私たちは、DNAマイクロアレイスライド制作のヘルプはアン·デ·ヨングとSiger Holsappelに感謝。バイオインフォマティクス解析のためのアン·デ·ヨングのサポートも歓迎です。また、紙を検討するためのJelle Slagerに感謝。ムハンマド·アフザールとイルファンManzoorはHECパキスタンの教員育成プログラムの下でGC大学、ファイサラバード、パキスタンでサポートされています。

1.メディアの調製、および細胞培養<ol><li> S.を育てる以前に11説明したように、肺炎 D39野生株21。 6.4 15の最終的なpHを50ミリリットル化学的に定義された培地（CDM）中（50ml中1/100比滅菌チューブ付き）、10％グリセロール中で-80 Oで保存細胞を接種するが、アミノ酸のL-セリンを省略混合物。 注：二つの異なるのCDMを使用した。 L-セリン（10ミリモル）の最大濃度を含有するL-セリンの最​​小濃度（150μM）およびその他を含むもの。この最小濃度は、基本的には、ヒト血漿中のL-セリンの濃度であり、その目的は、Sの遺伝子発現を比較することであるこの二つの条件の下で、肺炎の D39株。 </li></ol>総RNAの2の単離<ol><li>マテリアル<ol><li>全RNAの単離のために酸フェノール、RNAグレードを使用してください。 </li><li>マカロイド： <ol><li>の2グラムを一時停止100ミリリットルのTEでマカロイドし、5分間沸騰させる。 RTに冷却し、マカロイドgels.Centrifugeまで、超音波処理RT、4℃で50ミリリットルのTE pHが8店舗で再懸濁で5分間2000×gでソリューション。 </li></ol></li><li>ソリューション： <ol><li>ジエチルピロカーボネート（DEPC）を持つすべてのソリューションを扱う。 15分間37℃でO / Nインキュベートし、オートクレーブ、100μlのDEPC / 100ミリリットル溶液を加える。 </li></ol></li></ol></li><li>方法論<ol><li> Sの50ミリリットルを育てる中期指数期（OD〜0.3）まで、37°C ​​の （なしの揺れ）で50 mlチューブで、肺炎 D39細胞培養。 2分間10,000×gで上に4℃で遠心し培養。メディアを破棄し、直ちに液体窒素中で細胞ペレットを凍結する。 </li><li>プレミックス300μlのクロロホルム：IAA（24：1）と300μlのフェノール（酸フェノール、RNAグレード）。ステップ2.2.3で有機相500μlのを使用してください。 </li><li> RNAフリースクリューキャップチューブに事前に以下の混合物を準備します00.5グラムのガラスビーズ、50μlの10％SDS、500μlのフェノール/クロロホルム：IAA（ステップ2.2.2で調製した）、マカロイド層（150〜175μL、それは非常に粘性ではない正確なように）。 400μlのTE（DEPC）で細胞ペレットを再懸濁し、スクリューキャップチューブに再懸濁した細胞を追加します。 </li><li>細胞を破壊し、氷上で1分間隔で2回60」パルス（ &#39;ホモジナイズ&#39;）のためのビーズビーターでスクリューキャップチューブを置く。遠心機10,000×gで （4℃）で10分間のサンプル。 </li><li> 10,000×gで （4℃）で5分間遠心新しいチューブに上相を移し、500μlのクロロホルムを追加：IAA（1〜24）を。 </li><li>溶解/結合緩衝2倍量の（1ミリリットル）を追加し、新鮮なチューブに上相500μlのを転送し、ピペッティングにより混合します。 RNA単離キットを用いて全RNAを単離し、製造業者の推奨するプロトコルに従う。 </li></ol></li></ol> 3. R​​NAクリーンアップ &lt;<html> OL&gt; <li> 、全RNAからDNAの汚染を除去100μlのDNアーゼIミックス（90μlのDNA分解酵素バッファーと10μlのDNアーゼI）を追加し、15〜25ºCで20〜30分間インキュベートする。 </li><li>ウォッシュは、RNアーゼキットを用いてRNAを掃除。溶出した体積の50μLを取得します。 </li></ol> RNA 4.分析<ol><li>分光光度計でRNAの濃度を決定します。 （ 図2）を次のようにアッセイを使用して、RNAの品質を決定する。 <ol><li> 20〜200 ng /μLでの濃度を得るためにDEPC水50μlでサンプルを1μl希釈する。 </li><li>製造元の指示に従ってバイオアナライザーで品質をチェックする1μlの希釈されたRNAサンプルを使用してください。 </li></ol></li><li>注：23Sの比率：2.0付近の16Sが良いとされている1 A260ユニットRNAは40 / mlのに対応している。。標識化のための推奨される量が10〜20μgのです。 </li></ol> 5. cDNAの調製と標識ntent &quot;&gt;注：以下のプロトコルは、cDNA調製と標識のために行った。 <ol><li>アニーリング<ol><li>自家製スライドまたは会社製スライドの5μgのためのトータルRNA 10-15 mlの濃度を維持し、300μlのPCRチューブにアニーリング反応を実行します。ミックス2μlのランダム量体（1.6μgの/μl）を有するRNA、必要に応じて18μlにアニーリング混合物の最終容量を維持するためにヌクレアーゼフリー水を追加します。 </li><li> 5分間、70℃でアニーリング混合してください。その後、チューブの底に反応をスピンダウンし、10分間（アニーリング）、および必要に応じて、混合物を室温に冷却する。少なくとも1分間氷上で反応チューブを置きます。 </li></ol></li><li>逆転写<ol><li>次のように逆転写酵素ミ​​ックスを調製する：18μlのアニーリングミックスに、12μlのマスターミックスを追加（6μlの5倍ファーストストランドバッファからなる、3μlの0.1 M DDT、1.2μlの25X AA-dUTPを/ヌクレオチドミックスと1.8μlのトンを逆転ranscriptase（同社製スライドの1μL）。 42℃で2-16時間反応ミックスを保管してください。 </li></ol></li></ol> cDNAのmRNAおよび精製の6分解<ol><li>反応混合物からmRNAを分解するために、約15分間、37℃で3 2.5 MのNaOHμlの場所を追加する。その後、NaOHをを中和するために、2M HEPES遊離酸の15μlを添加する。 </li><li> PCRクリーンアップカラムを使用してcDNA混合物を精製し、製造業者のプロトコルに従ってください。 </li></ol> cDNAの濃度の7測定<ol><li>分光光度計でのcDNAの濃度を測定します。ラベル付けを続行するには、cDNAの濃度が少なくとも60 ng /μLで（自家製スライド）または20 ng /μLで（同社製スライド）であることを確認してください。 </li></ol>アミン反応性色素および精製とcDNAの8。標識<ol><li>のcDNAを標識し、アミン反応性染料を使用してください。直接1アリコート（5μL）の有するcDNAをミックスアミン反応性染料。 </li><li> 60から90分間、暗闇の中で、RTで混合物をインキュベートし、色素標識cDNAの精製に直接進む。 PCRクリーンアップカラムを使用し、製造業者のプロトコルに従って、色素標識cDNAを精製する。溶出緩衝液50μl中のcDNAを溶出させる。 </li></ol>標識cDNAの9.測定<ol><li> cDNAにアミン反応性染料の取り込みを測定するために分光光度計を使用してください。アミン反応性染料の濃度は全量50μl中で少なくとも0.5ピコモル/μlであることを確認してください。 </li></ol>標識cDNA試料の10ミキシング<ol><li>自家製のスライドでは、cDNA濃度で30％以下の違いとのハイブリダイゼーションのためにすべての標識cDNAを使用しています。同社製のスライドでは、cDNA濃度で2倍の差を超えないとするcDNAを使用しています。 注：通常は、cDNAの約300 ngは同社製のスライドのために必要とされる、REQに比べて非常に少ないである自家製のスライドのcDNA量をuired。 </li></ol> 11.ハイブリダイゼーションおよび洗浄<ol><li> （;40μlの酵母RNAと自家製）デミ水、エタノール99％SHYバッファ：以下の試薬を使用してください。 SHYの最大1ミリリットルを準備します。 </li><li>装置およびソリューションの準備<ol><li>乾燥前に真空濃縮器とヒーター、少なくとも1時間に切り替えます。正しいハイブリダイゼーション温度に調整したセットポイント（ 肺炎球菌 DNAマイクロアレイのために、45℃を使用）とのハイブリダイゼーションオーブンをオンにし、。同様に、30〜60分間のハイブリダイゼーションカセットとオーブンを予熱。 </li><li>少なくとも30分間68˚CでSHYバッファーを予熱。 </li></ol></li><li>サンプル調製（標識cDNA） <ol><li>標識cDNA（最大30％の差）の同量を組み合わせる。ボリュームは7μLより小さくなるまで、高い気温（約40分）で、真空濃縮器を使用してサンプルを乾燥させる。 </li></ol></li><li>リフタースリップ<ol><li>クリーンリフター·スリップを使用してください。注：30μlをスライド上にロードすることができ±。 </li><li>石鹸、水道水と100％エタノールをたっぷりとリフター·スリップを清掃してください。注：ダーティリフタースリップは高いバックグラウンドを与える。 </li><li>空気はダスト粒子を吹き飛ばすためにエアピストルでリフター·スリップを乾燥させます。両側の白いテフロンライニングを下に向けてスライド上のクリーンリフタースリップを置きます。 </li></ol></li><li> （標識されたcDNAに）ハイブリダイゼーション緩衝液を添加すること<ol><li> 7μlのH 2 O中で乾燥させた色素試料を溶かし、2分間94℃でインキュベートする。 </li><li>すぐに、SHYバッファー（68℃）に予熱35μlを添加する沈殿物を取り除くために最高速度で1分間穏やかにスピン混ぜる。