우리는 DNA 마이크로 어레이 슬라이드 생산에 대한 도움말 앤 드 종과 Siger Holsappel 감사합니다. 생물 정보학 분석을위한 앤 드 종의 지원도 받고있다. 우리는 또한 종이를 검토 할 Jelle Slager 감사합니다. 무하마드 아프과 이르판 Manzoor는 HEC 파키스탄의 교수 개발 프로그램에 따라 GC 대학, 파이 살라 바드, 파키스탄에서 지원됩니다.

1. 미디어의 준비 및 세포 배양 <ol><li> S. 성장 앞서 설명한 바와 같이 11 폐렴 D39 야생형 균주 21. 화학적 6.4 (15)의 최종 pH 중형 (CDM)가 정의 50 ㎖ 중의 (50 ㎖에 1/100의 비율 멸균 튜브) 10 % 글리세롤에 C o를 -80 저장된 세포에 접종하지만 아미노산으로부터 L 세린 생략 혼합물. 주 : 두 개의 다른 CDMS 사용 하였다; L 세린 (10 mM)을 최대 농도를 함유하는 세린 L (150 μM) 및 기타의 최소 농도를 함유 한. 이러한 최소 농도는 기본적으로 인간 혈장 세린 L의 농도이며 목적은 S.의 유전자 발현을 비교하는 것이다 이 두 가지 조건에서 폐렴 D39 변형. </li></ol> 총 RNA 2. 분리 <ol><li> 재료 <ol><li> 총 RNA의 분리를 위해 산 페놀, RNA 등급을 사용합니다. </li><li> Macaloid : <ol><li> 의 2g을 일시 중단100 ml의 TE에 macaloid 5 분 동안 끓인다. 50 ml의 TE pH가 8 점에서 4 ° C에서의 RT에서 5 분, 재현 탁 2,000 × g에서 솔루션 macaloid gels.Centrifuge까지 RT와 초음파 처리에 차가운. </li></ol></li><li> 솔루션 : <ol><li> 디 에틸 피로 카보네이트 (DEPC) 모든 솔루션을 취급합니다. 15 분 동안 37 ° C에서 O / N을 배양하고 오토 클레이브, 100 μL의 DEPC / 100 ml의 솔루션을 추가합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 방법론 <ol><li> S. 50 ml의 성장 중간 지수 단계 (OD ~ 0.3)까지 37 O C (아무 흔들림)에 50 ㎖ 튜브에 폐렴 D39 세포 배양. 2 분 동안 10,000 × g에서 4 ° C에서 원심 분리기 문화. 미디어를 취소하고 즉시 액체 질소에서 세포 펠렛을 동결. </li><li> 프레 믹스 300 μL의 클로로포름 : IAA (24 : 1) 300 μL 페놀 (페놀 산, RNA 학년). 단계 2.2.3 유기상 500 μl를 사용한다. </li><li> RNA가없는 스크류 캡 튜브에 사전에 다음과 같은 혼합물을 준비 : 00.5 g 유리 비드 50 ㎕의 10 % SDS, 500 μL의 페놀 / 클로로포름 : IAA (단계 2.2.2에서 제조 한 바와 같이), macaloid 층 (150-175 μL, 매우 점성없는 정확한 같이). 400 ㎕의 TE (DEPC)에있는 세포 펠렛을 재현 탁하고 나사 캡 튜브에 재현 탁 세포를 추가합니다. </li><li> 세포를 파괴하기 위해 얼음에 1 분 간격으로 2 배 60 &quot;펄스에 대한 비드 비터 ( &#39;균질화&#39;)에 나사 캡 튜브를 배치합니다. 원심 분리기 10,000 ×의 g (4 ° C에서)에서 10 분 동안 샘플. </li><li> 신선한 튜브에 상위 단계로 이동 500 μl의 클로로포름 추가 IAA (24 : 1) 원심 분리기 5 분 동안 10,000 ×의 g (4 ° C)에서. </li><li> 용해 / 바인딩 버퍼의 두 볼륨 (1 ml)에 추가, 신선한 튜브 상위 단계의 500 μl를 전송하고로 pipetting 아래로 섞는다. RNA 분리 키트를 사용하여 총 RNA를 분리하고, 제조업체에게 권장 프로토콜을 따릅니다. </li></ol></li></ol> 3. R​​NA 정리 &lt;<html> OL&gt; <li> 총 RNA에서 DNA의 오염을 제거 100 μL DNAseI 믹스 (90 μL의 DNase의 버퍼와 10μl의 DNAseI)를 추가하고 15 ~ 25 ºC에서 20 ~ 30 분 동안 품어합니다. </li><li> 워시의 RNAse 키트를 사용하여 RNA를 청소. 용출 볼륨의 50 μl를 얻습니다. </li></ol> RNA 4. 분석 <ol><li> 분광 광도계에 RNA의 농도를 결정합니다. (도 2)는 다음과 같이 분석을 이용하여 RNA의 품질을 결정한다. <ol><li> 20-200 NG / μL의 농도를 얻을 DEPC 물 50㎕의 샘플을 1 μL 희석. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 Bioanalyser에 품질을 확인하기 위해 1 μL 희석 RNA 샘플을 사용합니다. </li></ol></li><li> 참고 : 23S의 비율 : 약 2.0 16S가 좋은 것으로 간주됩니다 한 A260 단위 RNA가 40 ㎍ / ㎖의에 해당한다.. 