Nous remercions Anne de Jong et Siger Holsappel de l&#39;aide à la production de puces à ADN de diapositive. Le soutien d&#39;Anne de Jong pour l&#39;analyse bioinformatique est également apprécié. Nous remercions également Jelle Slager d&#39;examiner le document. Muhammad Afzal et Irfan Manzoor sont pris en charge par l&#39;Université GC, Faisalabad, Pakistan, sous le programme de développement du corps professoral d&#39;HEC Pakistan.

1. Préparation des médias et culture cellulaire <ol><li> Cultivez S. pneumoniae D39 souche de type sauvage 21 comme décrit précédemment 11. Ensemencer les cellules stockées à -80 ° C dans 10% de glycerol (par rapport 1/100 dans 50 ml de tubes stériles) dans 50 ml de constitution chimique définie moyenne (MDP), avec un pH final de 6,4 à 15, mais omettre la L-sérine à partir de l&#39;acide aminé mélange. Remarque: deux MDP différents ont été utilisés; une contenant une concentration minimale de L-sérine (150 uM) et l&#39;autre contenant une concentration maximale de L-sérine (10 mM). Cette concentration minimum est essentiellement la concentration de L-sérine dans le plasma sanguin humain et l&#39;objectif est de comparer l&#39;expression des gènes de S. pneumoniae souche D39 en vertu de ces deux conditions. </li></ol> 2. Isolement de l&#39;ARN total <ol><li> Matériels <ol><li> Utilisation de l&#39;acide phénol, le grade d&#39;ARN pour l&#39;isolement de l&#39;ARN total. </li><li> Macaloid: <ol><li> Suspendre deux grammes deMacaloid dans 100 ml de TE et faire bouillir pendant 5 min. Refroidir à température ambiante et soniquer jusqu&#39;à Macaloid gels.Centrifuge la solution à 2000 g pendant 5 min à température ambiante, remettre en suspension dans 50 ml de TE pH 8 et conserver à 4 ° C. </li></ol></li><li> Solutions: <ol><li> Traiter toutes les solutions avec diéthylpyrocarbonate (DEPC). Ajouter 100 ul DEPC / 100 ml de solution, incuber O / N à 37 ° C et l&#39;autoclave pendant 15 min. </li></ol></li></ol></li><li> Méthodologie <ol><li> Croître de 50 ml de S. culture cellulaire pneumoniae D39 en tubes de 50 ml à 37 ° C (sans agitation) jusqu&#39;à la phase mi-exponentielle (DO ~ 0,3). cultures de centrifugation à 4 ° C sur 10 000 g pendant 2 min. Jeter les médias et geler immédiatement les culots de cellules dans l&#39;azote liquide. </li><li> Premix 300 ul de chloroforme: IAA (24: 1) et 300 ul de phénol (phénol acide, la teneur de l&#39;ARN). Utiliser 500 ul de la phase organique dans l&#39;étape 2.2.3. </li><li> Préparer le mélange suivant à l&#39;avance dans des tubes à bouchon à vis sans ARN: 00,5 g de billes de verre, 50 pi de SDS à 10%, 500 ul de phénol / chloroforme: IAA (tel que préparé dans l&#39;étape 2.2.2), Macaloid couche (150 à 175 ul, pas exact car il est très visqueux). Remettre en suspension les culots cellulaires dans 400 ul de TE (DEPC) et ajouter les cellules remises en suspension dans des tubes à bouchon à vis. </li><li> Pour briser les cellules, placer les tubes à bouchon à vis dans une pile de billes pour des impulsions 2x 60 &quot;(&quot; d&#39;homogénéiser &#39;) avec 1 min d&#39;intervalle sur la glace. Centrifuger les échantillons pendant 10 min à 10000 × g (4 ° C). </li><li> Verser la phase supérieure dans un nouveau tube, ajouter 500 ul de chloroforme: IAA (24: 1) et centrifuger pendant 5 min à 10000 × g (4 ° C). </li><li> Transférer 500 ul de la phase supérieure dans des tubes frais, ajouter 2 volumes (1 ml) de tampon de lyse / liaison et mélanger par pipetage de haut en bas. Isoler l&#39;ARN total en utilisant le kit d&#39;isolement d&#39;ARN et suivre le protocole recommandé fabricant. </li></ol></li></ol> 3. ARN Nettoyage &lt;<html> ol&gt; <li> Pour