ロードされるまで約5分間68˚Cでプローブを予熱。 </li></ol></li><li>スライドリフタースリップアセンブリおよび予熱。 <ol><li> 50℃の熱ブロック上のハイブリダイゼーションスライドホルダーを配置します。加熱されたハイブリダイゼーションスライドホルダーとpにリフタースリップをDNAマイクロアレイスライドを配置分間のリフタースリップとスライドを再加熱。可能な限り迅速に次の手順を実行します。 </li><li>スライドの最後に、サンプルターゲットの40を添加する。流体は、毛管力によって、ガラス面の間に流れることを可能にする。ゆっくりと慎重にすべてペッティングを行います。 </li><li>すべての回でリフタースリップ水平にスライドを保ち、リフタースリップが動かなかったことを確認するために、ゆっくりと移動する。 </li><li>ハイブリダイゼーションオーブンの外に予め温めブリダイゼーションカセットを取り、マシンを閉じます。置きフィルター紙は、ハイブリダイゼーションカセットに3ミリリットル2X SSC（標準クエン酸生理食塩水）に浸漬した。 </li><li>静かにハイブリダイゼーションカセット内のスライドとのハイブリダイゼーションスライドホルダーを配置します。ハイブリダイゼーションカセットを閉じて、（約16〜18時間）オーブン再びハイブリダイゼーションに入れる。 </li></ol></li><li>スライド洗浄<ol><li>新鮮なウォッシュバッファI、IIおよびIII（洗浄ステップごとに750ミリリットル）を準備します。 500ウォッシュバッファーをmlの私は、2×SSC / 0.5％SDSを使用しています。 500ミリリットルのためにウォッシュバフをER IIは、1×SSC / 0.25％SDSを使用しています。 500ミリリットルのために洗浄バッファーIIIを使用し、1×SSC / 0.1％SDS（オプション） </li><li> 30°C（SDSが溶解していることを確認するため）で洗浄·バッファを置きます。 </li><li> 50mlで充填したファルコンチューブに、非常に穏やかに可能な限り迅速にスライドを沈めたが、ガラス管の円錐形の底部上に載るまで、Iを洗浄緩衝液。 </li><li>数秒後、リフタースリップがチューブの底に沈むとき、配列に傷をつけずにピンセットでスライドを取り出し、洗浄ステーションのラックに置く。時間がないギャップの洗浄に進みます。 </li><li> I（洗浄ステーションで）バッファを洗う500ミリリットルで5分間スライドを洗浄します。ウォッシュバッファ500ミリリットルで20〜30分（洗浄ステーションでの）IIのためにそれを第二の洗浄を与える。同様に、洗浄緩衝液500ミリリットル中で5分間スライドを洗浄III（オプション）（洗浄ステーションで）。 </li><li> 2000 rpmで2分間スライドを乾燥させます。 </li></ol></li></ol> 12.マイクロアレイ解析<ol><li>スキャン画像スキャナで各波長のフォルダ &quot;Joveのプロジェクト」で保存します。 </li><li>このソフトウェアを実行した後、以前に22を説明したように、最初にスキャンしたファイルを解析するためのソフトウェアを使用して、「赤」と緑の画像ファイル（-.635）などのように、赤の画像ファイル（-.550）をロードするために、「画像を開く」タブを選択します「グリーン」。タブ22を「負荷アレイリスト」を選択することで、画像ファイル上の肺炎球菌配列リストを持つギャルファイル（.gal）をアップロードします。 注：この配列リストは48のグリッドで構成され、各グリッド上で16行と15の列がありました。グリッド上の各スポットは、単一の遺伝子を表し、遺伝子名などのスポット情報は、スポット記述ファイルを介して追加されます。スポット番号は、左から右へ、上へ下へ与えられている。 </li><li>慎重にグリッドを選択]タブをスポットした後、スポットを整列させるための「機能を合わせ、ブロックを見つけ、配列を探す」。すべての機能を整列させた後、「分析」トンを選択することで、画像を解析AB。その結果、ヒストグラムや散布図を持つ新しいファイルを作成します。 「名前を付けて保存結果」タブからこのファイルを保存し、さらなる分析のため.gprファイルとして。 </li><li> 9を説明するように、自社開発Microprepソフトウェアパッケージをさらに正規化とデータの処理を実行します。 </li><li>色素スワップされたDNAマイクロアレイデータのための独立した生物学的複製を使用してください。 T-TEST1の変種のCyberTの実装を行い、9が説明されているように偽発見率（第一度近親者）を計算します。 </li><li>示差的に発現された遺伝子については、標準のように、p &lt;0.001とFDR &lt;0.05を取る。 </li><li> GEO（遺伝子発現オムニバス）アクセッション番号を取得するために、NCBIの提出ページにDNAマイクロアレイデータをアップロードします。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言。

