Reconocemos el apoyo financiero de la Salud y medicina Consejo Nacional de Investigación (subvención APP605524, 490.037 y 1.047.082), el Consejo Australiano de Investigación (subvención DP12010061), la Estrategia de Infraestructuras de Investigación Cooperativa Nacional de Australia y el fondo de inversión de Educación del Departamento de Innovación, Industria , Ciencia e Investigación. PML es un receptor de un premio de postgrado australiano.

Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con las políticas de la Universidad de Macquarie y conformados a la Salud y medicina Consejo Superior de Investigaciones Científicas (NHMRC) Código australiano de la práctica. El trabajo se realizó en las Ética acuerdo No ARA 2012/017 aprobado y obtuvo del Comité de Ética Animal de la Universidad de Macquarie. Todos los experimentos se realizaron en ratones SJL / J menos que se indique lo contrario. 1. Los ratones y Experimental Malaria infección <ol><li> Los ratones bajo temperatura controlada (21 ° C) con un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h. </li><li> Descongelar una alícuota de criopreservados P. DS adami chabaudi con un 5% en los glóbulos rojos parasitados (pRBCs) y inyectar 200 l en la cavidad intraperitoneal de C57BL / 6 donantes ratón. </li><li> Monitorear donante parasitemia ratón cada 1 - 2 días por citometría de flujo como se describe en la Sección 3 - 4 de este protocolo. Una vez que los donantes alcanza 5-15% de parasitemia, recoger la sangre por punción cardiaca de la siguiente manera: <ol><li>Aspirar 100 l de solución de heparina (300 U / ml de heparina en solución Ringer ratón (MTR) (NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, 1 mM MgCl2, 2,2 mM CaCl 2, HEPES 20 mM, glucosa 10 mM, 30 U / ml heparina, pH 7,4, 0,22 mM de filtro esterilizado)) en una jeringa de 1 ml con una aguja de 26 G. </li><li> Anestesiar el ratón por inhalación con 5% de isofluorano, confirmando la profundidad deseada de la anestesia por la ausencia de respuesta de retirada de pedal y los reflejos corneales. </li><li> Coloque el ratón sobre su lado y la aguja de inserción perpendicularmente por debajo del codo, a través de las costillas, y en el corazón. Saque émbolo de la jeringa lentamente y girar la aguja hasta 0.5 - se obtiene 1 ml de sangre. </li><li> Realizar la eutanasia por dislocación cervical bajo anestesia. </li></ol></li><li> Calcular los pRBCs por volumen de sangre del donante asumiendo un recuento de sangre de 9 x 10 6 RBC / l (es decir, si el donante estaba en 10% de parasitemia cuando sacrificado, la sangre contiene 9 x 10 5GRP / l). Diluir la sangre parasitada en solución salina Krebs (NaCl 126 mM, KCl 2,5 mM, 25 mM de NaHCO3, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1.2 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl 2, 0,2% de glucosa, pH 7,2, 0,22 mM de filtro esterilizado) tamponada de manera que la concentración es de 1 x 10 4 pRBCs por 200 l 200 l e inyectar en la cavidad intraperitoneal de ratones requeridos para el etiquetado RBC y el experimento transfusión. </li><li> Monitorear parasitemia cada 1 - 2 días por citometría de flujo como se describe en las secciones 3-4 de este protocolo. </li></ol> 2. El etiquetado de los glóbulos rojos y transfusión <ol><li> Recoger la sangre heparinizada a partir de ratones por punción cardiaca como se describe en el paso 1.3, y colocar en hielo. Mantener la sangre a 4 ° C en todo momento. Recoger aproximadamente 200 l de sangre por ratón a inyectar. Si es necesario, dividir la sangre en dos muestras y tratar una muestra lo deseas. NOTA: En este modo, la invasión de la samp tratadaLe puede ser comparado con un control, la muestra sin tratar (véase la Figura 1 para esquemática). </li><li> Preparar una solución 2x ​​de cada etiqueta RBC