supprimer la contamination de l&#39;ADN de l&#39;ARN total, ajouter 100 ul DNAseI mix (tampon de DNAse 90 pi et 10 pi DNAseI) et incuber pendant 20-30 min à 15-25 ºC. </li><li> Laver nettoyé ARN en utilisant le kit RNAse. Obtenir 50 ul volume élue. </li></ol> 4. Analyse de l&#39;ARN <ol><li> Déterminer la concentration de l&#39;ARN sur un spectrophotomètre. Déterminer la qualité de l&#39;ARN en utilisant un dosage de la manière suivante (figure 2). <ol><li> Diluer 1 pi d&#39;échantillon de 50 ul d&#39;eau DEPC pour obtenir une concentration de 20 à 200 ng / ul. </li><li> Utilisez une ul échantillon d&#39;ARN dilué à vérifier la qualité sur le Bioanalyser selon les instructions du fabricant. </li></ol></li><li> Remarque: un rapport de 23S 16S: de l&#39;ordre de 2,0 est considéré comme bon ARN 1 unité A260 correspond à 40 pg / ml.. Une quantité recommandée pour l&#39;étiquetage est de 10-20 mg. </li></ol> 5. ADNc Préparation et d&#39;étiquetage MÉNAGEMENT &quot;&gt; NOTE: Le protocole suivant a été suivie pour la préparation d&#39;ADNc et l&#39;étiquetage. <ol><li> Recuit <ol><li> Effectuer réaction de recuit dans 300 tubes de PCR ul, en gardant la concentration d&#39;ARN total de 10 à 15 pg pour diapositives maison ou 5 ug pour les diapositives de l&#39;entreprise fait. Mélanger l&#39;ARN avec 2 ul nonamères aléatoires (1,6 ug / ul) et ajouter de l&#39;eau sans nuclease si nécessaire pour maintenir le volume final du mélange d&#39;hybridation à 18 ul. </li><li> Conserver le mélange d&#39;annelage à 70 ° C pendant 5 min. Après cela, le mélange refroidir à la température ambiante pendant 10 min (recuit) et, si nécessaire, centrifuger les réactions au fond du tube. Placer les tubes de réaction sur de la glace pendant au moins 1 min. </li></ol></li><li> Reverse Transcription <ol><li> Préparer la transcriptase mélange inverse comme suit: à 18 pl recuit mélange, ajouter 12 ul de mélange maître (constitué de tampon 5X First Strand 6 pi, 3 pi de 0,1 M DDT, 1,2 pl 25x AA-dUTP / nucléotide mix et 1,8 pl inverser transcriptase (1 pi pour les diapositives de l&#39;entreprise fait). Gardez le mélange de réaction pour 2-16 h à 42 ° C. </li></ol></li></ol> 6. La dégradation de l&#39;ARNm et de l&#39;ADNc Purification <ol><li> Pour dégrader l&#39;ARNm à partir du mélange réactionnel, ajouter 3 ul de NaOH 2,5 M et lieu à 37 ° C pendant environ 15 min. Par la suite, ajouter 15 pi de 2M HEPES acide libre pour neutraliser le NaOH. </li><li> On purifie le mélange d&#39;ADNc en utilisant des colonnes de nettoyage de PCR et suivre le protocole du fabricant. </li></ol> 7. Mesure de la concentration d&#39;ADNc <ol><li> Mesurer les concentrations d&#39;ADNc sur un spectrophotomètre. Pour continuer avec l&#39;étiquetage, vérifier que la concentration de l&#39;ADNc est d&#39;au moins 60 ng / ul (diapositives maison) ou 20 ng / ul (des diapositives de l&#39;entreprise fait). </li></ol> 8. étiquetage des ADNc avec Amine-colorant réactif et purification <ol><li> Utilisation colorant réactif d&#39;amine pour marquer l&#39;ADNc. Directement mélanger la ADNc avec une aliquote (5 pi) deamine-réactif colorant. </li><li> Incuber le mélange à la température ambiante, dans l&#39;obscurité, pendant 60 à 90 min et passer directement à la purification de l&#39;ADNc marqué par un colorant. Purifier l&#39;ADNc marqué par un colorant à l&#39;aide de colonnes de nettoyage de PCR et en suivant le protocole du fabricant. Eluer ADNc dans 50 ul de tampon d&#39;élution. </li></ol> 9. Mesure de labélisée ADNc <ol><li> Utilisation d&#39;un spectrophotomètre pour mesurer l&#39;incorporation de colorants réagissant avec les amines dans l&#39;ADNc. Vérifier