Wir danken Anne de Jong und Siger Holsappel für die Hilfe bei der DNA-Microarrays Schiebe Produktion. Unterstützung Anne de Jong für bioinformatische Analyse wird auch geschätzt. Wir danken auch Jelle Slager zur Überprüfung des Papiers. Muhammad Afzal und Irfan Manzoor werden von der GC-Universität, Faisalabad, Pakistan unter der Fakultätsentwicklungsprogramms der HEC Pakistan unterstützt.

1. Vorbereitung der Medien und Zellkultur <ol><li> Wachsen S. pneumoniae D39 Wildtyp-Stamm 21, wie zuvor 11 beschrieben. Beimpfen von Zellen bei -80 ° C in 10% Glycerin (mit 1/100 Verhältnis in 50 ml sterile Röhrchen) in 50 ml chemisch definiertem Medium (CDM) mit einem End-pH von 6,4 15 gespeichert, aber ohne L-serin aus dem Aminosäure Mischung. Hinweis: zwei verschiedene CDM verwendet wurden; eine mit einer Mindestkonzentration von L-Serin (150 uM), und die andere, die eine maximale Konzentration von L-Serin (10 mM). Diese Mindestkonzentration ist im Allgemeinen die Konzentration von L-Serin im menschlichen Blutplasma, und das Ziel ist es, die Genexpression von S. vergleiche pneumoniae D39-Stamm unter diesen beiden Bedingungen. </li></ol> 2. Isolierung von Gesamt-RNA <ol><li> Materialien <ol><li> Verwenden Säure Phenol, RNA-Note für die Isolierung von Gesamt-RNA. </li><li> Macaloid: <ol><li> Suspend 2 GrammMacaloid in 100 ml TE und kochen für 5 min. Abkühlen auf RT und beschallen bis Macaloid gels.Centrifuge die Lösung bei 2000 × g für 5 min bei RT, Resuspendieren in 50 ml TE pH 8 und bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Lösungen: <ol><li> Behandeln Sie alle Lösungen mit Diethylpyrocarbonat (DEPC). 100 l DEPC / 100 ml Lösung, Inkubation O / N bei 37 ° C und Autoklaven für 15 min. </li></ol></li></ol></li><li> Methodik <ol><li> Wachsen 50 ml S. pneumoniae D39 Zellkultur in 50 ml-Röhrchen bei 37 ° C (ohne Schütteln) bis Mitte exponentiellen Phase (OD ~ 0.3). Centrifuge Kulturen bei 4 ° C auf 10.000 × g für 2 min. Entsorgen Medien und unverzüglich sperren Zellpellets in flüssigem Stickstoff. </li><li> Vormischung 300 ul Chloroform: IAA (24: 1) und 300 &amp; mgr; l Phenol (Säure Phenol, RNA-Qualität). Verwenden 500 &amp; mgr; l der organischen Phase in Schritt 2.2.3. </li><li> Bereiten Sie die folgende Mischung im Voraus in RNA-free-Schraube Kappe Rohre: 00,5 g Glasperlen, 50 ul 10% SDS, 500 ul Phenol / Chloroform: IAA (wie in Schritt 2.2.2 vorbereitet), Macaloid Schicht (150 bis 175 &amp; mgr; l, nicht fordern, wie es ist sehr viskos). Resuspendieren der Zellpellets in 400 ul TE (DEPC) und fügen Sie die resuspendierten Zellen in den Schraubverschluss Röhrchen. </li><li> Um die Zellen zu brechen, legen Sie die Schraubverschluss Röhrchen in einem Kugelmühle für 2x 60 &quot;Impulse (&quot; homogenisieren &quot;) mit 1 min Pause auf dem Eis. Zentrifuge werden die Proben für 10 min bei 10.000 × g (4 ° C). </li><li> Wird die obere Phase in ein frisches Röhrchen, 500 ul Chloroform: IAA (24: 1) und Zentrifuge 5 min bei 10.000 × g (4 ° C). </li><li> Übertragen Sie 500 ul der oberen Phase in frische Röhrchen, fügen Sie 2 Volumina (1 ml) der Lyse / Bindungspuffer und mischen durch Auf-und Abpipettieren. Isolieren der Gesamt-RNA unter Verwendung der RNA-Isolierung Kit und folgen Sie den Hersteller empfohlenen Protokoll. </li></ol></li></ol> 3. RNA Cleanup &lt;<html> ol&gt; <li> Um die Kontamination von DNA aus Gesamt-RNA zu entfernen, fügen Sie 100 ul DNAseI Mix (90 ul DNAse Puffer und 10 ul DNAseI) und Inkubation für 20 bis 30 min bei 15-25 ° C. </li><li> Wash gereinigt