Damos las gracias a Anne de Jong y Siger Holsappel para obtener ayuda con la producción de diapositivas microarrays de ADN. El apoyo de Anne de Jong para el análisis de la bioinformática también se agradece. También agradecemos a Jelle Slager para revisar el documento. Muhammad Afzal y Irfan Manzoor son apoyados por la Universidad GC, Faisalabad, Pakistán bajo el programa de desarrollo de la facultad de HEC Pakistán.

1. Preparación de los medios de comunicación, y cultivo celular <ol><li> Crecer S. D39 pneumoniae cepa de tipo salvaje 21 como se describió anteriormente 11. Inocular células almacenadas a -80 ° C en glicerol al 10% (con relación 1/100 en tubos de 50 ml estériles) en 50 ml químicamente medio definido (CDM) con un pH final de 6,4 15, pero omitir L-serina a partir del aminoácido mezcla. Nota: se utilizaron dos MDL diferentes; uno que contiene una concentración mínima de L-serina (150 mM) y el otro que contiene una concentración máxima de L-serina (10 mM). Esta concentración mínima es básicamente la concentración de L-serina en el plasma sanguíneo humano y el objetivo es comparar la expresión de genes de S. pneumoniae cepa D39 bajo estas dos condiciones. </li></ol> 2. Aislamiento de ARN total <ol><li> Materiales <ol><li> Utilice fenol ácido, ARN de grado para el aislamiento de ARN total. </li><li> Macaloide: <ol><li> Suspender 2 gramos deMacaloide en 100 ml de TE y hervir durante 5 minutos. Enfriar a temperatura ambiente y se somete a ultrasonidos hasta Macaloide gels.Centrifuge la solución a 2000 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente, se vuelve a suspender en 50 ml de TE pH 8 y se almacena a 4 ° C. </li></ol></li><li> Soluciones: <ol><li> Tratar a todos sus soluciones con pirocarbonato de dietilo (DEPC). Añadir 100 l DEPC / 100 ml de solución, incubar O / N a 37 ° C y autoclave durante 15 min. </li></ol></li></ol></li><li> Metodología <ol><li> Crecer 50 ml de S. cultivo celular pneumoniae D39 en tubos de 50 ml a 37 ° C (sin agitación) hasta mediados de la fase exponencial (OD ~ 0,3). Culturas centrifugar a 4 ° C en 10000 × g durante 2 min. Deseche los medios de comunicación y congelar inmediatamente los sedimentos de células en nitrógeno líquido. </li><li> Premix 300 l de cloroformo: IAA (24: 1) y 300 l de fenol (fenol ácido, ARN grado). Utilice 500 l de la fase orgánica en el paso 2.2.3. </li><li> Preparar la siguiente mezcla con antelación en tubos con tapa de rosca-ARN libre: 00,5 g de perlas de vidrio, 50 l 10% de SDS, 500 l de fenol / cloroformo: IAA (tal como se preparó en el paso 2.2.2), la capa de Macaloide (150-175 l, no exacta ya que es muy viscoso). Resuspender los sedimentos de células en 400 l de TE (DEPC) y añadir las células resuspendidas en los tubos con tapa de rosca. </li><li> Para romper las células, colocar los tubos con tapa de rosca en un batidor de bolas para pulsos 2x 60 &quot;(&quot; homogeneizar &quot;) con 1 min de intervalo en el hielo. Centrifugar las muestras durante 10 min a 10.000 × g (4 ° C). </li><li> Transferir la fase superior a un tubo nuevo, añadir 500 l de cloroformo: IAA (24: 1) y se centrifuga durante 5 min a 10.000 × g (4 ° C). </li><li> Transferir 500 l de la fase superior a tubos nuevos, agregar 2 volúmenes (1 ml) de tampón de lisis / unión y mezclar pipeteando arriba y abajo. Aislar el ARN total usando el kit de aislamiento de ARN y seguir el protocolo recomendado fabricante. </li></ol></li></ol> 3. ARN Limpieza &lt;<html> ol&gt; <li> Para eliminar la contaminación de ADN a partir de ARN total, añadir 100 l mezcla DNAsaI (tampón DNAsa 90 ly 10μl DNAsaI) y se incuba durante 20-30 minutos a 15-25 ºC. </li><li> Wash limpia ARN utilizando el kit de ARNasa. Obtener 50 l de volumen eluido. </li></ol> 4. Análisis de ARN <ol><li> Determinar la concentración de ARN en un espectrofotómetro. Determinar la calidad del ARN mediante el uso de un ensayo de la siguiente manera (Figura 2). <ol><li> Diluir 1 l de muestra con 50 l de agua DEPC para obtener una concentración de 20 a 200 ng / l. </li><li> Utilice 1 l muestra de ARN diluido para comprobar la calidad en la Bioanalyser de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol></li><li> Nota: una relación de 23S: 16S de alrededor de 2,0 se considera bueno 1 A260 unidad de RNA corresponde a 40 mg / ml.. Una cantidad recomendada para el etiquetado es de 10-20 g. </li></ol> 5. Preparación de ADNc y Etiquetado ntent &quot;&gt; NOTA: El siguiente protocolo se siguió para la preparación de cDNA y etiquetado. <ol><li> Recocido <ol><li> Realizar reacción de hibridación en 300 tubos de PCR mu l, manteniendo la concentración de ARN total de 10-15 mg para las diapositivas hechas en casa o 5 mg para las diapositivas hechos a la empresa. Mezclar ARN con 2 nonamers l azar (1,6 g / l) y añadir agua libre de nucleasas si es necesario para mantener el volumen final de la mezcla de recocido