私たちは、DNAマイクロアレイスライド制作のヘルプはアン·デ·ヨングとSiger Holsappelに感謝。バイオインフォマティクス解析のためのアン·デ·ヨングのサポートも歓迎です。また、紙を検討するためのJelle Slagerに感謝。ムハンマド·アフザールとイルファンManzoorはHECパキスタンの教員育成プログラムの下でGC大学、ファイサラバード、パキスタンでサポートされています。

1.メディアの調製、および細胞培養<ol><li> S.を育てる以前に11説明したように、肺炎 D39野生株21。 6.4 15の最終的なpHを50ミリリットル化学的に定義された培地（CDM）中（50ml中1/100比滅菌チューブ付き）、10％グリセロール中で-80 Oで保存細胞を接種するが、アミノ酸のL-セリンを省略混合物。 注：二つの異なるのCDMを使用した。 L-セリン（10ミリモル）の最大濃度を含有するL-セリンの最​​小濃度（150μM）およびその他を含むもの。この最小濃度は、基本的には、ヒト血漿中のL-セリンの濃度であり、その目的は、Sの遺伝子発現を比較することであるこの二つの条件の下で、肺炎の D39株。 </li></ol>総RNAの2の単離<ol><li>マテリアル<ol><li>全RNAの単離のために酸フェノール、RNAグレードを使用してください。 </li><li>マカロイド： <ol><li>の2グラムを一時停止100ミリリットルのTEでマカロイドし、5分間沸騰させる。 RTに冷却し、マカロイドgels.Centrifugeまで、超音波処理RT、4℃で50ミリリットルのTE pHが8店舗で再懸濁で5分間2000×gでソリューション。 </li></ol></li><li>ソリューション： <ol><li>ジエチルピロカーボネート（DEPC）を持つすべてのソリューションを扱う。 15分間37℃でO / Nインキュベートし、オートクレーブ、100μlのDEPC / 100ミリリットル溶液を加える。 </li></ol></li></ol></li><li>方法論<ol><li> Sの50ミリリットルを育てる中期指数期（OD〜0.3）まで、37°C ​​の （なしの揺れ）で50 mlチューブで、肺炎 D39細胞培養。 2分間10,000×gで上に4℃で遠心し培養。メディアを破棄し、直ちに液体窒素中で細胞ペレットを凍結する。 </li><li>プレミックス300μlのクロロホルム：IAA（24：1）と300μlのフェノール（酸フェノール、RNAグレード）。ステップ2.2.3で有機相500μlのを使用してください。 </li><li> RNAフリースクリューキャップチューブに事前に以下の混合物を準備します00.5グラムのガラスビーズ、50μlの10％SDS、500μlのフェノール/クロロホルム：IAA（ステップ2.2.2で調製した）、マカロイド層（150〜175μL、それは非常に粘性ではない正確なように）。 400μlのTE（DEPC）で細胞ペレットを再懸濁し、スクリューキャップチューブに再懸濁した細胞を追加します。 </li><li>細胞を破壊し、氷上で1分間隔で2回60」パルス（ &#39;ホモジナイズ&#39;）のためのビーズビーターでスクリューキャップチューブを置く。遠心機10,000×gで （4℃）で10分間のサンプル。 </li><li> 10,000×gで （4℃）で5分間遠心新しいチューブに上相を移し、500μlのクロロホルムを追加：IAA（1〜24）を。 </li><li>溶解/結合緩衝2倍量の（1ミリリットル）を追加し、新鮮なチューブに上相500μlのを転送し、ピペッティングにより混合します。 RNA単離キットを用いて全RNAを単離し、製造業者の推奨するプロトコルに従う。 </li></ol></li></ol> 3. R​​NAクリーンアップ &lt;<html> OL&gt; <li> 、全RNAからDNAの汚染を除去100μlのDNアーゼIミックス（90μlのDNA分解酵素バッファーと10μlのDNアーゼI）を追加し、15〜25ºCで20〜30分間インキュベートする。 </li><li>ウォッシュは、RNアーゼキットを用いてRNAを掃除。溶出した体積の50μLを取得します。 </li></ol> RNA 4.分析<ol><li>分光光度計でRNAの濃度を決定します。 （ 図2）を次のようにアッセイを使用して、RNAの品質を決定する。 <ol><li> 20〜200 ng /μLでの濃度を得るためにDEPC水50μlでサンプルを1μl希釈する。 </li><li>製造元の指示に従ってバイオアナライザーで品質をチェックする1μlの希釈されたRNAサンプルを使用してください。 </li></ol></li><li>注：23Sの比率：2.0付近の16Sが良いとされている1 A260ユニットRNAは40 / mlのに対応している。。標識化のための推奨される量が10〜20μgのです。 </li></ol> 5. cDNAの調製と標識ntent &quot;&gt;注：以下のプロトコルは、cDNA調製と標識のために行った。 <ol><li>アニーリング<ol><li>自家製スライドまたは会社製スライドの5μgのためのトータルRNA 10-15 mlの濃度を維持し、300μlのPCRチューブにアニーリング反応を実行します。ミックス2μlのランダム量体（1.6μgの/μl）を有するRNA、必要に応じて18μlにアニーリング混合物の最終容量を維持するためにヌクレアーゼフリー水を追加します。 </li><li> 5分間、70℃でアニーリング混合してください。その後、チューブの底に反応をスピンダウンし、10分間（アニーリング）、および必要に応じて、混合物を室温に冷却する。少なくとも1分間氷上で反応チューブを置きます。 </li></ol></li><li>逆転写<ol><li>次のように逆転写酵素ミ​​ックスを調製する：18μlのアニーリングミックスに、12μlのマスターミックスを追加（6μlの5倍ファーストストランドバッファからなる、3μlの0.1 M DDT、1.2μlの25X AA-dUTPを/ヌクレオチドミックスと1.8μlのトンを逆転ranscriptase（同社製スライドの1μL）。 42℃で2-16時間反応ミックスを保管してください。 </li></ol></li></ol> cDNAのmRNAおよび精製の6分解<ol><li>反応混合物からmRNAを分解するために、約15分間、37℃で3 2.5 MのNaOHμlの場所を追加する。その後、NaOHをを中和するために、2M HEPES遊離酸の15μlを添加する。 </li><li> PCRクリーンアップカラムを使用してcDNA混合物を精製し、製造業者のプロトコルに従ってください。 </li></ol> cDNAの濃度の7測定<ol><li>分光光度計でのcDNAの濃度を測定します。ラベル付けを続行するには、cDNAの濃度が少なくとも60 ng /μLで（自家製スライド）または20 ng /μLで（同社製スライド）であることを確認してください。 </li></ol>アミン反応性色素および精製とcDNAの8。標識<ol><li>のcDNAを標識し、アミン反応性染料を使用してください。直接1アリコート（5μL）の有するcDNAをミックスアミン反応性染料。 </li><li> 60から90分間、暗闇の中で、RTで混合物をインキュベートし、色素標識cDNAの精製に直接進む。 PCRクリーンアップカラムを使用し、製造業者のプロトコルに従って、色素標識cDNAを精製する。溶出緩衝液50μl中のcDNAを溶出させる。 </li></ol>標識cDNAの9.測定<ol><li> cDNAにアミン反応性染料の取り込みを測定するために分光光度計を使用してください。アミン反応性染料の濃度は全量50μl中で少なくとも0.5ピコモル/μlであることを確認してください。 </li></ol>標識cDNA試料の10ミキシング<ol><li>自家製のスライドでは、cDNA濃度で30％以下の違いとのハイブリダイゼーションのためにすべての標識cDNAを使用しています。同社製のスライドでは、cDNA濃度で2倍の差を超えないとするcDNAを使用しています。 注：通常は、cDNAの約300 ngは同社製のスライドのために必要とされる、REQに比べて非常に少ないである自家製のスライドのcDNA量をuired。 </li></ol> 11.ハイブリダイゼーションおよび洗浄<ol><li> （;40μlの酵母RNAと自家製）デミ水、エタノール99％SHYバッファ：以下の試薬を使用してください。 SHYの最大1ミリリットルを準備します。 </li><li>装置およびソリューションの準備<ol><li>乾燥前に真空濃縮器とヒーター、少なくとも1時間に切り替えます。正しいハイブリダイゼーション温度に調整したセットポイント（ 肺炎球菌 DNAマイクロアレイのために、45℃を使用）とのハイブリダイゼーションオーブンをオンにし、。同様に、30〜60分間のハイブリダイゼーションカセットとオーブンを予熱。 </li><li>少なくとも30分間68˚CでSHYバッファーを予熱。 </li></ol></li><li>サンプル調製（標識cDNA） <ol><li>標識cDNA（最大30％の差）の同量を組み合わせる。ボリュームは7μLより小さくなるまで、高い気温（約40分）で、真空濃縮器を使用してサンプルを乾燥させる。 </li></ol></li><li>リフタースリップ<ol><li>クリーンリフター·スリップを使用してください。注：30μlをスライド上にロードすることができ±。 </li><li>石鹸、水道水と100％エタノールをたっぷりとリフター·スリップを清掃してください。注：ダーティリフタースリップは高いバックグラウンドを与える。 </li><li>空気はダスト粒子を吹き飛ばすためにエアピストルでリフター·スリップを乾燥させます。両側の白いテフロンライニングを下に向けてスライド上のクリーンリフタースリップを置きます。 </li></ol></li><li> （標識されたcDNAに）ハイブリダイゼーション緩衝液を添加すること<ol><li> 7μlのH 2 O中で乾燥させた色素試料を溶かし、2分間94℃でインキュベートする。 </li><li>すぐに、SHYバッファー（68℃）に予熱35μlを添加する沈殿物を取り除くために最高速度で1分間穏やかにスピン混ぜる。