라벨에 대한 권장 금액은 10 ~ 20 μg의입니다. </li></ol> 5. cDNA를 준비하고 레테르를 붙이기 ntent &quot;&gt; 참고 : 다음 프로토콜이 cDNA를 제조 및 라벨링에 대한 하였다. <ol><li> 가열 냉각 <ol><li> 만든 슬라이드 또는 회사에서 만든 슬라이드 5㎍을 위해 총 RNA 10 ~ 15 μg의 농도를 유지, 300 ㎕를 PCR 튜브에 어닐링 반응을 수행합니다. 2 μL 임의 nonamers (1.6 ㎍ / μL)와 RNA를 혼합하고 18 μL에 어닐링 혼합물의 최종 부피를 유지하기 위해 필요한 경우 핵산 분해 효소가없는 물을 추가합니다. </li><li> 5 분 동안 70 ℃에서 어닐링 유지 혼합물. 그 후, 10 분 (어닐링)에 대한 RT 혼합물을 냉각하고, 필요한 경우, 관의 바닥에 반응을 스핀 다운. 적어도 1 분 동안 얼음에 반응 튜브를 놓습니다. </li></ol></li><li> 역전사 <ol><li> t, 18 ㎕의 어닐링 믹스 μL 역 6 μl의 5 배 먼저 스트랜드 버퍼로 구성된 12 μL 마스터 믹스 (3 μL 0.1 M DDT, 1.2 ㎕의 25 배 AA-dUTP를 / 염기 믹스와 1.8를 추가 : 다음과 같이 역전사 효소 믹스를 준비ranscriptase (회사 만든 슬라이드 1 μL). 42 ° C에서 2-16 시간 동안 반응 믹스를 유지합니다. </li></ol></li></ol> 6. mRNA를 분해 및 cDNA를 정화 <ol><li> , 반응 혼합물로부터의 mRNA를 분해 약 15 분 동안 37 ° C에서 3 2.5 M의 NaOH μL과 장소를 추가합니다. 2M는 NaOH를 중화 유리 산을 HEPES의 후, 15 μl를 추가합니다. </li><li> PCR 정화 컬럼을 사용하여 cDNA의 혼합물을 정제하고 제조자의 프로토콜을 따른다. </li></ol> cDNA의 농도 측정 7. <ol><li> 분광 광도계에 cDNA의 농도를 측정한다. 라벨 계속하려면, cDNA를의 농도가 적어도 60 NG / μL (만든 슬라이드) 또는 20 NG / μL (회사 만든 슬라이드)되어 있는지 확인합니다. </li></ol> 아민 반응성 염료 및 정제와의 cDNA 8. 표지 <ol><li> cDNA의 레이블을 아민 반응성 염료를 사용합니다. 직접 하나 나누어지는 (5 μL)의로 cDNA를 혼합아민 반응성 염료를. </li><li> 60 ~ 90 분 동안 어두운 데에서, RT에서 혼합물을 부화 염료 표지 된 cDNA를 정제로 직접 진행. PCR 청소 열을 사용하여 제조 업체의 프로토콜에 따라 염료로 표지 된 cDNA를 정화. 용출 완충제에서 50 μL의 cDNA 용출. </li></ol> 표지 된 cDNA를 9. 측정 <ol><li> cDNA의 아민에 반응성 염료의 혼입을 측정하는 분광 광도계를 사용한다. 아민 반응성 염료의 농도가 50 μL의 총 부피에 적어도 0.5 pmol의 / μL가 있는지 확인합니다. </li></ol> 표지 된 cDNA를 샘플의 10 혼합 <ol><li> 만든 슬라이드를 들어, cDNA의 농도하게는 30 % 이상 차이가 하이브리드에 대한 모든 레이블의 cDNA를 사용합니다. 회사 만든 슬라이드를 들어, cDNA의 농도의 2 배 차이 이하로 cDNA를 사용합니다. 주 : 일반적으로, 유전자의 cDNA는 약 300 ng의 회사에서 만든 슬라이드 위해서 필요한 것이 REQ에 비해 약간 이는만든 슬라이드를위한 cDNA의 양을 uired. </li></ol> 11. 하이브리드 및 세척 <ol><li> (40 μL 효모 RNA와 수 제) 반은 물, 에탄올 99 %, SHY 버퍼 : 다음과 같은 시약을 사용합니다. SHY 최대 1 ml의를 준비합니다. </li><li> 장치 및 솔루션 준비 <ol><li> 건조하기 전에 진공 농축기와 히터 적어도 1 시간에 전환합니다. (45 ° C를 사용하여, S. 폐렴 DNA 마이크로 어레이에 대한) 정확한 하이브리드 온도로 조정 세트 포인트, 하이브리드 오븐에 전환합니다. 마찬가지로, 30 ~ 60 분 동안 하이브리드 카세트와 오븐을 예열. </li><li> 적어도 30 분 동안 68 ℃에서 SHY 버퍼를 예열한다. </li></ol></li><li> 샘플 준비 (의 cDNA를 표시) <ol><li> 표지 된 cDNA를 (최대 30 % 차이)의 동량을 결합합니다. 볼륨이보다 작은 7 μL 때까지 고온 (약. 40 분)에서 진공 농축기를 사용하여 샘​​플을 건조시킵니다. </li></ol></li><li> 리프터 미끄럼 <ol><li> 깨끗한 리프터 - 전표를 사용합니다.참고 : 30 μL 슬라이드에로드 할 수 있습니다 ±. </li><li> 비누, 수돗물 100 % 에탄올을 많이 리프터 - 전표를 청소합니다. 참고 : 더러운 리프터 전표가 높은 배경을 제공합니다. </li><li> 공기는 먼지 입자를 날려 공기 권총 리프터 - 전표를 건조. 측면에서 흰색 테프론 라이닝이 아래로 향하게하여 슬라이드에 깨끗한 리프터 슬립을 놓습니다. </li></ol></li><li> (표지 된 cDNA으로) 하이브리드 화 버퍼를 추가 <ol><li> 7 μL의 H 2 O에있는 말린 염료 샘플을 용해 2 분 동안 94 ℃에서 배양한다. </li><li> 즉시, 35 μL 예열 SHY 버퍼 (68 ° C)를 추가 침전물을 제거하는 1 분 동안 최대 속도로 부드럽게 회전 섞는다. 