我々は、細菌の全トランスクリプトーム解析を実行するために適用することができるユーザーフレンドリーなプロトコルを記述する。この特定の技術についてのキーポイントは、細胞が収穫される条件が変動することである。細胞RNAの単離を収穫した後、この技術は、細菌サンプルのすべてのタイプとなると正確に同一の手順に従うので、細菌培養の任意のタイプに適用することができる。?...

遺伝子の過剰発現またはノックアウトを含む、特定の時間に、または特定の条件下で単細胞生物または真核生物細胞のゲノムによりコードされるmRNAの存在量（トランスクリプトーム）のセット全体の研究では、トランスクリプトミクスと呼ばれています。トランスクリプトは、私たちはどの程度の遺伝子に観察することができる時間点Xにおける特定の条件の下で発現し、私たちに遺伝子が参照と比較して表しているかを強くに関する情報を提供している。 マイクロアレイは、固体基板上に二次元配列（通常、ガラススライドまたはシリコン薄膜電池）ハイスループットスクリーニングを用いて、生物学的物質の大量をアッセイするために使用され、小型化が可能で、多重化して並列処理し、検出されメソッド。マイクロアレイは、DNAマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、ペプチドマイクロアレイ、組織マイクロアレイ、抗体マイクロアレイ、細胞のマイクロアレイおよびその他を含む、さまざまな種類があります。 DNAマイクロアレイは、基本的には固体表面に固定された微視的DNAスポットは、通常、ガラスのアセンブリ。 DNAマイクロアレイは、同時に一つまたは複数の遺伝子のセットの発現レベルを測定するために、またはゲノム2,3の複数の領域の遺伝子型を決定するために使用される。プローブのピコモル（10 -12モル）がレポーターと呼ばれる特定のDNA配列を表し、各DNAスポット中に存在する。サンプルからの標識mRNA分子は、「ターゲット」と呼ばれている。フルオロフォアは、フルオロフォアで標識された標的のプローブ - 標的ハイブリダイゼーションおよび検出を測定するために使用される標的核酸配列の相対存在量を決定する。アレイは数万プローブの何千ものが含まれている可能性があるため、マイクロアレイ実験は、並行して複数の遺伝子検査を達成することができます。シンプルなマイクロアレイ実験のレイアウトは、 図1に示されている。最近では、それはこの技術は非常に費用対effectivを作るもの、これらの配列は、再利用可能であることを私たちと他のラボに設立されましたE。 8 -別のRNAの単離および精製技術は、C-TAB、SDSおよびGT方法4を含む長年にわたって開発されてきた。さらに、いくつかの市販のキットも用意しています。遺伝子発現のために高品質のRNAが非常に重要である。したがって、RNA単離方法は、RNAの最大量を得るために修飾される。同様に、cDNAのcDNA調製と標識のためのステップが最小化される。スキャン後のデータの正規化はまた、社内に構築ソフトウェアパッケージやツール9を利用して効率的に行われている。 肺炎球菌は、鼻咽頭に定着し、そのような肺炎、敗血症、中耳炎などの複数の感染症の原因であり、10髄膜炎グラム陽性ヒト病原体である。細菌は、成長および生存11,12に必要な栄養素を幅広く利用することができる。多くの研究が、上で行われているアミノ酸の重要性および毒性13,14におけるそれらの役割を強調して肺炎球菌窒素代謝と調節。本研究では、Sのトランスクリプトーム応答L-セリンの濃度を変更することにニューモニエは 、ヒト血漿中に豊富に存在するアミノ酸は、DNAマイクロアレイを使用して報告されている。 S.のトランスクリプトーム応答L-セリン（150μM）の最小濃度で成長させた肺炎連鎖球菌は、セリンの最大濃度（10 mM）の中で増殖させたものと比較した。化学的に規定された培地（CDMまたは最少培地）15はセリンの濃度を制御するために、本 ​​研究に使用した。この研究の焦点は、この技術はユーザーフレンドリーにすると、データ正規化と分析のためのさまざまなツールを提供することにある。そのため、ツールの数は、分析とデータ解釈のために開発された。 FIVA（機能情報ビューアーとアナライザ）が有する遺伝子のクラスターに含まれる処理情報のためのプラットフォームを提供します類似の遺伝子発現パターンおよび機能プロファイル16を構築する。検察官は、推定機能や遺伝子17の注釈の識別を容易に別のソフトウェアパッケージです。クラスタリング手法を利用することにより、開示するDNA結合部位検出アルゴリズムを提供する。遺伝子のシス -規制モチーフは、このアルゴリズム18を用いて投影することができる。 Genome2Dはゲノムマップ19上の遺伝子発現レベルの変化を特徴づけるために、異なる色の範囲を提供することにより、トランスクリプトームデータの可視化と分析のためのWindowsベースのプラットフォームを提供しています。コショウウェブサーバは、オールインワンの分析方法、レギュロン、プロモーターおよび転写因子結合部位20のためのマイニングのためのツールボックスに加えて、提供しています。細菌ゲノム中の遺伝子間領域の完全な注釈は、このパッケージを使用することによって達成することができる。それは彼らに実験を設計するためのプラットフォームを提供していますように生物学者が大幅にコショウの恩恵を受けることができますsの仮定情報は、 インビトロ 20 で確認することができるように。それらのほとんどは、自由に利用可能であり、データ正規化と分析を非常に信頼するように、これらのソフトウェアパッケージは、マイクロアレイ解析に大きく寄与する。