RNA unter Verwendung des RNAse-Kit. Zu erhalten 50 &amp; mgr; l der eluierten Volumens. </li></ol> 4. Analyse der RNA <ol><li> Bestimmen Sie die Konzentration der RNA auf einem Spektrophotometer. Bestimmen die Qualität der RNA durch die Verwendung eines Assay folgendermaßen (Abbildung 2). <ol><li> Verdünnen Sie 1 ul Probe mit 50 ul DEPC-Wasser auf eine Konzentration von 20 bis 200 ng / ul erhalten. </li><li> Verwenden Sie 1 ul verdünnt RNA-Probe, um die Qualität auf dem Bioanalyzer gemäß den Anweisungen des Herstellers zu überprüfen. </li></ol></li><li> Hinweis: ein Verhältnis von 23S: 16S von etwa 2,0 als gut 1 A260 Einheit RNA entspricht 40 &amp; mgr; g / ml.. Eine empfohlene Menge für Kennzeichnung ist 10-20 &amp; mgr; g. </li></ol> 5. cDNA Vorbereitung und Kennzeichnung ntent &quot;&gt; Hinweis: Das folgende Protokoll wurde für die cDNA-Zubereitung und Kennzeichnung gefolgt. <ol><li> Glühen <ol><li> Führen Annealingreaktion in 300 ul PCR-Röhrchen, wobei die Konzentration von Gesamt-RNA von 10 bis 15 &amp; mgr; g für hausgemachte Dias oder 5 ug für Unternehmen gemachten Folien. Mix-RNA mit 2 &amp; mgr; Zufalls Nonamere (1,6 pg / pl) und fügen Sie Nuklease-freies Wasser, wenn notwendig, die endgültige Volumen des Glühen Mischung auf 18 &amp; mgr; l zu halten. </li><li> Halten Sie die Annealing-Mischung bei 70 ° C für 5 min. Danach kühlen die Mischung auf RT für 10 min (Annealing) und, wenn nötig, Spin-down die Reaktionen auf den Boden des Rohrs. Platzieren Sie die Reaktionsröhrchen auf Eis für mindestens 1 min. </li></ol></li><li> Reverse Transkription <ol><li> Bereiten Sie die Reverse-Transkriptase-Mischung wie folgt: 18 &amp; mgr; Glühen Mischung, fügen Sie 12 ul-Master-Mix (bestehend aus 6 ul 5x First Strand Buffer, 3 ul 0,1 M DDT, 1,2 ul 25x AA-dUTP / Nukleotid-Mischung und 1,8 ul Reverse transcriptase (1 ul für Unternehmen gemachten Folien). Halten Sie die Reaktionsmischung für 2-16 h bei 42 ° C. </li></ol></li></ol> 6. Abbau von mRNA und Reinigung von cDNA <ol><li> Um die mRNA aus dem Reaktionsgemisch verschlechtern, werden 3 ul 2,5 M NaOH, bei 37 ° C für etwa 15 min. Nach Zusatz von 15 ul 2 M HEPES-freie Säure, um die NaOH neutralisieren. </li><li> Reinige den cDNA-Gemisch unter Verwendung von PCR Clean-up-Säulen und folgen Sie dem Protokoll des Herstellers. </li></ol> 7. Messung der cDNA-Konzentration <ol><li> Messen cDNA Konzentrationen auf einem Spektrophotometer. Um mit Beschriftungs weiterhin sicherstellen, dass die Konzentration der cDNA mindestens 60 ng / ul (hausgemachte Folien) oder 20 ng / ul (Unternehmen gemachten Folien). </li></ol> 8. Kennzeichnung von cDNA mit aminreaktiven Farbstoff und Reinigung <ol><li> Verwenden aminreaktiven Farbstoffes, um die cDNA zu markieren. Direkt mischen die cDNA mit einem Aliquot (5 ul)Amin-reaktive Farbstoff. </li><li> Inkubieren der Mischung bei RT im Dunkeln für 60 bis 90 min und direkt auf die Reinigung von Farbstoff-markierten cDNA. Reinige farbstoffmarkierte cDNA unter Verwendung von PCR Clean-up-Säulen und nach Herstellerprotokoll. Eluieren cDNA in 50 &amp; mgr; l Elutionspuffer. </li></ol> 9. Messung der markierten cDNA <ol><li> Verwenden eines Spektrophotometers, um den Einbau von aminreaktiven Farbstoffen in das cDNA messen. Überprüfen, dass die Konzentration von Amin-reaktiven Farbstoffe mindestens 0,5 pmol / ul in einem Gesamtvolumen von 50 ul. </li></ol> 10. Mischen von markierten cDNA-Proben <ol><li> Für hausgemachte Folien, verwenden alle markierten cDNA zur Hybridisierung mit nicht mehr als 