que la concentration de colorants réagissant avec les amines est au moins 0,5 pmol / ul dans un volume total de 50 ul. </li></ol> 10. Le mélange des échantillons étiquetés ADNc <ol><li> Pour les diapositives maison, utiliser tous les ADNc marqué pour l&#39;hybridation avec une différence non supérieure à 30% de la concentration d&#39;ADNc. Pour les diapositives de l&#39;entreprise fait, utiliser ADNc avec pas plus de différence de 2 fois la concentration ADNc. Remarque: normalement, environ 300 ng d&#39;ADNc est nécessaire pour les diapositives de l&#39;entreprise fait, qui est très peu par rapport à la required quantité d&#39;ADNc pour les diapositives maison. </li></ol> 11. hybridation et de lavage <ol><li> Utilisez les réactifs suivants: eau déminéralisée, l&#39;éthanol 99%, SHY tampons (maison; avec un ARN de levure 40 pi). Préparer maximum 1 ml de SHY. </li><li> Appareillage et solutions préparation <ol><li> Allumez concentrateurs sous vide et de chauffage au moins 1 h avant le séchage. Mettre sur l&#39;hybridation four, au point ajustée à la température d&#39;hybridation correcte de jeu (pour S. pneumoniae puces à ADN, utiliser 45 ° C). De même, préchauffer la cassette d&#39;hybridation et four pendant 30-60 min. </li><li> Préchauffer tampon SHY à 68 ° C pendant au moins 30 min. </li></ol></li><li> La préparation des échantillons (ADNc marqué) <ol><li> Mélanger des quantités égales de ADNc marqués (max 30% de différence). Sécher l&#39;échantillon en utilisant des concentrateurs à vide à haute température (env. 40 min) jusqu&#39;à ce que le volume est inférieur à 7 ul. </li></ol></li><li> Lifter-dérapant <ol><li> Utilisez Lifter-feuillets propres.Remarque: ± 30 pi peuvent être chargés sur la diapositive. </li><li> Nettoyez les Lifter-feuillets avec du savon, beaucoup d&#39;eau du robinet et 100% d&#39;éthanol. Remarque: les bordereaux de levage sales donnent bruit de fond élevé. </li><li> Air sécher les Lifter-feuillets avec pistolet à air pour souffler les particules de poussière. Placez un lève-dérapant propre sur la diapositive avec le revêtement de téflon blanc sur les côtés vers le bas. </li></ol></li><li> L&#39;ajout d&#39;un tampon d&#39;hybridation (à l&#39;ADNc marqué) <ol><li> Dissoudre les échantillons de colorants secs dans 7 ul de H2O et incuber à 94 ° C pendant 2 min. </li><li> Immédiatement, ajouter 35 ul tampon préchauffé SHY (68 ° C), mélanger doucement et de spin à vitesse maximale pendant 1 min pour se débarrasser de précipités. Préchauffez la sonde à 68 ° C pendant environ 5 min jusqu&#39;à ce que le chargement. </li></ol></li><li> Glissez-lifter-dérapant assemblage et préchauffage. <ol><li> Placez le porte hybridation diaporama sur un bloc thermique à 50 ° C. Placer les lames de puces à ADN avec le lifter-dérapant sur le support hybridation diaporama chauffée et préchauffer la lame avec lifter-dérapant pour une minute. Effectuez les prochaines étapes le plus rapidement possible. </li><li> Ajouter 40 ul de la cible de l&#39;échantillon à l&#39;extrémité de la glissière. Permettre au fluide de se écouler entre les surfaces de verre par la force capillaire. Effectuer toutes pipetage lentement et prudemment. </li><li> Gardez les diapositives avec lifter-dérapant horizontale en tout temps et se déplacer lentement pour se assurer que le dispositif de levage-dérapant ne bougea pas. </li><li> Prenez la cassette préchauffé hybridation du four d&#39;hybridation et de fermer la machine. Lieu de papier-filtre imbibé de 3 ml 2x SSC (citrate salin standard) dans la cassette d&#39;hybridation. </li><li> Placez délicatement le support de diapositives d&#39;hybridation avec diapositives