fluorescente. <ol><li> Se diluye una solución madre de 2 mg / ml de Atto 633-N-hidroxisuccinimida (Atto 633-NHS) en MTR modo que la concentración es 20 mg / ml. </li><li> Se diluye una solución madre de 25 mg / ml de biotina-N-hidroxisuccinimida (biotina-NHS) en MTR modo que la concentración es 250 mg / ml. </li></ol></li><li> Dividir las muestras de sangre en dos tubos y añadir un volumen igual de 2X solución Atto 633-NHS a un tubo, y un volumen igual de 2x la biotina-NHS al otro tubo. Mezclar inmediatamente. Incubar la sangre a 4 ° C durante 1 hora con mezclado lento constante, o alternativamente, la mezcla de la muestra cada 10 - 15 minutos a. </li><li> Lavar la etiqueta de sangre 3 veces con MTRC (MTR + 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA), 0,22 mM de filtro esterilizado) como sigue: <ol><li> Añadir al menos 2 volúmenes de MTRC, centrífuga a 750 g durante 5 min, separar el sobrenadante, y resuspend el sedimento en al menos 2 volúmenes de MTRC. Repite 2 veces más. </li><li> Después del lavado final, se centrifuga a 750 xg durante 5 min y combinar la sangre se sedimentaron en diferentes combinaciones (es decir, sin tratar Atto 633 / biotina tratado, sin tratamiento de biotina / tratada Atto 633). Añadir MTR para hacer hasta un volumen de 200 l por ratón a inyectar. </li></ol></li><li> Inyectar la sangre marcada por vía intravascular en ratones infectados de malaria de roedores o controles no infectados como sigue: <ol><li> Realizar transfusión en 2-15% de parasitemia en el pico de la esquizogonia parásito. NOTA: esto ocurre aproximadamente a medio camino a través de la oscuridad ciclo (es decir, entre 12 a 2 de la mañana un ciclo de luz normal, o 12-2 pm en un ciclo de luz de marcha atrás). </li><li> Ratones calientes utilizando una lámpara de calor durante 5-10 minutos para aumentar el flujo sanguíneo, pero tomar precauciones de no sobrecalentar los ratones. Coloca los ratones en un dispositivo de contención y intravascular inyectar 200 l de sangre marcada (aproximadamente 1 - 2 x 10 9 RBCs) a través de la vena de la cola. </li></ol></li><li> Recoger muestras de sangre en diferentes momentos después de la inyección, como se describe en la Sección 3. NOTA: las tasas de invasión se pueden cuantificar menos de 10 min después de la inyección, dependiendo de parasitemia del ratón receptor. </li></ol> 3. Recolección de muestras de sangre y preparación para Citometría de Flujo <ol><li> Preparar 50 l de solución de tinción por muestra, y un poco más, en el día del experimento como sigue: <ol><li> Descongelar una alícuota de 6 mM JC-1 se almacena a -20 ° C en sulfóxido de dimetilo (DMSO). </li><li> Cálido 50 l de MTRC por muestra, y un poco más, a 37 ° C. </li><li> Mientras vórtice continuamente la MTRC pre-calentado, añadir JC-1, de modo que la concentración final es 12 mM. Esto se hace para reducir la formación de JC-1 agregados; si los agregados se forman, hacer tubo no centrífuga ya que esto evitará manchas. NOTA: Una pequeña cantidad de agregación no afectará a los resultados. </li><li> Añadir anti-CD45 APC eFluor 780 y anti-CD71 PerCP eFluor 710 de manera que la concentración final es 1 mg / ml. Si se realiza el experimento RBC marcado, añadir estreptavidina PE-Cy7 modo que la concentración final es 1 mg / ml. </li></ol></li><li> Realizar el sangrado de la cola por la amputación de la extremidad de la cola o laceración del vaso sanguíneo dentro de la cola. Coloque una gota de sangre de la cola a un pequeño sopesar barco o portaobjetos. Después de la extracción de sangre, asegúrese de que el sangrado se ha detenido. Pipetear 3 l de sangre de la cola en 50 l de solución de tinción pre-calentado a 37 ° C e incubar las muestras a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Descongelar una alícuota