30% Unterschied in der cDNA-Konzentration. Für Unternehmen gemachten Folien verwenden cDNA mit nicht mehr als 2-fachen Unterschied in der cDNA-Konzentration. Anmerkung: In der Regel werden etwa 300 ng cDNA für Firmen hergestellte Folien benötigt, was im Vergleich zu dem req sehr weniguired Menge an cDNA für hausgemachte Folien. </li></ol> 11. Die Hybridisierung und Waschen <ol><li> Verwenden Sie die folgenden Reagenzien: demi Wasser, Ethanol 99%, schüchtern Buffer (hausgemachte, mit 40 ul Hefe-RNA). Bereiten maximal 1 ml SHY. </li><li> Geräte und Lösungen Zubereitung <ol><li> Schalten Sie Vakuumkonzentratoren und Heizung mindestens 1 Stunde vor dem Trocknen. Schalten Sie Hybridisierungsofen, mit auf den richtigen Hybridisierungstemperatur eingestellten Sollwert (für S. pneumoniae DNA-Microarrays, verwenden 45 ° C). Ebenso vorheizen Hybridisierung Kassette und Ofen für 30-60 Minuten. </li><li> Heizen Sie SHY Puffer bei 68 C für mindestens 30 min. </li></ol></li><li> Probenvorbereitung (markierter cDNA) <ol><li> Kombinieren Sie gleiche Mengen von markierten cDNAs (max 30% Unterschied). Trocknen Sie die Probe mit Hilfe der Vakuum-Konzentratoren bei hoher Temperatur (ca. 40 Min.), Bis das Volumen ist kleiner als 7 &amp; mgr; l. </li></ol></li><li> Lifter-Rutsch- <ol><li> Verwenden Sie saubere Heber rutscht.Anmerkung: ± 30 &amp; mgr; l auf die Objektträger eingelegt werden. </li><li> Reinigen Sie die Heber-Zettel mit Seife, reichlich Leitungswasser und 100% Ethanol. Hinweis: Schmutzige Heber rutscht geben Hoch Hintergrund. </li><li> Lufttrocknen Heber-Zettel mit Luftpistole wegblasen Staubpartikel. Ein sauberes Heber-Rutsch auf der Folie mit dem weißen Teflon-Auskleidung an den Seiten zeigen nach unten. </li></ol></li><li> Hinzufügen Hybridisierungspuffer (zum markierten cDNA) <ol><li> Man löst die getrocknete Farbstoffproben in 7 ul H &amp; sub2; O und Inkubation bei 94 ° C für 2 min. </li><li> Unmittelbar, fügen 35 ul vorerhitzt SHY-Puffer (68 ° C), sanft und Schleuder Mischen bei maximaler Geschwindigkeit für 1 min auf der Ausscheidungen loszuwerden. Heizen Sie die Sonde bei 68 C etwa 5 min bis zum Verladen. </li></ol></li><li> Slide-Lifter-Rutsch-Montage und Vorwärmung. <ol><li> Legen Sie die Hybridisierung Diahalter auf einem Wärmeblock bei 50 ˚C. Zeigen DNA Microarray-Slides mit dem Lifter-Slip auf der beheizten Hybridisierung Diahalter und perwärmen Sie die Folie mit Lifter-Rutsch für eine Minute. Führen Sie die weiteren Schritte so schnell wie möglich. </li><li> Man fügt 40 ul der Probenziel zu dem Ende der Rutsche. Lassen Sie die Flüssigkeit zwischen den Glasflächen durch Kapillarkräfte fließt. Führen Sie alle Pipettieren langsam und vorsichtig. </li><li> Halten Sie die Folien mit Lifter feste horizontale jederzeit und bewegen sich langsam, um sicherzustellen, dass der Heber-Rutsch bewegte sich nicht. </li><li> Nehmen Sie die vorgewärmte Hybridisierungskassette aus dem Hybridisierungsofen und schließen Sie das Gerät. Platz Filterpapier mit 3 ml 2 × SSC (Standard-Kochsalzlösung-Citrat) in der Hybridisierungs Kassette eingeweicht. </li><li> Legen Sie vorsichtig die Hybridisierung Diahalter mit Rutschen in der Hybridisierungs Kassette. Schließen Hybridisierung Kassetten und in der Hybridisierung setzen Ofen erneut (für ca. 16-18 h). </li></ol></li><li> Slide Wasch <ol><li> Bereiten Sie frischen Waschpuffer I, II und III (750 ml pro Waschschritt). Für 500 ml Waschpuffer I, verwenden Sie 2 x SSC / 0,5% SDS. Für 500 ml Wasch Buffäh II, verwenden Sie 1 x SSC / 