dans la cassette d&#39;hybridation. Fermez la cassette d&#39;hybridation et de mettre dans le four à hybridation à nouveau (pour environ 16 à 18 h). </li></ol></li><li> Glisser à laver <ol><li> Préparer frais lavage-tampons I, II et III (750 ml par étape de lavage). Pour 500 ml laver tampon I, utiliser 2 x SSC / 0,5% de SDS. Pour 500 ml laver chamoiser II, utilisez 1 x SSC / SDS à 0,25%. Pour 500 ml laver tampon III, utiliser 1 x SSC / 0,1% SDS (facultatif) </li><li> Placez les lavage-tampons à 30 ° C (pour être sûr SDS est dissous). </li><li> Immerger les lames aussi rapidement que possible, mais très doucement, dans un tube falcon rempli de 50 mL Tampon de lavage jusqu&#39;à ce que je le verre repose sur le fond conique du tube. </li><li> Après quelques secondes, lorsque les puits de levage-dérapant au fond du tube, sortir la lame avec des pincettes sans rayer le tableau et mis dans le rack de la station de lavage. Continuer avec le lavage sans écart de temps. </li><li> Laver les lames pendant 5 min dans 500 ml laver tampon I (dans une station de lavage). Donnez-lui un second lavage pendant 20-30 min dans 500 ml laver tampon II (dans une station de lavage). De même, laver les lames pendant 5 min dans 500 ml laver tampon III (facultatif) (dans une station de lavage). </li><li> Sécher les diapositives pendant 2 min à 2000 rpm. </li></ol></li></ol> 12. Microarray analyse <ol><li> Numérisation des imagesavec des longueurs d&#39;onde respectives en scanner et enregistrer dans un dossier &quot;Projet Jove&quot;. </li><li> Utiliser un logiciel pour analyser les fichiers numérisés d&#39;abord comme décrit précédemment 22. Après l&#39;exécution de ce logiciel, sélectionnez l&#39;onglet &quot;Ouvrir une image&quot; pour charger le fichier image rouge (-.550) comme &quot;Rouge&quot; et le fichier d&#39;image verte (-.635) que &quot;Green&quot;. Téléchargez le fichier gal (de .GAL) ayant S. pneumoniae liste de tableau sur le fichier image en sélectionnant &quot;Load Array List&quot; onglet 22. Remarque: cette liste de tableau se composait de 48 grilles, sur chaque grille, il y avait 16 lignes et 15 colonnes. Chaque place sur la grille représente un seul gène et de l&#39;information au comptant incluant le nom du gène est ajouté à travers un fichier de description de place. Les numéros de place sont donnés à partir de gauche à droite et de haut en bas. </li><li> Après avoir repéré attentivement les grilles, sélectionnez l&#39;onglet &quot;Trouver Array, Trouver blocs, Aligner Caractéristiques&quot; pour aligner les points. Après l&#39;alignement de toutes les fonctionnalités, d&#39;analyser l&#39;image en sélectionnant le &quot;Analyse&quot; tab. Créez un nouveau fichier ayant des résultats, l&#39;histogramme et diagramme de dispersion. Enregistrez ce fichier à partir de l&#39;onglet &quot;Résultats Enregistrer sous&quot; dans un fichier .gpr pour une analyse ultérieure. </li><li> Effectuer poursuite de la normalisation et le traitement des données avec le logiciel Microprep développé en interne comme décrit neuf. </li><li> Utilisez répétitions biologiques indépendants pour les données de puces à ADN qui sont colorant échangé. Effectuer la mise en œuvre CYBERT d&#39;une variante de t-test1 et calculer les taux de découverte de faux (FDR) comme décrit neuf. </li><li> Pour gènes exprimés de manière différentielle, prenez p &lt;0,001 et FDR &lt;0,05 comme une norme. </li><li> Télécharger des données de puces à ADN sur la page de présentation NCBI pour obtenir un GEO (Gene Expression Omnibus) numéro d&#39;accession. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils ne ont aucun intérêt financier concurrentes.