<table><tbody><tr><td>Acid phenol</td><td>SigmaAldrich</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>Roche RNA isolation kit</td><td>Roche Applied Science</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Glass beads</td><td></td><td>105015</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Boom</td><td>92013505.1000.</td><td></td></tr><tr><td>IAA</td><td></td><td>106630</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Nanodrop</td><td>ND-100</td><td></td></tr><tr><td>Agilent BioAnalyser</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III</td><td>Life technologies Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>AA-dUTP</td><td>Life technologies Invitrogen</td><td>AM8439</td><td></td></tr><tr><td>DDT</td><td>Life technologies Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>First Strand buffer</td><td>Life technologies Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SigmaAldrich</td><td>S8045-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SigmaAldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>DyLight-550</td><td>Thermoscientiffic</td><td>62262</td><td></td></tr><tr><td>DyLight-650</td><td>Thermoscientiffic</td><td>62265</td><td></td></tr><tr><td>SHY Buffer</td><td>SigmaAldrich</td><td>H7033-125ML</td><td></td></tr><tr><td>Speedvac cooler</td><td>Eppendorf</td><td>RUGNE3140</td><td>Speedvac concentrator plus</td></tr><tr><td>Hybridization oven</td><td>Grant Boekel</td><td>Iso-20</td><td></td></tr><tr><td>Lifter-slips</td><td>Erie Scientific</td><td>25x60I-M-5439</td><td></td></tr><tr><td>Wipe</td><td>KIMTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>SigmaAldrich</td><td>L3771-100g</td><td></td></tr><tr><td>SSC</td><td>SigmaAldrich</td><td>W302600-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>Genpix autoloader 4200A1</td><td>MSD analytical technologies</td><td></td><td>Microarray scanner</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>SigmaAldrich</td><td>104766</td><td></td></tr></tbody></table>

a fast and reliable pipeline for bacterial transcriptome analysis case study: serine-dependent gene regulation in streptococcus pneumoniae

遺伝子発現とその調節は、異なる条件下での細胞の挙動を理解することが非常に重要である。様々な技術は、遺伝子発現を研究するために、今日使用されているが、ほとんどが、全トランスクリプトームの発現の全体像を提供するという点で制限されている。 DNAマイクロアレイは、全体的な遺伝子発現の完全な概要を示し、迅速かつ経済的な研究技術を提供し、新規遺伝子の同定および転写因子結合部位を含むアプリケーションの膨大な数を持って、細胞の転写活性の特徴付けにも数千の分析に役立つ遺伝子の（単一の実験で）。本研究では、DNAマイクロアレイ解析に細胞収穫から細菌のトランスクリプトーム解析のための条件が最適化されている。考慮時間、コスト、実験の精度を考えると、この技術プラットフォームは、細菌のtranscriptoを研究するために非常に有用と普遍applicabaleであることが分かるMES。ここでは、Sの転写応答を比較することにより、ケーススタディなどの肺炎球菌を用いたDNAマイクロアレイ解析を行う肺炎連鎖球菌は、培地中にL-セリン濃度を変化の存在下で増殖させた。トータルRNAは、RNAの品質チェック用キットを用いて確認したRNA単離キットおよびRNAの品質を使用マカロイド方法を用いて単離した。 cDNAは、逆転写酵素を用いて調製し、cDNAサンプルを、二種のアミン反応性蛍光色素のいずれかを使用して標識した。マイクロアレイスライドを標識cDNAサンプル及びマイクロアレイデータのハイブリダイゼーションのために使用した自家製のDNAは、cDNAマイクロアレイデータの前処理ワーク（Microprep）を用いて分析した。最後に、サイバー-Tは、統計的に有意な差次的に発現される遺伝子の同定のためMicroprepを使用して生成されたデータを分析した。また、社内で構築されたソフトウェア·パッケージ（コショウ、FIVA、開示、検察官、Genome2D）を分析するために使用されたデータ。