de 4 mM Hoechst 33342 se almacena a -20 ° C en agua destilada (si se utiliza un láser de 355 nm) o 2 mM Hoechst 34580 se almacena a -20 ° C en agua destilada (si se utiliza un láser de 405 nm). Preparar 500 l por muestra, y un poco más, de una solución 4 M o 2 M de Hoechst en MTRC, respectivamente. </li><li> Añadir 500 l de 4 micras Hoechst33342 o 2 mM Hoechst 34580 a las muestras y se incuba a temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Centrifugar las células a 750 xg durante 3 min a 4 ° C, el sobrenadante de descarte, añadir 700 l MTRC y analizan por citometría de flujo. </li></ol> 4. Citometría de Flujo <ol><li> Analizar las muestras usando un láser 355/488/633 nm o 405/488/633 instrumento láser nm. </li><li> Filtrar las muestras a través de un filtro de células de 35 mM inmediatamente antes del análisis. Enjuague células colador con agua destilada entre muestras y reutilización. </li><li> Registre suficientes eventos para que la población más pequeña contiene al menos 500 eventos (generalmente 1000000 - 10000000 eventos totales por muestra). </li><li> Excite Hoechst 33342 utilizando un láser de 355 nm y detectar eventos a través de un filtro de 460/50. Excite Hoechst 34580 utilizando un láser de 405 nm y detectar eventos a través de un filtro de 460/50. Excite JC-1, anti-CD71 PerCP eFluor 710 y estreptavidina PE-Cy7 usando un láser de 488 nm y detectar eventos a través de un 530/40, 692/40, y 750LP filtro respectivaly. Excite Atto 633 y anti-CD45 de APC eFluor 780 usando un láser de 633 nm y detectar eventos a través de un filtro de 670/30 o 750LP respectivamente. </li><li> Realizar análisis y compensación mediante citometría de flujo apropiado de software de análisis de la siguiente manera: <ol><li> Seleccione células completas y excluir el ruido, los residuos y las plaquetas en base a FSC / SSC propiedades (Figura 2A). Seleccionar las células individuales sobre la base de cualquiera de ancho de pulso de disparo (Figura 2B) o utilizando el área del pico FSC a altura (Figura 2C). </li><li> Seleccione glóbulos rojos maduros, y excluir a los progenitores y los leucocitos RBC, basados ​​en fluorescencia negativa en los PerCP eFluor 710 y APC eFluor 780 canales (Figura 2D). </li><li> Si se realiza el experimento RBC marcado, seleccionar cada población de glóbulos rojos marcados basados ​​en PE-Cy7 y Atto 633 de fluorescencia y análisis de estos por separado (Figura 3A). </li><li> Seleccione pRBCs basado en fluorescencia positiva tanto para JC-1 y Hoechst ( <strong&gt; Figura 2E-H). </li></ol></li></ol> 5. Cálculos y Estadísticas <ol><li> Calcular parasitemia dividiendo el número de pRBCs por el número total de glóbulos rojos (es decir, número de eventos en Q2 puerta dividido por el número de eventos en G4 puerta). Al llevar a cabo la parasitemia ensayo de invasión de las dos poblaciones marcadas se puede calcular dividiendo el número de pRBCs marcadas por el número de glóbulos rojos marcados en esa población (es decir, el número de eventos que se encuentran en ambas puertas L1 y Q2, dividido por el número de eventos en puerta L1). NOTA: Etiquetado parasitemia varía considerablemente dependiendo de factores como la parasitemia endógeno y número de merozoitos circulantes. Por esta razón, es útil para informar de la relación de parasitemia, la cual se calcula como la parasitemia de la población marcada tratados dividido por la parasitemia de la población control con la etiqueta en cada ratón individual. Para corregir los posibles efectos de tinte, el informe de los resultados de uns una relación media de la parasitemia a través de las dos combinaciones de colorantes. </li><li> Determinar la significación estadística de los coeficientes utilizando la muestra de t-test con 1 como la media hipotética. </li></ol>