a 18 l. </li><li> Mantener la mezcla de hibridación a 70 ° C durante 5 min. Después de eso, enfriar la mezcla a TA durante 10 min (recocido) y si es necesario, de girar las reacciones a la parte inferior del tubo. Colocar los tubos de reacción en hielo durante al menos 1 min. </li></ol></li><li> Transcripción inversa <ol><li> Preparar la mezcla de la transcriptasa inversa de la siguiente manera: a la mezcla de recocido 18 l, añadir 12 l de mezcla Master (que consta de 6 l de tampón 5X First Strand, 3 l 0,1 M DDT, 1,2 l 25x AA-dUTP mezcla / nucleótidos y 1,8 l revertir transcriptase (1 l de diapositivas hechos a la empresa). Mantenga la mezcla de reacción durante 2-16 horas a 42 ° C. </li></ol></li></ol> 6. La degradación de mRNA y purificación de cDNA <ol><li> Para degradar el ARNm a partir de la mezcla de reacción, añadir 3 l de 2,5 M NaOH y lugar a 37 ° C durante aproximadamente 15 min. A continuación añadir 15 l de 2M HEPES ácido libre para neutralizar el NaOH. </li><li> Se purifica la mezcla de ADNc por PCR usando columnas de limpieza y siga el protocolo del fabricante. </li></ol> 7. Medición de cDNA Concentración <ol><li> Medir las concentraciones de ADNc en un espectrofotómetro. Para continuar con el etiquetado, comprobar que la concentración de ADNc es de al menos 60 ng / l (diapositivas caseras) o 20 ng / l (toboganes hechos a la empresa). </li></ol> 8. Etiquetado de cDNA con Amine reactiva Dye y Purificación <ol><li> Use colorante reactivo con aminas para etiquetar el ADNc. Mezclar directamente el ADNc con una alícuota (5 l) deamina reactiva tinte. </li><li> Incubar la mezcla a RT, en la oscuridad, durante 60 a 90 min y proceder directamente a la purificación de cDNA marcado con colorante. Purificar cDNA marcado tinte usando PCR columnas de limpieza y siguiendo el protocolo del fabricante. Eluir cDNA en 50 l de tampón de elución. </li></ol> 9. Medición de cDNA Labelled <ol><li> Utilice un espectrofotómetro para medir la incorporación de colorantes reactivos con amina en el ADNc. Compruebe que la concentración de colorantes reactivos con amina es de al menos 0,5 pmol / l en un volumen total de 50 l. </li></ol> 10. Mezcla de muestras de cDNA Labelled <ol><li> Para diapositivas caseras, utilizar todo el cDNA marcado para la hibridación con diferencia no más de 30% en la concentración de ADNc. Para toboganes hechos a la compañía, use cDNA con no más de 2 veces la diferencia en la concentración de cDNA. Nota: normalmente, se necesita alrededor de 300 ng de cDNA para diapositivas hechos a la empresa, lo cual es muy poco en comparación con el reqcantidad de cDNA pedirá otra para diapositivas caseras. </li></ol> 11. La hibridación y lavado <ol><li> Utilice los siguientes reactivos: agua desmineralizada, etanol 99%, Buffer SHY (hecho en casa; con 40 l de levadura ARN). Preparar máximo 1 ml de SHY. </li><li> Aparato de preparación y soluciones <ol><li> Encienda concentradores de vacío y calentador al menos 1 hora antes de su secado. Encienda el horno de hibridación, con el punto de consigna ajustado a la temperatura de hibridación correcto (por S. pneumoniae microarrays de ADN, utilizar 45 ° C). Del mismo modo, precalentar casete de hibridación y horno durante 30-60 min. </li><li> Precaliente búfer SHY a 68 ° C durante al menos 30 minutos. </li></ol></li><li> Preparación de la muestra (ADNc marcado) <ol><li> Combinar cantidades iguales de ADNc marcados (max 30% de diferencia). Secar la muestra usando los concentradores de vacío a alta temperatura (aprox. 40 min) hasta que el volumen es menor que 7 l. </li></ol></li><li> Lifter antideslizante <ol><li> Utilice levantador-se desliza limpias.Nota: ± 30 l se pueden cargar en la diapositiva. </li><li> Limpie el levantador-se desliza con jabón, un montón de agua del grifo y etanol al 100%. Nota: Los resbalones levantador Dirty dan de alta de fondo. </li><li> Deje secar al aire el levantador-se desliza con pistola de aire para soplar las partículas de polvo. Coloque un levantador antideslizante limpio en la diapositiva con el revestimiento de teflón blanco a los lados hacia abajo. </li></ol></li><li> La adición de tampón de hibridación (a ADNc marcado) <ol><li> Disolver las muestras de colorante secas en 7 l H 2 O y se incuba a 94 ° C durante 2 min. </li><li> Inmediatamente, añadir 35 l precalentado búfer SHY (68 ° C), mezclar suavemente y girar a la velocidad máxima durante 1 minuto para deshacerse de precipitados. Precaliente la sonda a 68 ° C durante aproximadamente 5 minutos hasta que la carga. </li></ol></li><li> Deslice levantador de deslizamiento y montaje y de precalentamiento. <ol><li> Coloque el soporte de diapositivas hibridación en un bloque de calor a 50 ° C. Coloque las diapositivas de microarrays de ADN con el levantador de deslizamiento en el soporte de diapositivas hibridación climatizada y precalentar la diapositiva con levantador