RNA、cDNAの単離および分析 L-セリンは、必須アミノ酸の一つであり、ヒト血漿中のその濃度は、小児および成人における60〜150μMまで変化する。プリンおよびピリミジンの生合成におけるその役割は、代謝におけるその重要性を強調し、それはいくつかのアミノ酸（グリシン、システイン及びトリプトファン）の前駆体である。 S.の全トランスクリプ?...

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A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.

細菌のトランスクリプトーム解析ケーススタディのための高速かつ信頼性の高いパイプライン：セリン依存の遺伝子調節に<em&gt;肺炎球菌</em

Gene expression and its regulation are very important to understand the behavior of cells under different conditions. Various techniques are used nowadays ...

a-fast-reliable-pipeline-for-bacterial-transcriptome-analysis-case

Research

JoVE Journal

Biology

A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

10.3K ビュー.  University of Groningen. This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages. 

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A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some factors act directly on virulence genes; others control pathogenesis by adjusting the expression of downstream regulators or the accumulation of signals that affect regulator activity. While regulation has been studied extensively during in vitro growth, relatively little is known about how gene expression is adjusted during infection. Such information is important when a particular gene product is a candidate for therapeutic intervention. Transcriptional approaches like quantitative, real-time RT-PCR and RNA-Seq are powerful ways to examine gene expression on a global level but suffer from many technical challenges including low abundance of bacterial RNA compared to host RNA, and sample degradation by RNases. Evaluating regulation using fluorescent reporters is relatively easy and can be multiplexed with fluorescent proteins with unique spectral properties. The method allows for single-cell, spatiotemporal analysis of gene expression in tissues that exhibit complex three-dimensional architecture and physiochemical gradients that affect bacterial regulatory networks. Such information is lost when data are averaged over the bulk population. Herein, we describe a method for quantifying gene expression in bacterial pathogens in situ. The method is based on simple tissue processing and direct observation of fluorescence from reporter proteins. We demonstrate the utility of this system by examining the expression of Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), whose gene product is required for immune evasion and full virulence ex vivo and in vivo. We show that nuc-gfp is strongly expressed in renal abscesses and reveal heterogeneous gene expression due in part to apparent spatial regulation of nuc promoter activity in abscesses fully engaged with the immune response. The method can be applied to any bacterium with a manipulatable genetic system and any infection model, providing valuable information for preclinical studies and drug development.

Described here is a method for analyzing bacterial gene expression in animal tissues at a cellular level. This method provides a resource for studying the phenotypic diversity occurring within a bacterial population in response to the tissue environment during an infection.

感染した組織の細菌の遺伝子の規則を勉強する蛍光ベースのメソッド

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

遺伝学

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

肺炎球菌による鼻腔内コロニー形成時の炎症反応の特徴

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

免疫・感染学

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized notably due to the difficulty of identifying their mRNA targets. Here, we described a modified protocol of the MS2-Affinity Purification coupled with RNA Sequencing (MAPS) technology, aiming to reveal all RNA partners of a specific sRNA in vivo. Broadly, the MS2 aptamer is fused to the 5&#8217; extremity of the sRNA of interest. This construct is then expressed in vivo, allowing the MS2-sRNA to interact with its cellular partners. After bacterial harvesting, cells are mechanically lysed. The crude extract is loaded into an amylose-based chromatography column previously coated with the MS2 protein fused to the maltose binding protein. This enables the specific capture of MS2-sRNA and interacting RNAs. After elution, co-purified RNAs are identified by high-throughput RNA sequencing and subsequent bioinformatic analysis. The following protocol has been implemented in the Gram-positive human pathogen Staphylococcus aureus and is, in principle, transposable to any Gram-positive bacteria. To sum up, MAPS technology constitutes an efficient method to deeply explore the regulatory network of a particular sRNA, offering a snapshot of its whole targetome. However, it is important to keep in mind that putative targets identified by MAPS still need to be validated by complementary experimental approaches.