<ol>
	<li>Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+malaria+parasite-infected+blood+by+flow+cytometry.">Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry.</a> Cytometry. 4 (3), 228-237 (1983).</li><li>Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum:+rapid+quantification+of+parasitemia+in+fixed+malaria+cultures+by+flow+cytometry.">Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry.</a> Exp Parasitol. 62 (2), 275-282 (1986).</li><li>Makler, M. T., Lee, L. G., Recktenwald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazole+orange:+a+new+dye+for+Plasmodium+species+analysis.">Thiazole orange: a new dye for Plasmodium species analysis.</a> Cytometry. 8 (6), 568-570 (1987).</li><li>Heyde, H. C., Elloso, M. M., van de Waa, J., Schell, K., Weidanz, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+hydroethidine+and+flow+cytometry+to+assess+the+effects+of+leukocytes+on+the+malarial+parasite+Plasmodium+falciparum.">Use of hydroethidine and flow cytometry to assess the effects of leukocytes on the malarial parasite Plasmodium falciparum.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 2 (4), 417-425 (1995).</li><li>Pattanapanyasat, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+malaria+parasites+in+two+different+red+blood+cell+populations+using+biotin+and+flow+cytometry.">Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry.</a> Cytometry. 25 (3), 287-294 (1996).</li><li>Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Plasmodium+falciparum+growth+and+development+by+UV+flow+cytometry+using+an+optimized+Hoechst-thiazole+orange+staining+strategy.">Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy.</a> Cytometry A. 73 (6), 546-554 (2008).</li><li>Theron, M., Hesketh, R. L., Subramanian, S., Rayner, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adaptable+two-color+flow+cytometric+assay+to+quantitate+the+invasion+of+erythrocytes+by+Plasmodium+falciparum+parasites.">An adaptable two-color flow cytometric assay to quantitate the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum parasites.</a> Cytometry A. 77 (11), 1067-1074 (2010).</li><li>Bei, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometry-based+assay+for+measuring+invasion+of+red+blood+cells+by+Plasmodium+falciparum.">A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum.</a> Am J Hematol. 85 (4), 234-237 (2010).</li><li>Clark, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBC+barcoding+allows+for+the+study+of+erythrocyte+population+dynamics+and+P.+falciparum+merozoite+invasion.">RBC barcoding allows for the study of erythrocyte population dynamics and P. falciparum merozoite invasion.</a> PLoS One. 9 (7), e101041 (2014).</li><li>Malleret, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+robust+tri-color+flow+cytometry+assay+for+monitoring+malaria+parasite+development.">A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development.</a> Sci Rep. 1 (118), (2011).</li><li>Jimenez-Diaz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+Plasmodium-infected+erythrocytes+in+murine+models+of+malaria+by+flow+cytometry+using+bidimensional+assessment+of+SYTO-16+fluorescence.">Quantitative measurement of Plasmodium-infected erythrocytes in murine models of malaria by flow cytometry using bidimensional assessment of SYTO-16 fluorescence.</a> Cytometry A. 75 (3), 225-235 (2009).</li><li>Jimenez-Diaz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+detection+specificity+of+Plasmodium-infected+murine+erythrocytes+by+flow+cytometry+using+autofluorescence+and+YOYO-1.">Improvement of detection specificity of Plasmodium-infected murine erythrocytes by flow cytometry using autofluorescence and YOYO-1.</a> Cytometry A. 67 (1), 27-36 (2005).</li><li>Jun, G., Lee, J. S., Jung, Y. J., Park, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+Plasmodium+parasitemia+by+flow+cytometry+and+microscopy.">Quantitative determination of Plasmodium parasitemia by flow cytometry and microscopy.</a> J Korean Med Sci. 27 (10), 1137-1142 (2012).</li><li>Lelliott, P. M., Lampkin, S., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+assay+to+quantify+invasion+of+red+blood+cells+by+rodent+Plasmodium+parasites+in+vivo.">A flow cytometric assay to quantify invasion of red blood cells by rodent Plasmodium parasites in vivo.</a> Malar J. 13 (1), 100 (2014).</li><li>Morohashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+abnormalities+in+the+spleen+of+an+mFtz-F1+gene-disrupted+mouse.">Structural and functional abnormalities in the spleen of an mFtz-F1 gene-disrupted mouse.</a> Blood. 93 (5), 1586-1594 (1999).</li><li>Shet, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+platelet+abnormalities+in+Berkeley+sickle+cell+mice.">Morphological and functional platelet abnormalities in Berkeley sickle cell mice.</a> Blood Cells Mol Dis. 41 (1), 109-118 (2008).</li><li>Duraisingh, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+variation+of+Plasmodium+falciparum+merozoite+proteins+directs+receptor+targeting+for+invasion+of+human+erythrocytes.">Phenotypic variation of Plasmodium falciparum merozoite proteins directs receptor targeting for invasion of human erythrocytes.</a> EMBO J. 22 (5), 1047-1057 (2003).</li><li>Okoyeh, J. N., Pillai, C. R., Chitnis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+field+isolates+commonly+use+erythrocyte+invasion+pathways+that+are+independent+of+sialic+acid+residues+of+glycophorin+A.">Plasmodium falciparum field isolates commonly use erythrocyte invasion pathways that are independent of sialic acid residues of glycophorin A.</a> Infect Immun. 67 (11), 5784-5791 (1999).</li><li>Dolan, S. A., Miller, L. H., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+switching+mechanism+in+the+invasion+of+erythrocytes+by+Plasmodium+falciparum.">Evidence for a switching mechanism in the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum.</a> J Clin Invest. 86 (2), 618-624 (1990).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos descrito un método para la medición tanto de parasitemia y merozoite invasión de muestras in vivo. En términos de medición parasitemia, este método ofrece una ventaja sobre los métodos anteriores 10-13 en que HJ-glóbulos rojos pueden distinguirse de pRBCs, reduciendo así el número de eventos positivos falsos. Mientras HJ-glóbulos rojos son generalmente raros en los seres humanos, algunos estudios informan altos niveles en los ratones 15,16 hacer la distinción entre estas ...