로딩 될 때까지 약 5 분 동안 68 ℃에서 프로브를 예열. </li></ol></li><li> 슬라이드 - 리프터 슬립 조립 및 예열. <ol><li> 50 ℃에서 열 블록에 하이브리드 슬라이드 홀더를 배치합니다. 가열 된 하이브리드 슬라이드 홀더 및 P에 리프터 미끄럼 방지와 DNA 마이크로 어레이 (microarray) 슬라이드를 배치분 리프터 - 슬립과 슬라이드를 재가열. 가능한 한 빨리 다음 단계를 수행합니다. </li><li> 슬라이드의 단부에 대상 시료 40 μL를 추가한다. 유체는 모세관 력에 의해 유리 표면 사이 흐르게. 천천히 조심스럽게 모든 피펫 팅을 수행합니다. </li><li> 항상 리프터 슬립 수평으로 슬라이드를 유지하고 리프터 미끄럼 이동하지 않았다는 것을 확인하기 위해 천천히 이동합니다. </li><li> 하이브리드 오븐에서 미리 예열 하이브리드 카세트를 가지고 시스템을 닫습니다. 장소 필터 종이는 하이브리드 카세트에서 3 ml의 2 배 SSC (표준 식염수 구연산)로 적셔. </li><li> 조심스럽게 하이브리드 카세트에서 슬라이드와 하이브리드 슬라이드 홀더를 배치합니다. 하이브리드 카세트를 닫고 (약 16 ~ 18 시간 동안) 오븐 다시 하이브리드에 넣어. </li></ol></li><li> 슬라이드 세척 <ol><li> I, II 및 III 신선한 세척 - 버퍼 (세척 단계 750 ml)에 준비합니다. (500)는 I를 버퍼를 씻어 ML를 들어, 2 × SSC / 0.5 % SDS를 사용합니다. 500 워시 - 버프를 ㎖로어 II는 1 × SSC / 0.25 % SDS를 사용합니다. 500 ml를 들어 세척 버퍼 III를 사용하는 1 × SSC / 0.1 % SDS (선택 사항) </li><li> 30 ° C에서 세척 - 버퍼를 놓고 (확인하기 위해 SDS는 용해). </li><li> 유리 튜브의 원뿔 바닥에 닿을 때까지 50 ㎖로 채워진 팔콘 튜브에 매우 부드럽게 가능한 한 빨리 슬라이드 잠수함,하지만 난 버퍼를 씻는다. </li><li> 상기 튜브의 하단에 미끄럼 리프터 싱크가 배열 긁힘없이 핀셋 슬라이드를 꺼내 세정제의 선반에 넣고 몇 초 후. 짧은 시간 간격으로 세척를 계속합니다. </li><li> 세척 버퍼를 ㎖로 I (세척 역에서) 500에서 5 분 동안 슬라이드를 씻으십시오. 세척 버퍼 ㎖로 500에 20 ~ 30 분 (세척 역) II를 위해 두 번째 씻어주세요. 마찬가지로, 세척 버퍼 ㎖로 500에 5 분 동안 슬라이드를 씻어 III (선택 사항) (세척 역). </li><li> 2,000 rpm에서 2 분 동안 슬라이드를 건조시킵니다. </li></ol></li></ol> 12. 마이크로 어레이 분석 <ol><li> 이미지를 스캔와 스캐너에서 각각의 파장의 폴더 &quot;주피터 프로젝트&quot;에 저장합니다. </li><li> 이 소프트웨어를 실행 한 후 이전에 22 설명 된 바와 같이 처음에 스캔 된 파일을 분석하는 소프트웨어를 사용하여, &quot;레드&quot;와 녹색 이미지 파일 (-.635)로 빨간색 이미지 파일 (-.550)을로드하려면 &quot;이미지 열기&quot;탭을 선택 &quot;녹색&quot;. 탭 (22)을 &quot;로드 배열 목록&quot;을 선택하여 이미지 파일에 S. pneumoniae에 배열 목록을 갖는 걸 파일 (.gal)를 업로드합니다. 참고 :이 배열 목록, 48 그리드로 구성되어 각 격자에 16 행 15 열의가 있었다. 그리드의 각 지점은 하나의 유전자를 나타내는 유전자 이름을 포함하여 장소 정보는 현장 설명 파일을 통해 추가됩니다. 지점 번호는 왼쪽에서 오른쪽으로, 위에서 아래로부터 제공됩니다. </li><li> 조심스럽게 그리드를 선택 탭에 얼룩을지게 한 후 지점을 정렬 &quot;기능을 정렬 블록을 찾아, 배열 찾기&quot;. 모든 기능을 정렬 한 후, &quot;분석&quot;t를 선택하여 이미지를 분석AB. 결과, 히스토그램과 산포도를 갖는 새로운 파일을 만듭니다. &quot;다른 이름으로 저장 결과&quot;탭에서이 파일을 저장 추가 분석을 위해 .gpr 파일로 저장됩니다. </li><li> 9 바와 같이 자체 개발 Microprep 소프트웨어 패키지와 상기 정규화 데이터의 처리를 수행한다. </li><li> 염료 스왑 DNA 마이크로 어레이 데이터에 대한 독립적 인 생물학적 반복 실험을 사용합니다. 같은 t-TEST1의 변형의 CyberT 구현을 수행하고 계산 거짓 발견 비율 (FDRs)는 9 설명했다. </li><li> 발현 된 유전자, 표준 p &lt;0.001 FDR &lt;0.05를 취할. </li><li> GEO (유전자 발현 옴니버스) 가입 번호를 얻기 위해 NCBI 제출 페이지에 DNA 마이크로 어레이 데이터를 업로드합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 금융 이익이 없다는 것을 선언합니다.