ロードされるまで約5分間68˚Cでプローブを予熱。 </li></ol></li><li>スライドリフタースリップアセンブリおよび予熱。 <ol><li> 50℃の熱ブロック上のハイブリダイゼーションスライドホルダーを配置します。加熱されたハイブリダイゼーションスライドホルダーとpにリフタースリップをDNAマイクロアレイスライドを配置分間のリフタースリップとスライドを再加熱。可能な限り迅速に次の手順を実行します。 </li><li>スライドの最後に、サンプルターゲットの40を添加する。流体は、毛管力によって、ガラス面の間に流れることを可能にする。ゆっくりと慎重にすべてペッティングを行います。 </li><li>すべての回でリフタースリップ水平にスライドを保ち、リフタースリップが動かなかったことを確認するために、ゆっくりと移動する。 </li><li>ハイブリダイゼーションオーブンの外に予め温めブリダイゼーションカセットを取り、マシンを閉じます。置きフィルター紙は、ハイブリダイゼーションカセットに3ミリリットル2X SSC（標準クエン酸生理食塩水）に浸漬した。 </li><li>静かにハイブリダイゼーションカセット内のスライドとのハイブリダイゼーションスライドホルダーを配置します。ハイブリダイゼーションカセットを閉じて、（約16〜18時間）オーブン再びハイブリダイゼーションに入れる。 </li></ol></li><li>スライド洗浄<ol><li>新鮮なウォッシュバッファI、IIおよびIII（洗浄ステップごとに750ミリリットル）を準備します。 500ウォッシュバッファーをmlの私は、2×SSC / 0.5％SDSを使用しています。 500ミリリットルのためにウォッシュバフをER IIは、1×SSC / 0.25％SDSを使用しています。 500ミリリットルのために洗浄バッファーIIIを使用し、1×SSC / 0.1％SDS（オプション） </li><li> 30°C（SDSが溶解していることを確認するため）で洗浄·バッファを置きます。 </li><li> 50mlで充填したファルコンチューブに、非常に穏やかに可能な限り迅速にスライドを沈めたが、ガラス管の円錐形の底部上に載るまで、Iを洗浄緩衝液。 </li><li>数秒後、リフタースリップがチューブの底に沈むとき、配列に傷をつけずにピンセットでスライドを取り出し、洗浄ステーションのラックに置く。時間がないギャップの洗浄に進みます。 </li><li> I（洗浄ステーションで）バッファを洗う500ミリリットルで5分間スライドを洗浄します。ウォッシュバッファ500ミリリットルで20〜30分（洗浄ステーションでの）IIのためにそれを第二の洗浄を与える。同様に、洗浄緩衝液500ミリリットル中で5分間スライドを洗浄III（オプション）（洗浄ステーションで）。 </li><li> 2000 rpmで2分間スライドを乾燥させます。 </li></ol></li></ol> 12.マイクロアレイ解析<ol><li>スキャン画像スキャナで各波長のフォルダ &quot;Joveのプロジェクト」で保存します。 </li><li>このソフトウェアを実行した後、以前に22を説明したように、最初にスキャンしたファイルを解析するためのソフトウェアを使用して、「赤」と緑の画像ファイル（-.635）などのように、赤の画像ファイル（-.550）をロードするために、「画像を開く」タブを選択します「グリーン」。タブ22を「負荷アレイリスト」を選択することで、画像ファイル上の肺炎球菌配列リストを持つギャルファイル（.gal）をアップロードします。 注：この配列リストは48のグリッドで構成され、各グリッド上で16行と15の列がありました。グリッド上の各スポットは、単一の遺伝子を表し、遺伝子名などのスポット情報は、スポット記述ファイルを介して追加されます。スポット番号は、左から右へ、上へ下へ与えられている。 </li><li>慎重にグリッドを選択]タブをスポットした後、スポットを整列させるための「機能を合わせ、ブロックを見つけ、配列を探す」。すべての機能を整列させた後、「分析」トンを選択することで、画像を解析AB。その結果、ヒストグラムや散布図を持つ新しいファイルを作成します。 「名前を付けて保存結果」タブからこのファイルを保存し、さらなる分析のため.gprファイルとして。 </li><li> 9を説明するように、自社開発Microprepソフトウェアパッケージをさらに正規化とデータの処理を実行します。 </li><li>色素スワップされたDNAマイクロアレイデータのための独立した生物学的複製を使用してください。 T-TEST1の変種のCyberTの実装を行い、9が説明されているように偽発見率（第一度近親者）を計算します。 </li><li>示差的に発現された遺伝子については、標準のように、p &lt;0.001とFDR &lt;0.05を取る。 </li><li> GEO（遺伝子発現オムニバス）アクセッション番号を取得するために、NCBIの提出ページにDNAマイクロアレイデータをアップロードします。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言。