The clinical symptoms associated with malaria occur during the Plasmodium parasite&#8217;s asexual replicative cycle within red blood cells (RBCs). Merozoites, released during the liver stage of infection, quickly attach to and invade RBCs. After gaining entry into the cell, the parasite grows and matures, eventually undergoing schizogony, splitting open the cell, and releasing a cluster of newly formed merozoites which go on to repeat this cycle. As such, an assessment of malaria infection often involves monitoring both parasitemia, which is the percentage of RBCs appropriated by one or more parasites, and the rate of merozoite invasion into uninfected RBCs. 
Flow cytometry is a powerful tool which can be used to record the properties of vast numbers of cells in a short period of time. This technique has clear applicability for the measurement of malaria parasitemia and invasion, and offers several advantages over traditional microscopy techniques. These include the accurate measurement of very low parasitemia, which would be prohibitively time consuming by microscopy, the unbiased nature of the measurement, and the ability to measure multiple cell parameters simultaneously. Flow cytometry is widely used to determine both parasitemia and merozoite invasion in in vitro culture1-9, however, techniques for measuring these parameters in vivo are less well developed, and can be complicated by the presence of additional cell types which interfere with analysis. No assays have been described for measurement of in vivo invasion, and while some assays exist for the analysis of in vivo parasitemia, these lack the ability to distinguish between parasitized RBCs (pRBCs) and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs)10-13. The later issue is particularly important as in mice HJ-RBCs may account for up to 0.9% of mature RBCs14-16, thereby preventing the accurate measurement of low parasitemia. 
We have previously demonstrated an approach for the measurement of parasitemia and merozoite invasion in a rodent model of malaria infection14. Here, we provide a more detailed protocol and accompanying video. This approach builds on previous methodologies and allows for the accurate identification of parasitized RBCs, as distinct from leukocytes, RBC progenitors, and HJ-RBCs. Additionally, this assay allows the simultaneous measurement of merozoite invasion into two labeled RBC populations, a treated, or target, population, and a control population, thereby providing a robust platform for the assessment of invasion into different cell types.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Hoechst 33342. Store a 4mM stock solution at -20 &#176;C in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 34580</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63493</td>
			<td>Store a 2mM stock solution at -20 &#176;C in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 Dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T-3168</td>
			<td>Store small aliquots of 6mM stock solution at -20 &#176;C in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-0451-80</td>
			<td>Clone 30-F11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>46-0711-80</td>
			<td>Clone R17217</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto 633 NHS ester</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1464</td>
			<td>Atto 633-NHS. Store a 2mg/ml stock solution at -20 &#176;C in DMF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21335</td>
			<td>Biotin-NHS. Store a 25mg/ml stock solution at -20 &#176;C in DMF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-4317-82</td>
			<td>Streptavidin PE-Cy7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35&#181;M filter cap tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer: BD LSRFortessa</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer: BD FACSAria II</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer: BD Influx</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assessment of rodent plasmodium parasitemia and merozoite invasion by flow cytometry