우리는 세균의 전체 전 사체 분석을 수행하도록 적용될 수있는 사용자 친화적 인 프로토콜을 설명한다. 이러한 특정 기법에 대한 핵심은 세포가 수확되는 조건에 따라 달라질 것이다. 세포 RN​​A 분리 및 수확 후,이 기술은 박테리아 샘플 모든 유형과 정확히 동일하게 동일한 절차를 따르며, 따라서 세균 배양의 모든 유형에 적용 할 수있다. 이 프로토콜은 매우 간단하고 편리하고 RNA 분리에서 ?...

유전자 과발현 또는 녹 - 아웃을 포함하여, 특정 시간 또는 특정 조건 하에서 단세포 생물 또는 진핵 세포의 게놈에 의해 코딩 mRNA의 풍부 (사체)의 전체 세트의 연구는 transcriptomics 불린다. Transcriptomics 우리가 어느 정도 유전자 시점 X에서 특정 조건에서 발현되는 무엇을 관찰 할 수 있습니다 우리에게 유전자에 대한 참조를 기준으로 표시하는 방법을 강하게에 대한 정보를 제공합니다. 마이크로 어레이는 고체 기판 상에 2 차원 어레이 (일반적으로 유리 슬라이드 또는 실리콘 박막 셀) 높은 처리량 스크리닝을 사용하여 생체 물질의 대량 분석하는 데 사용하고, 소형화 될 수 있고, 다중화 및 병렬 프로세싱 및 검출이며 방법. 마이크로 어레이는 DNA-마이크로 어레이, 단백질 마이크로 어레이, 펩티드 마이크로 어레이, 조직 마이크로 어레이, 항체 마이크로 어레이, 세포 마이크로 어레이 등을 비롯한 다양한 형태로 왔습니다. DNA 마이크로 어레이는기본적 미세한 DNA 스폿의 조립체는 고체 표면에 고정 된 보통 유리. DNA 마이크로 어레이는 유전자의 발현 수준 또는 유전자의 동시 측정하는 세트 또는 게놈 2,3- 복수의 영역의 유전자형을 위해 사용된다. 프로브 Picomoles (10-12 몰) 또한 리포터로 알려진 특정 DNA 서열을 나타내며, 각각의 DNA 스폿 내에 존재한다. 샘플에서 라벨의 mRNA 분자는 &#39;목표&#39;라고합니다. 형광 프로브는 표적과 혼성화 형광 표지 된 표적의 검출을 측정하는 데 사용되는 것은 타겟 핵산 서열의 상대적인 풍부함을 결정한다. 배열 수십 프로브의 수천을 포함 할 수 있기 때문에 마이크로 어레이 실험은 병렬로 여러 유전자 검사를 수행 할 수 있습니다. 간단한 마이크로 어레이 실험의 배치는 그림 1에 나타나있다. 최근에는 이러한 배열은이 기술을 매우 비용 effectiv을 만드는, 재사용하는 것이 우리와 다른 실험실에서 설립되었다전자. 8 - 다른 RNA의 분리 및 정제 기술은 C-TAB, SDS와 GT 방법 4를 포함하여 수년에 걸쳐 개발되고있다. 또한, 여러 상업 키트도 사용할 수 있습니다. 유전자 발현을위한 고품질의 RNA는 매우 중요합니다. 따라서, RNA 분리 방법은 RNA의 최대 양을 얻기 위해 수정됩니다. 마찬가지로, cDNA를 cDNA를 준비 및 라벨링에 대한 단계는 최소화된다. 스캔 한 후 데이터의 정규화는 또한 자체 내장 된 소프트웨어 패키지 및 도구 (9)를 사용하여 효율적으로 수행된다. 폐렴 구균은 비 인두를 식민지화과 폐렴, 패혈증, 중이염 등의 여러 감염의 원인 10 뇌막염 그람 양성 인간 병원체이다. 박테리아의 성장과 생존에 필요한 11,12 영양소 다양한 이용할 수있다. 연구 번호에 대해 수행 된아미노산의 중요성 및 병독성 13,14에서의 역할을 강조 폐렴 질소 대사 조절. 본 연구에서는 미국의 transcriptomic 응답 폐렴 L 세린, 인간 혈장에 존재하는 다량의 아미노산의 농도 변화에 DNA 마이크로 어레이를 사용하여보고된다. S.의 transcriptomic 응답 세린 L (150 μM)의 농도를 최소 성장 폐렴은 세린의 최대 농도 (10 mM)을 성장에 비해 하였다. 화학적으로 정의 된 배지 (CDM 또는 최소 배지) 15 세린의 농도를 제어하기 위해이 연구를 위해 사용되었다. 본 연구의 초점이 기술은 사용자 친화적 있도록 정상화 데이터 및 분석을위한 다른 도구를 제공하는 것이다. 따라서, 공구의 수는 분석 데이터 해석을 위해 개발되었다. FIVA (기능 정보 뷰어 및 분석기)을 갖는 유전자의 클러스터에 포함 된 정보 처리를위한 플랫폼을 제공합니다유사한 유전자 발현 패턴 및 기능 정보 (16)를 구성하기위한. 검사는 추정되는 기능 및 유전자 주석 (17)의 식별을 용이하게 다른 소프트웨어 패키지이다. 클러스터링 방법을 이용하여 공개는 DNA 결합 부위 검출 알고리즘을 제공한다. 유전자의 시스 - 규정 모티프이 알고리즘 (18)을 통해 투영 될 수있다. Genome2D는 게놈 맵 (19) 상에 유전자 발현 수준의 변화를 특성화하기 위해 상이한 컬러 범위를 제공함으로써 시각화 및 사체 데이터의 분석을위한 윈도우 기반 플랫폼을 제공한다. 