de deslizamiento por un minuto. Realice los siguientes pasos lo más rápido posible. </li><li> Añadir 40 l de la muestra diana hasta el final de la diapositiva. Permitir que el fluido fluya entre las superficies de vidrio por la fuerza capilar. Realizar todas pipeteo lenta y cuidadosamente. </li><li> Mantenga las diapositivas con elevador horizontal antideslizante en todo momento y se mueven lentamente para asegurarse de que el levantador de deslizamiento no se movió. </li><li> Tome el casete de hibridación precalentado fuera del horno de hibridación y cerrar la máquina. Coloque papel de filtro empapado con 3 ml 2x SSC (citrato salino estándar) en el casete de hibridación. </li><li> Coloque suavemente el soporte de diapositivas hibridación con las diapositivas en el casete de hibridación. Cierre el casete de hibridación y poner en el horno de hibridación de nuevo (por alrededor de 16 a 18 h). </li></ol></li><li> Lavado de diapositivas <ol><li> Preparar frescas de lavado-buffers I, II y III (750 ml por paso de lavado). Por 500 ml lavar-buffer I, utilizar 2 x SSC / SDS al 0,5%. Por 500 ml lavado buffer II, utilice 1 x SSC / SDS al 0,25%. Por 500 ml lavar-buffer III, use 1 x SSC / 0,1% SDS (opcional) </li><li> Coloque los lavaderos tampones a 30 ° C (para asegurarse de SDS se disuelve). </li><li> Sumergir los portaobjetos tan rápidamente como sea posible, pero muy suavemente, en un tubo Falcon de 50 ml lleno con el tampón de lavado I hasta que el vidrio se apoya en la parte inferior cónica del tubo. </li><li> Después de unos segundos, cuando se hunde el levantador antideslizantes a la parte inferior del tubo, saque la diapositiva con pinzas sin rayar la matriz y poner en el estante de la estación de lavado. Continúe con el lavado con ningún espacio de tiempo. </li><li> Lavar los portaobjetos durante 5 min en 500 ml de tampón de lavado I (en una estación de lavado). Darle un segundo lavado durante 20-30 minutos en 500 ml lavar-buffer II (en una estación de lavado). Del mismo modo, lavar los portaobjetos durante 5 min en 500 ml de tampón de lavado III (opcional) (en una estación de lavado). </li><li> Secar los portaobjetos durante 2 minutos a 2000 rpm. </li></ol></li></ol> Análisis de microarrays 12. <ol><li> Explorar imágenescon las respectivas longitudes de onda en el escáner y guardar en una carpeta &quot;Jove Proyecto&quot;. </li><li> Utilice software para analizar los archivos escaneados inicialmente como se describió anteriormente 22. Después de ejecutar este software, seleccione la pestaña &quot;Abrir imagen&quot; para cargar el archivo de imagen de color rojo (-.550) como &quot;Rojo&quot; y el archivo de imagen verde (-.635) como &quot;Verde&quot;. Sube el archivo gal (.gal) con S. pneumoniae lista de arreglo de archivo de imagen al seleccionar &quot;Cargar Lista de matrices&quot; ficha 22. Nota: esta lista de arreglo consistió en 48 cuadrículas, en cada cuadrícula había 16 filas y 15 columnas. Cada punto en la cuadrícula representa un solo gen y de información de puntos incluyendo el nombre de genes se añade a través de un archivo de descripción de lugar. Los números de punto se dan de izquierda a derecha y de arriba abajo. </li><li> Después de detectar cuidadosamente las rejillas, seleccione la pestaña &quot;Buscar Array, Encuentra Bloques, Alinear Características&quot; para alinear los puntos. Después de alinear todas las características, analizar la imagen seleccionando la opción &quot;Analizar&quot; tuna b. Crear un nuevo archivo con los resultados, histograma y diagrama de dispersión. Guarde este archivo de pestaña &quot;Guardar los resultados como&quot; como un archivo .gpr para su posterior análisis. </li><li> Realice mayor normalización y tratamiento de datos con desarrollo propio paquete de software Microprep como se describe 9. </li><li> Utilice biológicos repeticiones independientes para datos de microarrays de ADN que son de tinte intercambiado. Realizar implementación CyberT de una variante del t-test1 y calcular tasas de falso descubrimiento (FDR) como se describe 9. </li><li> Para los genes expresados ​​diferencialmente, tome p &lt;0,001 y FDR &lt;0,05 como estándar. </li><li> Sube DNA microarrays de datos en la página de presentación NCBI para conseguir un número de acceso GEO (Expresión Génica Omnibus). </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Se describe un protocolo fácil de usar que puede ser aplicado para realizar el análisis del transcriptoma enteras de bacterias. El punto clave de esta técnica en particular es que las condiciones en que se cosechan las células variará. Después de cosechar las células y el aislamiento de ARN, esta técnica se hace igual para todos los tipos de muestras bacterianas y sigue los pasos exactamente idénticos y por lo tanto, se puede aplicar a cualquier tipo de cultivo bacteriano. El protocolo es muy simple y convenien...