Nous décrivons un protocole conviviale qui peut être appliquée pour effectuer l&#39;analyse de transcriptome total de bactéries. Le point clé de cette technique particulière, ce est que la condition dans laquelle les cellules sont récoltées varie. Après la récolte des cellules et isolement de l&#39;ARN, cette technique devient égale pour tous les types d&#39;échantillons bactériens et suit les étapes exactement identiques et, par conséquent, peut être appliquée à tout type de culture bactérienne. Le p...

L&#39;étude de l&#39;ensemble des ARNm abondance (transcriptome) codée par le génome d&#39;un organisme unicellulaire ou une cellule eucaryote à un moment précis ou dans des conditions spécifiques, y compris la surexpression du gène ou knock-out, est appelé transcriptomique. Transcriptomique nous permet d&#39;observer dans quelle mesure les gènes sont exprimés sous une condition particulière à un instant X et nous donne des informations sur la façon fortement les gènes sont exprimés par rapport à une référence. Une puce à ADN est une matrice bidimensionnelle sur un substrat solide (généralement une lame de verre ou de silicium cellule à couche mince) qui peut être utilisé pour doser des quantités importantes de matière biologique en utilisant un criblage à haut débit, et miniaturisé, le traitement en multiplex et parallèle et la détection méthodes. Microarrays viennent en différents types, y compris ADN puces, des puces à protéines, puces peptidiques, puces tissulaires, microarrays d&#39;anticorps, puces cellulaires et autres. Une puce à ADN estessentiellement un ensemble de taches microscopiques d&#39;ADN fixé à une surface solide, généralement en verre. Les puces à ADN sont utilisés pour mesurer les niveaux d&#39;expression d&#39;un gène ou d&#39;un ensemble de gènes simultanément ou au génotype plusieurs régions du génome 2,3. Picomoles (10 -12 mole) d&#39;une sonde sont présents au sein de chaque point d&#39;ADN qui représente une séquence d&#39;ADN spécifique, aussi connu comme un journaliste. Les molécules d&#39;ARNm étiquetés à partir des échantillons sont appelés «cibles». Les fluorophores sont utilisés pour mesurer l&#39;hybridation sonde-cible et la détection de cibles marqué par un fluorophore détermine l&#39;abondance relative des séquences d&#39;acide nucléique dans la cible. Une expérience de puces à ADN peut accomplir des tests génétiques multiples en parallèle, car un tableau peut contenir des dizaines de milliers de sondes. La disposition d&#39;une expérience de puces à ADN simple est illustrée à la figure 1. Récemment, il a été établi dans nos laboratoires et d&#39;autres que ces tableaux sont réutilisables, ce qui rend cette technique très coût-effective. Des techniques d&#39;isolement et de purification d&#39;ARN différents ont été développés au cours des années, y compris C-TAB, SDS et méthodes GT 4-8. En outre, plusieurs kits commerciaux sont également disponibles. Pour l&#39;expression des gènes de l&#39;ARN de haute qualité est très importante. Par conséquent, les procédés d&#39;isolement de l&#39;ARN sont modifiés pour obtenir une quantité maximale de l&#39;ARN. De même, les étapes de préparation d&#39;ADNc et l&#39;étiquetage des ADNc sont minimisés. Normalisation des données après la numérisation est également effectuée efficacement en utilisant maison-intégré paquets et des outils logiciels neuf. Streptococcus pneumoniae est un agent pathogène humain à Gram positif qui colonise le nasopharynx et est la cause de multiples infections telles que la pneumonie, la septicémie, l&#39;otite moyenne et la méningite 10. La bactérie peut utiliser une grande variété de nutriments nécessaires à la croissance et à la survie 11,12. Un certain nombre d&#39;études ont été menées sur lamétabolisme de l&#39;azote à pneumocoques et la réglementation en soulignant l&#39;importance des acides aminés et de leur rôle dans la virulence 13,14. Dans cette étude, la réponse transcriptomique de S. pneumoniae à l&#39;évolution des concentrations de L-sérine, un acide aminé abondamment présent dans le plasma de sang humain, est présenté en utilisant des puces à ADN. La réponse transcriptomique de S. pneumoniae cultivées dans une concentration minimale de L-sérine (150 uM) a été comparée à celle développée dans une concentration maximale (10 mM) de serine. Milieu défini chimiquement (MDP ou milieu minimal) 15 a été utilisé pour cette étude pour contrôler la concentration de la sérine. L&#39;objectif de cette étude est de rendre cette technique convivial et pour fournir différents outils pour la normalisation et l&#39;analyse des données. Par conséquent, un certain nombre d&#39;outils ont été développés pour l&#39;analyse et l&#39;interprétation des données. FIVA (fonctionnelle Information Viewer et Analyzer) fournit une plate-forme pour traitement de l&#39;information contenue dans des groupes de gènes ayantprofils d&#39;expression des gènes semblables et pour la construction de profils fonctionnels 16. PROCUREUR est un autre logiciel qui facilite l&#39;identification des fonctions putatives et annotations de gènes 17. En faisant usage de méthodes de classification, COMMUNIQUER fournit un algorithme de détection de liaison du site de l&#39;ADN. Cis de les motifs de gènes peuvent être projetées en utilisant cet algorithme 18. Genome2D offre une plate-forme Windows pour la visualisation et l&#39;analyse des données du transcriptome en offrant différentes gammes de couleurs pour caractériser les changements dans les niveaux d&#39;expression des gènes sur une carte du génome 19. Le serveur Web de Pepper propose, en plus de la méthode tout-en-une analyse, une boîte à outils pour l&#39;exploitation minière pour les régulons, promoteurs et de liaison du facteur de transcription 20 sites. Annotation complet de régions intergéniques dans un génome bactérien peut être obtenu en utilisant ce paquet. Les biologistes peuvent grandement bénéficier de poivre car il leur offre une plate-forme pour la conception de l&#39;expériences afin que les informations hypothétique peut être confirmée in vitro 20. Ces logiciels contribuent de manière significative à l&#39;analyse des microréseaux comme la plupart d&#39;entre eux sont librement disponibles et font la normalisation et l&#39;analyse des données très fiable.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid phenol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P4682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche RNA isolation kit</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>11828665001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td></td>
			<td>105015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Boom</td>
			<td>92013505.1000.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAA</td>
			<td></td>
			<td>106630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ND-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent BioAnalyser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2940CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AA-dUTP</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>AM8439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDT</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First Strand buffer</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>S8045-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight-550</td>
			<td>Thermoscientiffic</td>
			<td>62262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight-650</td>
			<td>Thermoscientiffic</td>
			<td>62265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHY Buffer</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>H7033-125ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speedvac cooler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>RUGNE3140</td>
			<td>Speedvac concentrator plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Grant Boekel</td>
			<td>Iso-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifter-slips</td>
			<td>Erie Scientific</td>
			<td>25x60I-M-5439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wipe</td>
			<td>KIMTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>L3771-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>W302600-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genpix autoloader 4200A1</td>
			<td>MSD analytical technologies</td>
			<td></td>
			<td>Microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>104766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fast and reliable pipeline for bacterial transcriptome analysis case study: serine-dependent gene regulation in streptococcus pneumoniae