고추 웹 서버는 모든 -에 - 하나의 분석 방법, regulons, 프로모터 및 전사 인자 결합 부위 (20)에 대한 마이닝 도구 상자에 추가로 제공합니다. 박테리아 게놈 유전자 간 영역의 전체 주석이 패키지를 사용함으로써 달성 될 수있다. 이 실험을 설계하는 그들에게 플랫폼을 제공으로 생물 학자들은 크게 고추 혜택을 누릴 수 있습니다(S)이되도록 가정 된 생체 정보 (20)에서 확인할 수있다. 대부분이 무료로 사용할 수 있습니다 및 데이터 표준화 및 분석은 매우 신뢰성있는 이러한 소프트웨어 패키지는 마이크로 어레이 분석에 크게 기여하고 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Acid phenol</td><td>SigmaAldrich</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>Roche RNA isolation kit</td><td>Roche Applied Science</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Glass beads</td><td></td><td>105015</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Boom</td><td>92013505.1000.</td><td></td></tr><tr><td>IAA</td><td></td><td>106630</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Nanodrop</td><td>ND-100</td><td></td></tr><tr><td>Agilent BioAnalyser</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III</td><td>Life technologies Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>AA-dUTP</td><td>Life technologies Invitrogen</td><td>AM8439</td><td></td></tr><tr><td>DDT</td><td>Life technologies Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>First Strand buffer</td><td>Life technologies Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SigmaAldrich</td><td>S8045-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SigmaAldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>DyLight-550</td><td>Thermoscientiffic</td><td>62262</td><td></td></tr><tr><td>DyLight-650</td><td>Thermoscientiffic</td><td>62265</td><td></td></tr><tr><td>SHY Buffer</td><td>SigmaAldrich</td><td>H7033-125ML</td><td></td></tr><tr><td>Speedvac cooler</td><td>Eppendorf</td><td>RUGNE3140</td><td>Speedvac concentrator plus</td></tr><tr><td>Hybridization oven</td><td>Grant Boekel</td><td>Iso-20</td><td></td></tr><tr><td>Lifter-slips</td><td>Erie Scientific</td><td>25x60I-M-5439</td><td></td></tr><tr><td>Wipe</td><td>KIMTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>SigmaAldrich</td><td>L3771-100g</td><td></td></tr><tr><td>SSC</td><td>SigmaAldrich</td><td>W302600-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>Genpix autoloader 4200A1</td><td>MSD analytical technologies</td><td></td><td>Microarray scanner</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>SigmaAldrich</td><td>104766</td><td></td></tr></tbody></table>