0,25% SDS. Für 500 ml Waschpuffer III, verwenden Sie 1 x SSC / 0,1% SDS (optional) </li><li> Legen Sie die Waschpuffer bei 30 ° C (um sicherzustellen, dass SDS gelöst ist). </li><li> Tauchen Sie die Folien so schnell wie möglich, aber sehr leicht, in einem Falcon-Röhrchen mit 50 ml gefüllten Waschpuffer I, bis das Glas ruht auf dem konischen Boden des Röhrchens. </li><li> Nach ein paar Sekunden, wenn der Heber-slip sinkt auf den Boden des Röhrchens, nehmen Sie die Folie mit einer Pinzette, ohne zu kratzen das Array und im Rack der Waschstation setzen. Fahren Sie mit dem Waschen ohne Zeitlücke. </li><li> Waschen Sie die Objektträger für 5 min in 500 ml Waschpuffer I (in einer Waschstation). Geben Sie ihm einen zweiten Wasch 20-30 min in 500 ml Waschpuffer II (in einer Waschstation). Ebenso, waschen Sie die Objektträger für 5 min in 500 ml Waschpuffer III (optional) (in einer Waschstation). </li><li> Trocknen der Objektträger für 2 min bei 2.000 Upm. </li></ol></li></ol> 12. Microarray-Analyse <ol><li> Scannen von Bildernmit jeweiligen Wellenlängen in Scanner und speichern Sie in einem Ordner &quot;Jove Project&quot;. </li><li> Verwenden Sie Software, um die gescannten Dateien zunächst analysieren, wie zuvor beschrieben, 22. Nach dem Ausführen der Software, wählen Sie die Registerkarte &quot;Bild öffnen&quot;, um den Rote-Image-Datei (-.550) als &quot;Rot&quot; und grünen Bilddatei (-.635) so laden &quot;Grüne&quot;. Laden Sie die Datei gal (.gal) mit S. pneumoniae Array-Liste auf Image-Datei, indem Sie &quot;Load Array List&quot; Lasche 22. Hinweis: Diese Liste Array bestand aus 48 Gitter, auf jeden Gitter gab es 16 Zeilen und 15 Spalten. Jeder Punkt in der Startaufstellung steht ein einzelnes Gen und Spot Information einschließlich Gen-Name wird durch eine Punktbeschreibungsdatei hinzugefügt. Die Punktzahlen werden von links nach rechts und von oben nach unten gegeben. </li><li> Nach sorgfältiger Auffinden des Grids, wählen Sie das Register &quot;Suchen Array, finden Blocks, Richten Eigenschaften&quot;, um die Spots auszurichten. Nach dem Ausrichten alle Funktionen, analysieren das Bild, indem Sie die &quot;Analyse&quot; tab. Erstellen Sie eine neue Datei mit Ergebnissen, Histogramm und Streudiagramm. Speichern Sie diese Datei aus Reiter &quot;Ergebnisse speichern unter&quot; als .gpr Datei zur weiteren Analyse. </li><li> Führen Sie weitere Normalisierung und Verarbeitung von Daten mit selbst entwickelten Microprep Software-Paket wie beschrieben 9. </li><li> Verwenden unabhängigen biologischen Replikaten für die DNA-Microarray-Daten, die farbstoff vertauscht sind. Führen CyberT Umsetzung einer Variante des t-test1 und berechnen False Discovery Raten (FDR), wie beschrieben, 9. </li><li> Auf differentiell exprimierte Gene, nehmen p &lt;0,001 und FDR &lt;0,05 als Standard. </li><li> DNA-Microarray-Daten Laden Sie am NCBI Einreichung Seite, um ein GEO (Gene Expression Omnibus) Zugangsnummer zu bekommen. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Wir beschreiben eine benutzerfreundliche Protokoll, angewendet werden können, um ganze Transkriptomanalyse von Bakterien durchzuführen. Der entscheidende Punkt dieser besonderen Technik ist, dass die Bedingungen, unter denen die Zellen geerntet variieren. Nach der Ernte der Zellen und RNA-Isolation, wird diese Technik gleich für alle Arten von Bakterienproben und folgt genau identische Schritte, und daher kann auf jede Art von Bakterienkulturen angewendet werden. Das Protokoll ist sehr einfach und bequem und beginnt ...

