimidos por lavado y deje que las secciones se sequen durante cinco minutos protegidas de la luz.
Utilice papel libre de polvo para eliminar cualquier solución salina residual y monte las muestras con un medio de montaje complementado por DAPI. A continuación, cubra cada muestra con un resbalón de cubierta invertido e imagine las muestras bajo el objetivo 20X de un microscopio confocal. Tres días de tratamiento con cloruro de cadmio causan daños en la barrera blood-testis permitiendo la difusión inulina-FITC desde el compartimiento basal hasta el compartimiento apical del epitelio semicífero.
Por el contrario, esta difusión se bloquea en el control de los testículos tratados con PBS. El alcance del daño de la barrera blood- testis se determina calculando la relación entre la distancia de difusión inulina-FITC y el radio del mismo tubulo semiínfero. Además, la barrera intacta de los testis de sangre en los ratones noqueados de Rictor heterocigoto bloquea la difusión de la inulina a través de la barrera en el compartimiento apical, mientras que los ratones noqueadores condicionales de Rictor poseen una barrera de testis de sangre comprometida que permite la difusión de la inulina.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar entregar inulina-FITC preparado el día del experimento y mantener el tejido protegido de la luz ya que FITC es una molécula sensible a la luz. Las implicaciones de esta técnica se extienden a la terapia de espermatogénesis deteriorada porque la función de la barrera blood-testis es proporcionar un microambiente de privilegio inmune para la finalización de la meiosis en la espermatogénesis. Después de su desarrollo, esta técnica proporciona una manera para que los investigadores en el campo de la medicina reproductiva exploren la subfertilidad y la infertilidad en ratones.
No olvide que trabajar con paraformaldehídos puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de prendas y máscaras faciales al realizar este procedimiento.