a fast and reliable pipeline for bacterial transcriptome analysis case study: serine-dependent gene regulation in streptococcus pneumoniae

유전자 발현 및 조절은 반응 조건이 다른 셀들의 동작을 이해하는 것이 매우 중요하다. 다양한 기술이 유전자 발현을 연구하기 위해 현재 사용되지만, 대부분의 전 사체의 발현을 제공하는 전체 화상의 관점에서 제한된다. DNA 마이크로 어레이는 전체 유전자 발현의 전체 개요를 제공 빠르고 경제적 연구 기술을 제공하고 수천을 분석하는데 도움도 사이트, 세포의 전사 활성의 특성화 및 바인딩 신규 유전자 전사 인자의 확인을 포함하여 광범위한 응용 번호를 가지고 유전자 (하나의 실험에서). 본 연구에서, DNA 마이크로 어레이 분석 세포 수확에서 세균 전 사체 분석을위한 조건이 최적화되어있다. 계정으로 시간, 비용과 실험의 정확성을 촬영,이 기술 플랫폼은 세균 transcripto 연구를위한 매우 유용하고 보편적 applicabale 것으로 입증MES. 여기서 우리는 S.의 전사 반응을 비교하여 대소 연구 등의 폐렴 구균과 DNA 마이크로 어레이 분석을 수행 폐렴 L 배지에 세린의 다양한 농도의 존재 하에서 성장. 총 RNA는 RNA의 품질 검사 키트를 사용하여 조사 하였다 RNA 분리 키트 및 RNA의 품질을 사용하여 Macaloid 방법을 사용하여 단리 하였다. cDNA를 역전사 효소를 사용하여 제조하고, cDNA를 시료는 두 아민 반응성 형광 염료 중 하나를 사용하여 라벨링 하였다. 제 DNA 마이크로 어레이 슬라이드의 cDNA 마이크로 어레이 데이터 전처리 워크 (Microprep)를 사용하여 분석 하였다 표지 된 cDNA 샘플 및 마이크로 어레이 데이터의 혼성화에 사용 하였다. 마지막으로 사이버 T는 통계적으로 유의 한 발현 된 유전자의 식별 Microprep을 이용하여 생성 된 데이터를 분석하는데 사용 하였다. 또한, 자체 내장 된 소프트웨어 패키지 (고추, FIVA는 공개, 검사, Genome2D)를 분석하는 데 사용되었다데이터.

RNA, cDNA를 절연 부 및 분석 L 세린은 필수 아미노산의 하나이며, 인간의 혈장 농도는 아동 및 성인에서 60-150 μM 다르다. 퓨린과 피리 미딘의 생합성의 역할은 신진 대사의 중요성을 강조하고 여러 아미노산 (글리신, 시스테인 및 트립토판)의 전조이다. S. 전체 사체에 L 세린의 영향을 연구 폐렴 D39 야생형 균주, 동일한 배지에서 최대 농도 (10 mM)을 그 ?...

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A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.

세균의 사체 분석 사례 연구에 대한 빠르고 안정적​​인 파이프 라인 : 세린에 의존하는 유전자 조절에<em&gt; 폐렴 구균</em

Gene expression and its regulation are very important to understand the behavior of cells under different conditions. Various techniques are used nowadays ...

a-fast-reliable-pipeline-for-bacterial-transcriptome-analysis-case

Research

JoVE Journal

Biology

A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

10.3K 조회수.  University of Groningen. This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages. 

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Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