Die Untersuchung der Gesamtheit der mRNA-Häufigkeit (Transkriptom) von dem Genom eines einzelligen Organismus oder einer eukaryotischen Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt oder unter einer bestimmten Bedingung codiert, einschließlich Gen-Überexpression oder Knock-out wird Transkriptomik bezeichnet. Transcriptomics ermöglicht es uns, in welchem ​​Umfang Gene werden unter einer bestimmten Bedingung zu einem Zeitpunkt X ausgedrückt beobachten und gibt uns Informationen darüber, wie stark die Gene in Bezug auf einen Referenz ausgedrückt. Ein Mikroarray ist ein zweidimensionales Array auf einem festen Substrat (in der Regel ein Glasobjektträger oder Silizium-Dünnschichtzelle), die verwendet werden kann, um große Mengen an biologischem Material Assay unter Verwendung von Hochdurchsatz-Screening, und miniaturisierte, gemultiplext und parallele Verarbeitung und Detektion Methoden. Microarrays sind in verschiedenen Typen, einschließlich DNA-Microarrays, Protein-Microarrays, Peptidchips, Tissue Microarrays, Antikörper-Mikroarrays, Zellmikroarrays und andere. Ein DNA-Microarray istim Grunde eine Anordnung von mikroskopischen DNA-Spots an eine feste Oberfläche, üblicherweise Glas fixiert. DNA-Mikroarrays verwendet, um die Expression von einem Gen oder einer Reihe von Genen gleichzeitig zu messen oder mehrere Regionen eines Genoms 2,3 genotypisieren. Picomol (10 -12 mol) einer Sonde innerhalb der einzelnen DNA Stelle, die eine bestimmte DNA-Sequenz, die auch als Reporter bekannt repräsentiert vorhanden. Die markierten mRNA-Moleküle aus den Proben werden &quot;Ziele&quot; bezeichnet. Fluorophore verwendet werden, um Sonden-Target-Hybridisierung und Detektion von Fluorophor-markierte Targets zur Messung bestimmt die relative Häufigkeit von Nukleinsäuresequenzen in dem Ziel. Ein Mikroarray kann mehrere genetische Tests parallel zu erreichen, weil eine Anordnung kann Zehntausende von Sonden enthalten. Der Aufbau eines einfachen Mikroarray wird in Abbildung 1 gezeigt. Kürzlich konnte in unseren Laboren und anderen festgestellt, daß sich diese Anordnungen sind wiederverwendbar, die diese Technik sehr kostengünstig macht Wirksame. 8 - verschiedene RNA-Isolierung und Reinigungsverfahren sind im Laufe der Jahre, einschließlich C-TAB, SDS und GT Methoden 4 entwickelt. Darüber hinaus sind auch mehrere kommerzielle Kits zur Verfügung. Für Genexpression qualitativ hochwertige RNA ist sehr wichtig. Daher werden die RNA-Isolationsverfahren modifiziert, um eine maximale Menge an RNA zu erhalten. In ähnlicher Weise werden die Schritte für die cDNA Herstellung und Kennzeichnung von cDNA minimiert. Die Normalisierung der Daten nach dem Scanvorgang wird auch effizient durch die Verwendung in-Haus gebaut Softwarepakete und Tools 9 durchgeführt. Streptococcus pneumoniae ist ein Gram-positiven menschlichen Erreger der Nasenrachenraum besiedelt und ist die Ursache für mehrere Infektionen wie Lungenentzündung, Sepsis, Mittelohrentzündung und Meningitis 10. Das Bakterium kann eine Vielzahl der für das Wachstum und Überleben 11,12 erforderlichen Nährstoffe zu nutzen. Eine Reihe von Untersuchungen wurden an das mitgeführtePneumokokken-Stickstoff-Stoffwechsel und Regulation die Bedeutung der Aminosäuren und ihre Rolle in der Virulenz 13,14. In dieser Studie wurde die transkriptomischen Antwort S. pneumoniae an wechselnde Konzentrationen von L-Serin, einem Aminosäure reichlich im menschlichen Blutplasma vorhanden ist, wird berichtet, unter Verwendung von DNA-Mikroarrays. Das Transkriptom Antwort von S. pneumoniae in einer minimalen Konzentration von L-Serin (150 um) aufgewachsen wurde, daß sich eine maximale Konzentration (10 mM) von Serin gewachsen verglichen. Chemisch definierten Medium (CDM oder Minimalmedium) 15 wurde für diese Untersuchung verwendet, um die Konzentration von Serin zu steuern. Der Schwerpunkt dieser Studie ist es, diese Technik benutzerfreundlich zu machen und verschiedene Werkzeuge für die Datennormalisierung und Analysen. Daher wurden eine Reihe von Werkzeugen für die Analyse und die Interpretation der Daten entwickelt. FIVA (Functional Information Viewer und Analyzer) bietet eine Plattform für die Verarbeitung von Informationen in Gruppen von Genen enthalten habenähnliches Genexpressionsmuster und zum Konstruieren Funktionsprofile 16. STAATSANWALT ist ein weiteres Softwarepaket, das die Identifizierung der mutmaßlichen Funktionen und Annotationen der Gene 17 erleichtert. Durch die Verwendung von Clusterverfahren, offenbaren eine DNA-Bindungsstelle-Erkennungsalgorithmus. Cis: Rechts Motive der Gene kann durch Verwendung dieses Algorithmus 18 projiziert werden. Genome2D bietet eine Windows-basierte Plattform für die Visualisierung und Analyse von Transkriptom-Daten, indem sie verschiedene Farbpaletten, um die Veränderungen in der Genexpression Ebenen auf einem Genomkarte 19 zu charakterisieren. Der Pfeffer Webserver bietet, zusätzlich zu den all-in-one-Analyseverfahren, einem Werkzeugkasten für den Bergbau für Regulons, Promotoren und Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen 20. Voll Annotation von intergenischen Regionen in einem bakteriellen Genom kann mit diesem Paket erzielt werden. Biologen können stark von Pfeffer profitieren, da sie bietet ihnen eine Plattform für die Entwicklung Experiments, so dass der hypothetische Informationen können in vitro 20 bestätigt werden. Diese Softwarepakete tragen wesentlich zur Microarray-Analyse, wie die meisten von ihnen sind frei verfügbar und machen die Datennormalisierung und Analyse sehr zuverlässig.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid phenol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P4682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche RNA isolation kit</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>11828665001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td></td>
			<td>105015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Boom</td>
			<td>92013505.1000.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAA</td>
			<td></td>
			<td>106630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ND-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent BioAnalyser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2940CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AA-dUTP</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>AM8439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDT</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First Strand buffer</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>S8045-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight-550</td>
			<td>Thermoscientiffic</td>
			<td>62262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight-650</td>
			<td>Thermoscientiffic</td>
			<td>62265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHY Buffer</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>H7033-125ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speedvac cooler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>RUGNE3140</td>
			<td>Speedvac concentrator plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Grant Boekel</td>
			<td>Iso-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifter-slips</td>
			<td>Erie Scientific</td>
			<td>25x60I-M-5439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wipe</td>
			<td>KIMTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>L3771-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>W302600-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genpix autoloader 4200A1</td>
			<td>MSD analytical technologies</td>
			<td></td>
			<td>Microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>104766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fast and reliable pipeline for bacterial transcriptome analysis case study: serine-dependent gene regulation in streptococcus pneumoniae