L&#39;expression des gènes et son règlement sont très importantes pour comprendre le comportement des cellules dans des conditions différentes. Diverses techniques sont utilisées de nos jours pour étudier l&#39;expression des gènes, mais la plupart sont limités en termes de fournir une vue d&#39;ensemble de l&#39;expression de l&#39;ensemble du transcriptome. Les puces à ADN offrir une technologie de recherche rapide et économique, qui donne un aperçu complet de l&#39;expression globale des gènes et avoir un grand nombre d&#39;applications, y compris l&#39;identification de nouveaux gènes et facteur de transcription sites, la caractérisation de l&#39;activité transcriptionnelle des cellules et lient également aider à analyser des milliers des gènes (en une seule expérience). Dans la présente étude, les conditions pour bactérienne analyse du transcriptome de la récolte de cellules à l&#39;analyse des microréseaux d&#39;ADN ont été optimisés. Prenant en compte le temps, les coûts et la précision des expériences, cette plate-forme de la technologie se avère très utile et universellement applicabale pour étudier transcripto bactériennemes. Ici, nous effectuons l&#39;analyse des microréseaux d&#39;ADN avec Streptococcus pneumoniae comme une étude de cas en comparant les réponses de la transcription de S. pneumoniae cultivées en présence de concentrations de L-sérine dans le milieu variable. L&#39;ARN total a été isolé en utilisant un procédé Macaloid en utilisant un kit d&#39;isolement d&#39;ARN et la qualité de l&#39;ARN a été vérifiée en utilisant un kit RNA de contrôle de la qualité. L&#39;ADNc a été préparé en utilisant la transcriptase inverse et les échantillons d&#39;ADNc ont été marquées avec l&#39;une des deux colorants fluorescents réactifs avec les amines. Diapositives de microréseaux d&#39;ADN maison ont été utilisés pour l&#39;hybridation des échantillons d&#39;ADNc marqués et les données de puces à ADN ont été analysés en utilisant un cadre de données des puces à ADN de pré-traitement (Microprep). Enfin, Cyber-T a été utilisé pour analyser les données générées à l&#39;aide Microprep pour l&#39;identification de gènes différentiellement exprimés statistiquement significatives. Progiciels outre, construits en interne (poivre, FIVA, divulguer, PROCUREUR, Genome2D) ont été utilisés pour analyserdonnées.