El estudio de todo el conjunto de la abundancia de ARNm (transcriptoma) codificada por el genoma de un organismo unicelular o una célula eucariota en un momento específico o bajo una condición específica, incluyendo la sobreexpresión del gen o knock-out, se llama transcriptómica. Transcriptómica nos permite observar hasta qué punto los genes se expresan bajo una condición particular en un punto X tiempo y nos da información acerca de la fuerza con los genes se expresan con respecto a una referencia. Un microarray es una matriz bidimensional sobre un sustrato sólido (por lo general un portaobjetos de vidrio o silicio de células de película delgada) que se puede utilizar para ensayar grandes cantidades de material biológico mediante cribado de alto rendimiento, y miniaturizado, el procesamiento de multiplexado y en paralelo y detección métodos. Microarrays vienen en varios tipos, incluyendo microarrays de ADN, microarrays de proteínas, péptidos, microarrays microarrays de tejidos, microarrays de anticuerpos, microarrays de celulares y otros. Un microarray de ADN esbásicamente un conjunto de manchas de ADN microscópicos fijado a una superficie sólida, generalmente de vidrio. Microarrays de ADN se utilizan para medir los niveles de expresión de un gen o un conjunto de genes simultáneamente o determinar el genotipo de múltiples regiones de un genoma 2,3. Picomoles (10 -12 moles) de una sonda están presentes dentro de cada punto de ADN que representa una secuencia de ADN específica, también conocido como un reportero. Las moléculas de ARNm etiquetados de las muestras se denominan &quot;objetivos&quot;. Los fluoróforos se utilizan para medir la hibridación sonda-diana y detección de blancos marcados con fluoróforo determina la abundancia relativa de secuencias de ácidos nucleicos en el objetivo. Un experimento de microarrays puede lograr múltiples pruebas genéticas en paralelo debido a una matriz puede contener decenas de miles de sondas. El diseño de un sencillo experimento de microarrays se muestra en la Figura 1. Recientemente, se estableció en nuestro y otros laboratorios que estas matrices son reutilizables, lo que hace que esta técnica bastante costo-effective. Diferentes técnicas de aislamiento y purificación de ARN se han desarrollado a lo largo de los años, incluyendo C-TAB, SDS y métodos GT 4-8. Además, varios kits comerciales están también disponibles. Para la expresión de genes de ARN de alta calidad es muy importante. Por lo tanto, los métodos de aislamiento de ARN se modifican para obtener una cantidad máxima de ARN. Del mismo modo, se reducen al mínimo los pasos para la preparación de cDNA y etiquetado de cDNA. La normalización de los datos después de la exploración también se lleva a cabo de manera eficiente mediante el uso de en-casa construida paquetes y herramientas de software 9. Streptococcus pneumoniae es un patógeno humano Gram-positivas que coloniza la nasofaringe y es la causa de múltiples infecciones, como la neumonía, sepsis, otitis media y meningitis 10. La bacteria puede utilizar una amplia variedad de los nutrientes necesarios para el crecimiento y la supervivencia 11,12. Un número de estudios han llevado a cabo en elel metabolismo del nitrógeno neumocócica y la regulación destacando la importancia de los aminoácidos y su papel en la virulencia 13,14. En este estudio, la respuesta transcriptómica de S. pneumoniae a la evolución de las concentraciones de L-serina, un ácido muy presentes en el plasma sanguíneo humano amino, se reportó el uso de microarrays de ADN. La respuesta transcriptómica de S. pneumoniae crecido en una concentración mínima de L-serina (150 mM) se comparó con la crecido en una concentración máxima (10 mM) de la serina. Se utilizó medio químicamente definido (CDM o medio mínimo) 15 para este estudio para controlar la concentración de serina. El objetivo de este estudio es hacer que esta técnica fácil de usar y proporcionar diferentes herramientas para la normalización y el análisis de datos. Por lo tanto, se han desarrollado una serie de herramientas para el análisis e interpretación de datos. FIVA (Funcional Information Viewer y Analyzer) proporciona una plataforma para procesamiento de la información contenida en grupos de genes que tienenlos patrones de expresión de genes similares y para la construcción de perfiles funcionales 16. FISCAL es otro paquete de software que facilita la identificación de las funciones y las anotaciones de genes putativos 17. Al hacer uso de métodos de agrupamiento, DIVULGAR proporciona un algoritmo de detección de ADN sitio de unión. Motivos Cis-regulador de los genes pueden proyectarse utilizando este algoritmo 18. Genome2D ofrece una plataforma basada en Windows para la visualización y análisis de datos transcriptoma ofreciendo gamas de colores diferentes para caracterizar los cambios en los niveles de expresión de genes en un mapa del genoma 19. El servidor web pimienta ofrece, además del método todo-en-un análisis, una caja de herramientas para la minería para regulons, promotores y de unión al factor de transcripción sitios de 20. Anotación completa de las regiones intergénicas en un genoma bacteriano se puede lograr mediante el uso de este paquete. Los biólogos pueden beneficiarse enormemente de pimienta, ya que les ofrece una plataforma para el diseño de experimentos para que la información hipótesis puede confirmarse in vitro 20. Estos paquetes de software contribuyen significativamente a la análisis de microarrays ya que la mayoría de ellos son libremente disponible y crea la normalización de datos y análisis muy fiable.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid phenol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P4682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche RNA isolation kit</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>11828665001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td></td>
			<td>105015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Boom</td>
			<td>92013505.1000.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAA</td>
			<td></td>
			<td>106630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ND-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent BioAnalyser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2940CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AA-dUTP</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>AM8439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDT</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First Strand buffer</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>S8045-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight-550</td>
			<td>Thermoscientiffic</td>
			<td>62262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight-650</td>
			<td>Thermoscientiffic</td>
			<td>62265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHY Buffer</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>H7033-125ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speedvac cooler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>RUGNE3140</td>
			<td>Speedvac concentrator plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Grant Boekel</td>
			<td>Iso-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifter-slips</td>
			<td>Erie Scientific</td>
			<td>25x60I-M-5439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wipe</td>
			<td>KIMTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>L3771-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>W302600-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genpix autoloader 4200A1</td>
			<td>MSD analytical technologies</td>
			<td></td>
			<td>Microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>104766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fast and reliable pipeline for bacterial transcriptome analysis case study: serine-dependent gene regulation in streptococcus pneumoniae