Genexpression und ihre Regulation sind sehr wichtig, um das Verhalten von Zellen unter verschiedenen Bedingungen zu verstehen. Verschiedene Techniken werden heute verwendet werden, um Genexpression zu untersuchen, aber die meisten sind in Bezug auf die Bereitstellung einen allgemeinen Überblick über die Expression des gesamten Transkriptoms begrenzt. DNA-Microarrays bieten eine schnelle und Wirtschaftsforschung-Technologie, die einen vollständigen Überblick über globale Genexpression gibt und haben eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Identifizierung neuer Gene und Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen, Charakterisierung der Transkriptionsaktivität der Zellen und auch dazu beitragen, bei der Analyse von tausenden von Genen (in einem einzigen Experiment). In der vorliegenden Studie, die Bedingungen für bakterielle Transkriptomanalyse von Zellernte auf DNA-Microarray-Analyse optimiert. Unter Berücksichtigung der Zeit, Kosten und Genauigkeit der Experimente, erweist sich diese Technologie-Plattform als sehr nützlich und universell applicabale zur Untersuchung bakterieller transcriptomes. Hier führen wir DNA-Microarray-Analyse mit Streptococcus pneumoniae als Fallstudie durch Vergleich der Transkriptionsreaktionen S. pneumoniae in Gegenwart von variierenden Konzentrationen von L-Serin in dem Medium gezüchtet. Gesamt-RNA wurde unter Verwendung eines Macaloid Verfahren unter Verwendung eines RNA-Extraktions-Kit und die Qualität der RNA isoliert wurde unter Verwendung eines RNA-Qualitätskontrollsatz geprüft. cDNA wurde unter Verwendung von reverser Transkriptase hergestellt, und die cDNA-Proben wurden unter Verwendung eines von zwei Amin-reaktive Farbstoff trägt. Selbst gemachte DNA Microarray-Slides wurden für die Hybridisierung der markierten cDNA-Proben und Mikroarray-Daten verwendet wurden unter Verwendung eines cDNA-Mikro Datenvorverarbeitung Rahmen (Microprep) analysiert. Schließlich Cyber-T verwendet wurde, um die erzeugten Verwendung Microprep zur Identifizierung statistisch signifikant unterschiedlich exprimierten Genen Daten zu analysieren. Außerdem im Haus eingebaute Software-Pakete (Pfeffer, FIVA, offenbaren, Staatsanwalt, Genome2D) wurden verwendet, um zu analysierenDaten.