라이브 셀 이미징 바실러스 subtilis과 연쇄상 구균 pneumoniae 자동 시간 저속 현미경을 사용하여

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

연구

면역학 및 감염병학

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some factors act directly on virulence genes; others control pathogenesis by adjusting the expression of downstream regulators or the accumulation of signals that affect regulator activity. While regulation has been studied extensively during in vitro growth, relatively little is known about how gene expression is adjusted during infection. Such information is important when a particular gene product is a candidate for therapeutic intervention. Transcriptional approaches like quantitative, real-time RT-PCR and RNA-Seq are powerful ways to examine gene expression on a global level but suffer from many technical challenges including low abundance of bacterial RNA compared to host RNA, and sample degradation by RNases. Evaluating regulation using fluorescent reporters is relatively easy and can be multiplexed with fluorescent proteins with unique spectral properties. The method allows for single-cell, spatiotemporal analysis of gene expression in tissues that exhibit complex three-dimensional architecture and physiochemical gradients that affect bacterial regulatory networks. Such information is lost when data are averaged over the bulk population. Herein, we describe a method for quantifying gene expression in bacterial pathogens in situ. The method is based on simple tissue processing and direct observation of fluorescence from reporter proteins. We demonstrate the utility of this system by examining the expression of Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), whose gene product is required for immune evasion and full virulence ex vivo and in vivo. We show that nuc-gfp is strongly expressed in renal abscesses and reveal heterogeneous gene expression due in part to apparent spatial regulation of nuc promoter activity in abscesses fully engaged with the immune response. The method can be applied to any bacterium with a manipulatable genetic system and any infection model, providing valuable information for preclinical studies and drug development.

Described here is a method for analyzing bacterial gene expression in animal tissues at a cellular level. This method provides a resource for studying the phenotypic diversity occurring within a bacterial population in response to the tissue environment during an infection.

감염 된 조직에서 세균 유전자 규칙을 공부 하는 형광 기반 방법

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

유전학

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

연쇄상 구균 폐렴으로 비강 내 식민지 화 중 염증 반응의 특성화

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

생물 발광 박테리아를 사용하여 실시간으로 급성 폐렴 마우스 모델에서 폐렴 구균 독성 요인의 영향에 따라

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

오버레이 분석을 사용하여 성적으로 폐렴 구균 박테리오신에 대한 세균의 생산 및 감도를 측정하는

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized notably due to the difficulty of identifying their mRNA targets. Here, we described a modified protocol of the MS2-Affinity Purification coupled with RNA Sequencing (MAPS) technology, aiming to reveal all RNA partners of a specific sRNA in vivo. Broadly, the MS2 aptamer is fused to the 5&#8217; extremity of the sRNA of interest. This construct is then expressed in vivo, allowing the MS2-sRNA to interact with its cellular partners. After bacterial harvesting, cells are mechanically lysed. The crude extract is loaded into an amylose-based chromatography column previously coated with the MS2 protein fused to the maltose binding protein. This enables the specific capture of MS2-sRNA and interacting RNAs. After elution, co-purified RNAs are identified by high-throughput RNA sequencing and subsequent bioinformatic analysis. The following protocol has been implemented in the Gram-positive human pathogen Staphylococcus aureus and is, in principle, transposable to any Gram-positive bacteria. To sum up, MAPS technology constitutes an efficient method to deeply explore the regulatory network of a particular sRNA, offering a snapshot of its whole targetome. However, it is important to keep in mind that putative targets identified by MAPS still need to be validated by complementary experimental approaches.

MAPS technology has been developed to scrutinize the targetome of a specific regulatory RNA in vivo. The sRNA of interest is tagged with a MS2 aptamer enabling the co-purification of its RNA partners and their identification by RNA sequencing. This modified protocol is particularly suited for Gram-positive bacteria.&#160;

그람 양성 박테리아에서 RNA 염기서열분석과 결합된 MS2-선호도 정화

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

생화학

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of this method, in comparison to other approaches, is its ability to monitor translation by precisely mapping the position and number of ribosomes on a mRNA transcript.
In this article, we describe the consecutive stages of sample collection and preparation for RIBO-seq method in bacteria, highlighting the details relevant to the planning and execution of the experiment.
Since the RIBO-seq relies on intact ribosomes and related mRNAs, the key step is rapid inhibition of translation and adequate disintegration of cells. Thus, we suggest filtration and flash-freezing in liquid nitrogen for cell harvesting with an optional pretreatment with chloramphenicol to arrest translation in bacteria. For the disintegration, we propose grinding frozen cells with mortar and pestle in the presence of aluminum oxide to mechanically disrupt the cell wall. In this protocol, sucrose cushion or a sucrose gradient ultracentrifugation for monosome purification is not required. Instead, mRNA separation using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by the ribosomal footprint excision (28-30 nt band) is applied and provides satisfactory results. This largely simplifies the method as well as reduces the time and equipment requirements for the procedure. For library preparation, we recommend using the commercially available small RNA kit for Illumina sequencing from New England Biolabs, following manufacturer&#39;s guidelines with some degree of optimization.
The resulting cDNA libraries present appropriate quantity and quality required for next generation sequencing (NGS). Sequencing of the libraries prepared according to the described protocol results in 2 to 10 mln uniquely mapped reads per sample providing sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is quick and relatively easy and can be performed with standard laboratory equipment.

Here we describe the stages of sample collection and preparation for RIBO-seq in bacteria. Sequencing of the libraries prepared according to these guidelines results in sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is simple, uses standard laboratory equipment and takes seven days from lysis to obtaining libraries.