MAPS technology has been developed to scrutinize the targetome of a specific regulatory RNA in vivo. The sRNA of interest is tagged with a MS2 aptamer enabling the co-purification of its RNA partners and their identification by RNA sequencing. This modified protocol is particularly suited for Gram-positive bacteria.&#160;

グラム陽性菌におけるRNAシーケンシングと結合したMS2-アフィニティ精製

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

生化学

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of this method, in comparison to other approaches, is its ability to monitor translation by precisely mapping the position and number of ribosomes on a mRNA transcript.
In this article, we describe the consecutive stages of sample collection and preparation for RIBO-seq method in bacteria, highlighting the details relevant to the planning and execution of the experiment.
Since the RIBO-seq relies on intact ribosomes and related mRNAs, the key step is rapid inhibition of translation and adequate disintegration of cells. Thus, we suggest filtration and flash-freezing in liquid nitrogen for cell harvesting with an optional pretreatment with chloramphenicol to arrest translation in bacteria. For the disintegration, we propose grinding frozen cells with mortar and pestle in the presence of aluminum oxide to mechanically disrupt the cell wall. In this protocol, sucrose cushion or a sucrose gradient ultracentrifugation for monosome purification is not required. Instead, mRNA separation using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by the ribosomal footprint excision (28-30 nt band) is applied and provides satisfactory results. This largely simplifies the method as well as reduces the time and equipment requirements for the procedure. For library preparation, we recommend using the commercially available small RNA kit for Illumina sequencing from New England Biolabs, following manufacturer&#39;s guidelines with some degree of optimization.
The resulting cDNA libraries present appropriate quantity and quality required for next generation sequencing (NGS). Sequencing of the libraries prepared according to the described protocol results in 2 to 10 mln uniquely mapped reads per sample providing sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is quick and relatively easy and can be performed with standard laboratory equipment.

Here we describe the stages of sample collection and preparation for RIBO-seq in bacteria. Sequencing of the libraries prepared according to these guidelines results in sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is simple, uses standard laboratory equipment and takes seven days from lysis to obtaining libraries.

細菌におけるRIBO-seq:NGSシーケンシングのためのサンプル収集とライブラリ調製プロトコル

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

調節するc-ジ-GMPシグナリングで、小さな分子をスクリーニングするためのハイスループットセットアップの確立<em&gt;緑膿菌</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a natural producer of chloramphenicol, jadomycin, and pikromycin, which makes it an attractive candidate&#160;as a next-generation synthetic biology chassis. Therefore, genetic tools that accelerate the development of S. venezuelae ATCC 10712, as well as other Streptomyces spp. models, are highly desirable for natural product engineering and discovery. To this end, a dedicated S. venezuelae ATCC 10712 cell-free system is provided in this protocol to enable high-yield heterologous expression of high G+C (%) genes. This protocol is suitable for small-scale (10-100 &#956;L) batch reactions in either 96-well or 384-well plate format, while reactions are potentially scalable. The cell-free system is robust and can achieve high yields (~5-10 &#956;M) for a range of recombinant proteins in a minimal setup. This work also incorporates a broad plasmid toolset for real-time measurement of mRNA and protein synthesis, as well as in-gel fluorescence staining of tagged proteins. This protocol can also be integrated with high-throughput&#160;gene expression characterization workflows or the study of enzyme pathways from high G+C (%) genes present in Actinomycetes genomes.

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

This protocol details an enhanced method for synthesizing high yields of recombinant proteins from a Streptomyces venezuelae cell-free transcription-translation (TX-TL) system.

合成生物学と天然物アプリケーションのための高収量スト レプトマイス 転写翻訳ツールキット

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a ...

生物工学

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

ゲノムワイドな遺伝子欠失で<em&gt;ストレプトコッカス血統</em&gt;ハイスループットPCRによる

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

生物学

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, studies in this serotype have been hindered by the lack of genetic tools to modify it. In this study, we describe a method to genetically modify a serotype 1 clinical isolate (strain 519/43). Interestingly, this was achieved by exploiting the Pneumococcus&#8217; ability to naturally acquire DNA. However, unlike most pneumococci, the use of linear DNA was not successful; to mutate this important strain, a suicide plasmid had to be used. This methodology has provided the means for a deeper understanding of this elusive serotype, both in terms of its biology and pathogenicity. To validate the method, the major known pneumococcal toxin, pneumolysin, was mutated because it has a well-known and easy to follow phenotype. We showed that the mutant, as expected, lost its ability to lyse red blood cells. By being able to mutate an important gene in the serotype of interest, we were able to observe different phenotypes for loss of function mutants upon intraperitoneal and intranasal infections from the ones observed for other serotypes. In summary, this study proves that strain 519/43 (serotype 1) can be genetically modified.

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Here, we describe a S. pneumoniae serotype 1 strain 519/43 that can be genetically modified by using its ability to naturally acquire DNA and a suicide-plasmid. As proof of principle, an isogenic mutant in the pneumolysin (ply) gene was made.

血清型1肺 炎球 菌519/43株における変異体の構築

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, ...