ARN, l&#39;isolation et l&#39;analyse d&#39;ADNc L-sérine est l&#39;un des acides aminés essentiels et de sa concentration dans le plasma sanguin humain varie de 60 à 150 uM chez les enfants et les adultes. Son rôle dans la biosynthèse des purines et des pyrimidines souligne son importance dans le métabolisme et ce est un précurseur de plusieurs acides aminés (glycine, la cysteine ​​et le tryptophane). Pour étudier l&#39;impact de la L-sérine dans l&#39;ensembl...

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A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.

Un pipeline rapide et fiable pour l&#39;étude de cas analyse bactérienne transcriptome: Serine dépendant régulation des gènes dans<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Gene expression and its regulation are very important to understand the behavior of cells under different conditions. Various techniques are used nowadays ...

a-fast-reliable-pipeline-for-bacterial-transcriptome-analysis-case

Research

JoVE Journal

Biology

A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

10.3K vues.  University of Groningen. This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages. 

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Analyse bactérienne expression génique par puces à ADN

Recherche

Biologie

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolement du ribosome Bound polypeptides naissants<em&gt; In vitro</em&gt; Pour identifier les sites de pause de translation le long d&#39;ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Utilisation de la séquence d&#39;arrêt SecM comme un outil pour isoler les polypeptides Ribosome Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

La délétion de gènes dans le génome entier<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Par PCR à haut débit

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse de Global ARN de synthèse à la Cellule Plain suivante hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA contrôle pour la ubiquitine et les régulateurs du système ubiquitine-comme des voies biologiques dans des cellules de mammifères en culture

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

L&#39;extraction d&#39;acide nucléique et efficace de l&#39;ARNr 16S bactérien pour Séquençage génique communautaire Caractérisation

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Approches génétiques et biochimiques pour<em&gt; In Vivo</em&gt; et<em&gt; In vitro</em&gt; Évaluation de Protein oligomérisation: Étude de cas Ryanodine Receptor

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus on one or more gene families that are significant to the organism and study. In this protocol, we outline bioinformatic steps to generate a phylogeny and to quantify the expression of genes of interest. Phylogenetic trees can give insight into how genes are evolving within and between species as well as reveal orthology. These results can be enhanced using RNA-seq data to compare the expression of these genes in different individuals or tissues. Studies of molecular evolution and expression can reveal modes of evolution and conservation of gene function between species. The characterization of a gene family can serve as a springboard for future studies and can highlight an important gene family in a new genome or transcriptome paper.

The purpose of this protocol is to investigate the evolution and expression of candidate genes using RNA sequencing data.

Un pipeline bioinformatique pour étudier l’évolution moléculaire et l’expression génique à l’aide de l’ARN-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...