La expresión génica y su regulación son muy importantes para entender el comportamiento de las células en diferentes condiciones. Varias técnicas se utilizan hoy en día para estudiar la expresión génica, pero la mayoría están limitados en términos de proporcionar una visión global de la expresión de todo el transcriptoma. Microarrays de ADN ofrecer una tecnología de investigación rápida y económica, lo que da una visión completa de la expresión génica global y tienen un gran número de aplicaciones, incluyendo la identificación de nuevos genes y factores de transcripción sitios, la caracterización de la actividad transcripcional de las células y también vinculantes ayudar en el análisis de miles de los genes (en un solo experimento). En el presente estudio, las condiciones para el análisis del transcriptoma bacteriana de cosecha de células para el análisis de microarrays de ADN han sido optimizados. Teniendo en cuenta el tiempo, los costos y la precisión de los experimentos, esta plataforma tecnológica resulta ser muy útil y universalmente applicabale para estudiar transcripto bacterianames. Aquí, realizamos el análisis de microarrays de ADN con Streptococcus pneumoniae como un caso-estudio comparando las respuestas transcripcional de S. pneumoniae cultiva en presencia de diferentes concentraciones de L-serina en el medio. El ARN total se aisló utilizando un método de Macaloide utilizando un kit de aislamiento de ARN y la calidad del ARN se comprobó mediante el uso de un kit de comprobación de la calidad del ARN. Se preparó ADNc utilizando transcriptasa inversa y las muestras de ADNc se marcaron utilizando uno de los dos colorantes fluorescentes de amina reactiva. Hechas en casa de ADN de microarrays diapositivas fueron utilizados para la hibridación de las muestras de ADNc marcadas y los datos de microarrays se analizaron mediante el uso de un marco de pre-procesamiento de datos de microarrays de cDNA (Microprep). Finalmente, Cyber-T se utilizó para analizar los datos generados usando Microprep para la identificación de estadísticamente significativas genes expresados ​​diferencialmente. Paquetes de software Además, construido en la casa (pimienta, FIVA, DIVULGAR, FISCAL, Genome2D) se utilizaron para analizardatos.