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of the disease.&#160;To study such processes, researchers can use high-throughput sequencing techniques (RNA-seq) that measure the dynamic changes of the host transcriptome at different stages of infection, clinical outcomes, or disease severity.This investigation can lead to a better understanding of the diseases, as well as uncovering potential drug targets and treatments. The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing data from raw reads to functional analysis. The pipeline is divided into five steps: (1) quality control of the data; (2) mapping and annotation of genes; (3) statistical analysis to identify differentially expressed genes and co-expressed genes; (4) determination of the molecular degree of the perturbation of samples; and (5) functional analysis. Step 1 removes technical artifacts that may impact the quality of downstream analyses. In step 2, genes are mapped and annotated according to standard library protocols.&#160;The statistical analysis in step 3 identifies genes that are differentially expressed or co-expressed in infected samples, in comparison with non-infected ones. Sample variability and the presence of potential biological outliers are verified using the molecular degree of perturbation approach in step 4. Finally, the functional analysis in step 5 reveals the pathways associated with the disease phenotype. The presented pipeline aims to support researchers through the RNA-seq data analysis from host-pathogen interaction studies and drive future&#160;in vitro or in vivo experiments, that are essential to understand the molecular mechanism of infections.

The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing transcriptome data from raw reads to functional analysis, including quality control and preprocessing steps to advanced statistical analytical approaches.

宿主と病原体の相互作用を調するためのハイスループットトランスクリプトーム解析

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

Isolation of Total RNA from Pseudomonas aeruginosa within Biofilms for Measuring Gene Expression

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen that causes infections in the airways of cystic fibrosis (CF) patients. P. aeruginosa is known for its ability to form biofilms that are protected by a matrix of exopolysaccharides. This matrix allows the microorganisms to be more resilient to external factors, including antibiotic treatment. One of the most common methods of biofilm growth for research is in microtiter plates or chambered slides. The advantage of these systems is that they allow for the testing of multiple growth conditions, but their disadvantage is that they produce limited amounts of biofilm for RNA extraction. The purpose of this article is to provide a detailed, step by step protocol on how to extract total RNA from small amounts of biofilm of sufficient quality and quantity for high throughput sequencing. This protocol allows for the study of gene expression within these biofilm systems.

Isolation of Total RNA from Pseudomonas aeruginosa within Biofilms for Measuring Gene Expression

This protocol presents a method to isolate RNA from Pseudomonas aeruginosa biofilms grown in chamber slides for high throughput sequencing.

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen that causes infections in the airways of cystic fibrosis (CF) patients. P. aeruginosa is ...

細菌のトランスクリプトーム解析ケーススタディのための高速かつ信頼性の高いパイプライン：セリン依存の遺伝子調節に

要約

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感染した組織の細菌の遺伝子の規則を勉強する蛍光ベースのメソッド

肺炎球菌による鼻腔内コロニー形成時の炎症反応の特徴

グラム陽性菌におけるRNAシーケンシングと結合したMS2-アフィニティ精製

細菌におけるRIBO-seq:NGSシーケンシングのためのサンプル収集とライブラリ調製プロトコル

調節するc-ジ-GMPシグナリングで、小さな分子をスクリーニングするためのハイスループットセットアップの確立

合成生物学と天然物アプリケーションのための高収量ストレプトマイス転写翻訳ツールキット

ゲノムワイドな遺伝子欠失で

血清型1肺炎球菌519/43株における変異体の構築

宿主と病原体の相互作用を調するためのハイスループットトランスクリプトーム解析

Isolation of Total RNA from Pseudomonas aeruginosa within Biofilms for Measuring Gene Expression

細菌のトランスクリプトーム解析ケーススタディのための高速かつ信頼性の高いパイプライン：セリン依存の遺伝子調節に

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感染した組織の細菌の遺伝子の規則を勉強する蛍光ベースのメソッド

肺炎球菌による鼻腔内コロニー形成時の炎症反応の特徴

グラム陽性菌におけるRNAシーケンシングと結合したMS2-アフィニティ精製

細菌におけるRIBO-seq:NGSシーケンシングのためのサンプル収集とライブラリ調製プロトコル

調節するc-ジ-GMPシグナリングで、小さな分子をスクリーニングするためのハイスループットセットアップの確立

合成生物学と天然物アプリケーションのための高収量スト レプトマイス 転写翻訳ツールキット

ゲノムワイドな遺伝子欠失で

血清型1肺 炎球 菌519/43株における変異体の構築

宿主と病原体の相互作用を調するためのハイスループットトランスクリプトーム解析

Isolation of Total RNA from Pseudomonas aeruginosa within Biofilms for Measuring Gene Expression

合成生物学と天然物アプリケーションのための高収量ストレプトマイス転写翻訳ツールキット

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