我々は、細菌の全トランスクリプトーム解析を実行するために適用することができるユーザーフレンドリーなプロトコルを記述する。この特定の技術についてのキーポイントは、細胞が収穫される条件が変動することである。細胞RNAの単離を収穫した後、この技術は、細菌サンプルのすべてのタイプとなると正確に同一の手順に従うので、細菌培養の任意のタイプに適用することができる。?...

遺伝子の過剰発現またはノックアウトを含む、特定の時間に、または特定の条件下で単細胞生物または真核生物細胞のゲノムによりコードされるmRNAの存在量（トランスクリプトーム）のセット全体の研究では、トランスクリプトミクスと呼ばれています。トランスクリプトは、私たちはどの程度の遺伝子に観察することができる時間点Xにおける特定の条件の下で発現し、私たちに遺伝子が参照と比較して表しているかを強くに関する情報を提供している。 マイクロアレイは、固体基板上に二次元配列（通常、ガラススライドまたはシリコン薄膜電池）ハイスループットスクリーニングを用いて、生物学的物質の大量をアッセイするために使用され、小型化が可能で、多重化して並列処理し、検出されメソッド。マイクロアレイは、DNAマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、ペプチドマイクロアレイ、組織マイクロアレイ、抗体マイクロアレイ、細胞のマイクロアレイおよびその他を含む、さまざまな種類があります。 DNAマイクロアレイは、基本的には固体表面に固定された微視的DNAスポットは、通常、ガラスのアセンブリ。 DNAマイクロアレイは、同時に一つまたは複数の遺伝子のセットの発現レベルを測定するために、またはゲノム2,3の複数の領域の遺伝子型を決定するために使用される。プローブのピコモル（10 -12モル）がレポーターと呼ばれる特定のDNA配列を表し、各DNAスポット中に存在する。サンプルからの標識mRNA分子は、「ターゲット」と呼ばれている。フルオロフォアは、フルオロフォアで標識された標的のプローブ - 標的ハイブリダイゼーションおよび検出を測定するために使用される標的核酸配列の相対存在量を決定する。アレイは数万プローブの何千ものが含まれている可能性があるため、マイクロアレイ実験は、並行して複数の遺伝子検査を達成することができます。シンプルなマイクロアレイ実験のレイアウトは、 図1に示されている。最近では、それはこの技術は非常に費用対effectivを作るもの、これらの配列は、再利用可能であることを私たちと他のラボに設立されましたE。 8 -別のRNAの単離および精製技術は、C-TAB、SDSおよびGT方法4を含む長年にわたって開発されてきた。さらに、いくつかの市販のキットも用意しています。遺伝子発現のために高品質のRNAが非常に重要である。したがって、RNA単離方法は、RNAの最大量を得るために修飾される。同様に、cDNAのcDNA調製と標識のためのステップが最小化される。スキャン後のデータの正規化はまた、社内に構築ソフトウェアパッケージやツール9を利用して効率的に行われている。 肺炎球菌は、鼻咽頭に定着し、そのような肺炎、敗血症、中耳炎などの複数の感染症の原因であり、10髄膜炎グラム陽性ヒト病原体である。細菌は、成長および生存11,12に必要な栄養素を幅広く利用することができる。多くの研究が、上で行われているアミノ酸の重要性および毒性13,14におけるそれらの役割を強調して肺炎球菌窒素代謝と調節。本研究では、Sのトランスクリプトーム応答L-セリンの濃度を変更することにニューモニエは 、ヒト血漿中に豊富に存在するアミノ酸は、DNAマイクロアレイを使用して報告されている。 S.のトランスクリプトーム応答L-セリン（150μM）の最小濃度で成長させた肺炎連鎖球菌は、セリンの最大濃度（10 mM）の中で増殖させたものと比較した。化学的に規定された培地（CDMまたは最少培地）15はセリンの濃度を制御するために、本 ​​研究に使用した。この研究の焦点は、この技術はユーザーフレンドリーにすると、データ正規化と分析のためのさまざまなツールを提供することにある。そのため、ツールの数は、分析とデータ解釈のために開発された。 FIVA（機能情報ビューアーとアナライザ）が有する遺伝子のクラスターに含まれる処理情報のためのプラットフォームを提供します類似の遺伝子発現パターンおよび機能プロファイル16を構築する。検察官は、推定機能や遺伝子17の注釈の識別を容易に別のソフトウェアパッケージです。クラスタリング手法を利用することにより、開示するDNA結合部位検出アルゴリズムを提供する。遺伝子のシス -規制モチーフは、このアルゴリズム18を用いて投影することができる。 Genome2Dはゲノムマップ19上の遺伝子発現レベルの変化を特徴づけるために、異なる色の範囲を提供することにより、トランスクリプトームデータの可視化と分析のためのWindowsベースのプラットフォームを提供しています。コショウウェブサーバは、オールインワンの分析方法、レギュロン、プロモーターおよび転写因子結合部位20のためのマイニングのためのツールボックスに加えて、提供しています。細菌ゲノム中の遺伝子間領域の完全な注釈は、このパッケージを使用することによって達成することができる。それは彼らに実験を設計するためのプラットフォームを提供していますように生物学者が大幅にコショウの恩恵を受けることができますsの仮定情報は、 インビトロ 20 で確認することができるように。それらのほとんどは、自由に利用可能であり、データ正規化と分析を非常に信頼するように、これらのソフトウェアパッケージは、マイクロアレイ解析に大きく寄与する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid phenol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P4682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche RNA isolation kit</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>11828665001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td></td>
			<td>105015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Boom</td>
			<td>92013505.1000.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAA</td>
			<td></td>
			<td>106630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ND-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent BioAnalyser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2940CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AA-dUTP</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>AM8439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDT</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First Strand buffer</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>S8045-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight-550</td>
			<td>Thermoscientiffic</td>
			<td>62262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight-650</td>
			<td>Thermoscientiffic</td>
			<td>62265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHY Buffer</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>H7033-125ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speedvac cooler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>RUGNE3140</td>
			<td>Speedvac concentrator plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Grant Boekel</td>
			<td>Iso-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifter-slips</td>
			<td>Erie Scientific</td>
			<td>25x60I-M-5439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wipe</td>
			<td>KIMTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>L3771-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>W302600-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genpix autoloader 4200A1</td>
			<td>MSD analytical technologies</td>
			<td></td>
			<td>Microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>104766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fast and reliable pipeline for bacterial transcriptome analysis case study: serine-dependent gene regulation in streptococcus pneumoniae