박테리아의 RIBO-seq: NGS 시퀀싱을 위한 샘플 수집 및 라이브러리 준비 프로토콜

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, studies in this serotype have been hindered by the lack of genetic tools to modify it. In this study, we describe a method to genetically modify a serotype 1 clinical isolate (strain 519/43). Interestingly, this was achieved by exploiting the Pneumococcus&#8217; ability to naturally acquire DNA. However, unlike most pneumococci, the use of linear DNA was not successful; to mutate this important strain, a suicide plasmid had to be used. This methodology has provided the means for a deeper understanding of this elusive serotype, both in terms of its biology and pathogenicity. To validate the method, the major known pneumococcal toxin, pneumolysin, was mutated because it has a well-known and easy to follow phenotype. We showed that the mutant, as expected, lost its ability to lyse red blood cells. By being able to mutate an important gene in the serotype of interest, we were able to observe different phenotypes for loss of function mutants upon intraperitoneal and intranasal infections from the ones observed for other serotypes. In summary, this study proves that strain 519/43 (serotype 1) can be genetically modified.

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Here, we describe a S. pneumoniae serotype 1 strain 519/43 that can be genetically modified by using its ability to naturally acquire DNA and a suicide-plasmid. As proof of principle, an isogenic mutant in the pneumolysin (ply) gene was made.

혈청형 1 Streptococcus pneumoniae 균주 519/43에서 돌연변이 구성

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, ...

Isolation of Total RNA from Pseudomonas aeruginosa within Biofilms for Measuring Gene Expression

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen that causes infections in the airways of cystic fibrosis (CF) patients. P. aeruginosa is known for its ability to form biofilms that are protected by a matrix of exopolysaccharides. This matrix allows the microorganisms to be more resilient to external factors, including antibiotic treatment. One of the most common methods of biofilm growth for research is in microtiter plates or chambered slides. The advantage of these systems is that they allow for the testing of multiple growth conditions, but their disadvantage is that they produce limited amounts of biofilm for RNA extraction. The purpose of this article is to provide a detailed, step by step protocol on how to extract total RNA from small amounts of biofilm of sufficient quality and quantity for high throughput sequencing. This protocol allows for the study of gene expression within these biofilm systems.

<meta charset="utf8"></head><body>유전자 발현 측정을 위한 생물막 내 Pseudomonas aeruginosa에서 총 RNA 분리

This protocol presents a method to isolate RNA from Pseudomonas aeruginosa biofilms grown in chamber slides for high throughput sequencing.

유전자 발현 측정을 위한 생물막 내 Pseudomonas aeruginosa 에서 총 RNA 분리

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen that causes infections in the airways of cystic fibrosis (CF) patients. P. aeruginosa is ...

세균의 사체 분석 사례 연구에 대한 빠르고 안정적인 파이프 라인 : 세린에 의존하는 유전자 조절에

요약

더 많은 비디오 탐색

라이브 셀 이미징 바실러스 subtilis과 연쇄상 구균 pneumoniae 자동 시간 저속 현미경을 사용하여

감염 된 조직에서 세균 유전자 규칙을 공부 하는 형광 기반 방법

연쇄상 구균 폐렴으로 비강 내 식민지 화 중 염증 반응의 특성화

생물 발광 박테리아를 사용하여 실시간으로 급성 폐렴 마우스 모델에서 폐렴 구균 독성 요인의 영향에 따라

오버레이 분석을 사용하여 성적으로 폐렴 구균 박테리오신에 대한 세균의 생산 및 감도를 측정하는

그람 양성 박테리아에서 RNA 염기서열분석과 결합된 MS2-선호도 정화

박테리아의 RIBO-seq: NGS 시퀀싱을 위한 샘플 수집 및 라이브러리 준비 프로토콜

혈청형 1 Streptococcus pneumoniae 균주 519/43에서 돌연변이 구성

유전자 발현 측정을 위한 생물막 내 Pseudomonas aeruginosa 에서 총 RNA 분리

유전자 발현 측정을 위한 생물막 내 Pseudomonas aeruginosa 에서 총 RNA 분리

세균의 사체 분석 사례 연구에 대한 빠르고 안정적​​인 파이프 라인 : 세린에 의존하는 유전자 조절에

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생물 발광 박테리아를 사용하여 실시간으로 급성 폐렴 마우스 모델에서 폐렴 구균 독성 요인의 영향에 따라

오버레이 분석을 사용하여 성적으로 폐렴 구균 박테리오신에 대한 세균의 생산 및 감도를 측정하는

그람 양성 박테리아에서 RNA 염기서열분석과 결합된 MS2-선호도 정화

박테리아의 RIBO-seq: NGS 시퀀싱을 위한 샘플 수집 및 라이브러리 준비 프로토콜

혈청형 1 Streptococcus pneumoniae 균주 519/43에서 돌연변이 구성

유전자 발현 측정을 위한 생물막 내 Pseudomonas aeruginosa 에서 총 RNA 분리

유전자 발현 측정을 위한 생물막 내 Pseudomonas aeruginosa 에서 총 RNA 분리

세균의 사체 분석 사례 연구에 대한 빠르고 안정적인 파이프 라인 : 세린에 의존하는 유전자 조절에