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an exponential increase in the proportion of malaria infected RBCs, known as parasitemia. We describe a flow cytometry based protocol which utilizes a combination of the DNA dye Hoechst, and the mitochondrial membrane potential dye, JC-1, to identify RBCs which contain parasites and therefore the parasitemia, of in vivo blood samples from Plasmodium chabaudi adami DS infected mice. Using this approach, in combination with fluorescently conjugated antibodies, parasitized RBCs can be distinguished from leukocytes, RBC progenitors, and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs), with a limit of detection of 0.007% parasitemia. Additionally, we outline a method for the comparative assessment of merozoite invasion into two different RBC populations. In this assay RBCs, labeled with two distinct compounds identifiable by flow cytometry, are transfused into infected mice. The relative rate of invasion into the two populations can then be assessed by flow cytometry based on the proportion of parasitized RBCs in each population over time. This combined approach allows the accurate measurement of both parasitemia and merozoite invasion in an in vivo model of malaria infection.

Medición de la parasitemia. Para la medición de la parasitemia, células de la sangre primero deben ser seleccionados, y el ruido, la suciedad y las plaquetas excluidos, basado en las propiedades del FSC / SSC (Figura 2A). Dependiendo del citómetro utilizado, las células individuales entonces deben seleccionarse en base a cada ancho de pulso de disparo (Figura 2B), o la altura del pico FSC relación de área (Figura 2C). Resto de eventos de...

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In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

Los invade parásito de la malaria y se replica dentro de las células rojas de la sangre. La evaluación precisa de la invasión merozoite y parasitemia es por lo tanto crucial para evaluar el curso de la infección por malaria. Aquí se describe un protocolo basado en citometría de flujo para la medición de estos parámetros en un modelo de ratón de la malaria.

En la Evaluación in vivo de roedores Plasmodium parasitemia y Merozoite Invasión por Citometría de Flujo

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

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JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

9.5K vistas.  Macquarie University.  Los invade parásito de la malaria y se replica dentro de las células rojas de la sangre. La evaluación precisa de la invasión merozoite y parasitemia es por lo tanto crucial para evaluar el curso de la infección por malaria. Aquí se describe un protocolo basado en citometría de flujo para la medición de estos parámetros en un modelo de ratón de la malaria. 