RNA, cDNA-Isolationen und Analyse L-Serin ist eine der essentiellen Aminosäuren, und seine Konzentration im menschlichen Blutplasma variiert von 60 bis 150 &amp; mgr; M bei Kindern und Erwachsenen. Seine Rolle bei der Biosynthese von Purinen und Pyrimidinen hebt seine Bedeutung im Stoffwechsel und es ist ein Vorläufer von verschiedenen Aminosäuren (Glycin, Cystein und Tryptophan). Um die Wirkung von L-Serin auf die gesamte Transkriptom S. studieren pneumoniae...

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A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.

Eine schnelle und zuverlässige Pipeline für bakterielle Transkriptomanalyse Fallstudie: Serin-abhängige Genregulation in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Gene expression and its regulation are very important to understand the behavior of cells under different conditions. Various techniques are used nowadays ...

a-fast-reliable-pipeline-for-bacterial-transcriptome-analysis-case

Research

JoVE Journal

Biology

A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

10.3K Aufrufe.  University of Groningen. This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages. 

Serie: A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakterielle Gene Expression Analysis Using Microarrays

Forschung

Biologie

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em&gt; In-vitro-</em&gt; Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genomweiten Gen-Deletionen in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Von High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA Screening zu Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen System Regler der biologischen Stoffwechselwege in kultivierten Säugerzellen identifizieren

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Genetische und biochemische Ansätze für<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; In Vitro</em&gt; Beurteilung von Protein Oligomerisierung: Der Ryanodinrezeptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus on one or more gene families that are significant to the organism and study. In this protocol, we outline bioinformatic steps to generate a phylogeny and to quantify the expression of genes of interest. Phylogenetic trees can give insight into how genes are evolving within and between species as well as reveal orthology. These results can be enhanced using RNA-seq data to compare the expression of these genes in different individuals or tissues. Studies of molecular evolution and expression can reveal modes of evolution and conservation of gene function between species. The characterization of a gene family can serve as a springboard for future studies and can highlight an important gene family in a new genome or transcriptome paper.

The purpose of this protocol is to investigate the evolution and expression of candidate genes using RNA sequencing data.

Eine Bioinformatik-Pipeline zur Untersuchung der molekularen Evolution und Genexpression mit RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...