遺伝子発現とその調節は、異なる条件下での細胞の挙動を理解することが非常に重要である。様々な技術は、遺伝子発現を研究するために、今日使用されているが、ほとんどが、全トランスクリプトームの発現の全体像を提供するという点で制限されている。 DNAマイクロアレイは、全体的な遺伝子発現の完全な概要を示し、迅速かつ経済的な研究技術を提供し、新規遺伝子の同定および転写因子結合部位を含むアプリケーションの膨大な数を持って、細胞の転写活性の特徴付けにも数千の分析に役立つ遺伝子の（単一の実験で）。本研究では、DNAマイクロアレイ解析に細胞収穫から細菌のトランスクリプトーム解析のための条件が最適化されている。考慮時間、コスト、実験の精度を考えると、この技術プラットフォームは、細菌のtranscriptoを研究するために非常に有用と普遍applicabaleであることが分かるMES。ここでは、Sの転写応答を比較することにより、ケーススタディなどの肺炎球菌を用いたDNAマイクロアレイ解析を行う肺炎連鎖球菌は、培地中にL-セリン濃度を変化の存在下で増殖させた。トータルRNAは、RNAの品質チェック用キットを用いて確認したRNA単離キットおよびRNAの品質を使用マカロイド方法を用いて単離した。 cDNAは、逆転写酵素を用いて調製し、cDNAサンプルを、二種のアミン反応性蛍光色素のいずれかを使用して標識した。マイクロアレイスライドを標識cDNAサンプル及びマイクロアレイデータのハイブリダイゼーションのために使用した自家製のDNAは、cDNAマイクロアレイデータの前処理ワーク（Microprep）を用いて分析した。最後に、サイバー-Tは、統計的に有意な差次的に発現される遺伝子の同定のためMicroprepを使用して生成されたデータを分析した。また、社内で構築されたソフトウェア·パッケージ（コショウ、FIVA、開示、検察官、Genome2D）を分析するために使用されたデータ。