ARN, aislamientos y análisis de ADNc L-serina es uno de los aminoácidos esenciales y su concentración en el plasma sanguíneo humano varía desde 60 hasta 150 mM en niños y adultos. Su papel en la biosíntesis de purinas y pirimidinas destaca su importancia en el metabolismo y es un precursor de varios aminoácidos (glicina, cisteína y triptófano). Para estudiar el impacto de la L-serina en todo el transcriptoma de S. Se realizó pneumoniae D39 cepa d...

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A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.

Una tubería rápida y fiable para el estudio de caso Análisis Bacteriano Transcriptome: Regulación Génica Serina-dependiente en<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Gene expression and its regulation are very important to understand the behavior of cells under different conditions. Various techniques are used nowadays ...

a-fast-reliable-pipeline-for-bacterial-transcriptome-analysis-case

Research

JoVE Journal

Biology

A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

10.3K vistas.  University of Groningen. This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages. 

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Gen bacteriano y Análisis de Expresión El uso de microarrays

Investigación

Biología

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

El aislamiento de los ribosomas polipéptidos nacientes Bound<em&gt; In vitro</em&gt; Para la identificación de sitios de traslación pausa a lo largo del ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genoma escala supresiones de genes en<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de alto rendimiento

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Screening siRNA para identificar ubiquitina y reguladores del sistema ubiquitina-como de las vías biológicas en células de mamífero en cultivo

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Efficient Nucleic Acid Extracción y 16S rRNA genes de secuenciación para bacteriana Comunidad Caracterización

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Los enfoques genéticos y bioquímicos para<em&gt; En Vivo</em&gt; y<em&gt; In Vitro</em&gt; Evaluación de la oligomerización de proteínas el receptor de rianodina Estudio de caso

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Análisis de microbiota utilizando PCR de dos pasos y secuenciación genética de rRNA 16S de próxima generación

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...