Este protocolo es una forma sencilla y factible para que los estudiantes de pregrado realicen investigaciones auténticas que podrían conducir a resultados publicables. La principal ventaja es que los estudiantes pueden realizar investigaciones originales sobre preguntas que deciden por su cuenta. Para comenzar, haga un esparcidor de solución doblando cuidadosamente una pipeta Pasteur de vidrio de nueve mililitros en una llama de quemador Bunsen y cierre la abertura de la pipeta.
Luego, el etanol esteriliza el esparcidor antes de cada propagación en la placa de Petri. Usando un micropipetador, coloque 100 microlitros de la dilución en el centro del agar y extiéndalos suavemente por la superficie con el esparcidor esterilizado. Luego deje a un lado las placas de Petri cubiertas y deje que la solución se empape en la superficie hasta que se seque.
Para períodos de exposición superiores a 12 horas, agregue 50 microlitros de un cultivo nocturno de Escherichia coli a las placas antes de agregar los nematodos, mientras que para experimentos agudos de 12 horas o menos, no es necesario tener E. coli en las placas. Usando una micropipeta, coloque un mililitro de agua estéril sobre la placa de nematodos. A continuación, agite el agua para levantar los nematodos, luego retire el líquido con los nematodos a un tubo de microfugio de 1,5 mililitros.
Después de 10 minutos, ya que los nematodos se asentaron por gravedad, retire cuidadosamente al menos 500 microlitros del agua y deséchelos. Luego vuelva a suspender los nematodos y, con una punta de pipeta amarilla cortada, retire de 50 a 100 microlitros de gusanos suspendidos a cada placa de tratamiento, asegurándose de que cada placa tenga al menos 10 gusanos adultos. Prepare dos diapositivas colocando un trozo de cinta adhesiva en un solo lado de la diapositiva para formar una almohadilla de grosor uniforme, luego coloque una diapositiva limpia no utilizada entre ellas en la mesa de trabajo.
Coloque una gota de 10 microlitros de agarosa derretida en el centro de la diapositiva con un micropipetón. Luego aplana la gota colocando otra diapositiva limpia en la parte superior perpendicular a la diapositiva con la gota y aplica presión para que la gota de agarosa forme el grosor de la cinta de etiquetado. Después, aplique una presión constante para separar las dos diapositivas.
Luego apoye este tobogán con el lado del agar hacia arriba en la mesa de trabajo y deje que se seque durante uno o dos minutos antes de usarlo. Para agregar nematodos del portaobjetos preparado con la almohadilla de agarosa, agregue una gota de agua de cinco microlitros que contenga una azida de sodio molar a la almohadilla de agar, que anestesiará a los gusanos y los movilizará. Luego transfiera a 10 nematodos por portaobjetos de tratamiento a la gota usando un pico de gusano, que debe esterilizarse antes y después de transferir los nematodos.
A continuación, agregue un deslizamiento de cubierta usando fórceps colocándolo en ángulo y bajándolo lentamente. Después, coloque el soporte húmedo preparado en un microscopio fluorescente para observar los gusanos primero bajo aumento de 10X y contraste de fase, luego bajo aumento de 40X con contraste de fase e iluminación fluorescente. Coloque un soporte húmedo preparado a la vez en el escenario del microscopio y asegúrelo en su lugar usando los clips de la etapa del microscopio, luego comience a ver los soportes húmedos con el objetivo de aumento más bajo, que generalmente es 10X y use un campo brillante o contraste de fase para visualizar y enfocar los nematodos.
Una vez que un nematodo se encuentra en el campo de visión, concéntrese en él usando la perilla de enfoque fino en el microscopio, luego cambie la iluminación a fluorescencia girando el dial y dirija la luz a la cámara para capturar las imágenes digitales. A continuación, ajuste la iluminación utilizando el software de imágenes para que las neuronas estén brillantemente iluminadas, pero no sobresaturadas. En algún momento, obtenga una imagen separada de una regla con el mismo aumento que las imágenes de celda para proporcionar una escala de aumento para su figura.
Los efectos del manganeso que contiene pesticidas en la morfología de la neurona dopaminérgica utilizando una cepa en la que las neuronas dopaminérgicas expresaban GFP mostrando una señal brillante. Sin embargo, la señal fluorescente se blanquea si las neuronas están expuestas a la luz durante largos períodos de tiempo. Este procedimiento puede ser parte de un proyecto de varias semanas impulsado por los estudiantes que también puede incluir datos de comportamiento u otros.