RNA、cDNAの単離および分析 L-セリンは、必須アミノ酸の一つであり、ヒト血漿中のその濃度は、小児および成人における60〜150μMまで変化する。プリンおよびピリミジンの生合成におけるその役割は、代謝におけるその重要性を強調し、それはいくつかのアミノ酸（グリシン、システイン及びトリプトファン）の前駆体である。 S.の全トランスクリプ?...

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A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.

細菌のトランスクリプトーム解析ケーススタディのための高速かつ信頼性の高いパイプライン：セリン依存の遺伝子調節に<em&gt;肺炎球菌</em

Gene expression and its regulation are very important to understand the behavior of cells under different conditions. Various techniques are used nowadays ...

a-fast-reliable-pipeline-for-bacterial-transcriptome-analysis-case

Research

JoVE Journal

Biology

A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

10.3K ビュー.  University of Groningen. This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages. 

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

マイクロアレイを用いた細菌の遺伝子発現解析

生物学

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離<em&gt; in vitroで</em&gt; mRNAに沿って並進一時サイトを識別するために

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してSECM逮捕シーケンスを使用して、

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

ゲノムワイドな遺伝子欠失で<em&gt;ストレプトコッカス血統</em&gt;ハイスループットPCRによる

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

培養哺乳動物細胞内の生物学的経路のユビキチンおよびユビキチン様システムレギュレータを識別するために、siRNAのスクリーニング

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

細菌群集の特徴付けのための効率的な核酸抽出および16S rRNAの遺伝子配列決定

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

以下のための遺伝学的および生化学的アプローチ<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;タンパク質のオリゴマーの評価：リアノジン受容体のケーススタディ

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus on one or more gene families that are significant to the organism and study. In this protocol, we outline bioinformatic steps to generate a phylogeny and to quantify the expression of genes of interest. Phylogenetic trees can give insight into how genes are evolving within and between species as well as reveal orthology. These results can be enhanced using RNA-seq data to compare the expression of these genes in different individuals or tissues. Studies of molecular evolution and expression can reveal modes of evolution and conservation of gene function between species. The characterization of a gene family can serve as a springboard for future studies and can highlight an important gene family in a new genome or transcriptome paper.

The purpose of this protocol is to investigate the evolution and expression of candidate genes using RNA sequencing data.

RNA-seqを用いた分子進化と遺伝子発現を探るバイオインフォマティクスのパイプライン

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...