Esta metodología de ensayo, es un gran avance en el conocimiento de la inmunidad celular contra la malaria en etapa sanguínea, ayudando a descubrir nuevos objetivos terapéuticos y acelerar el progreso de la vacuna contra la malaria. El establecimiento de un ensayo in vitro de plasmodio que pueda utilizarse para muestras humanas o animales es valioso para comprender mejor la patogénesis de la malaria. La inmunidad protectora contra la malaria no se comprende completamente.
Para el desarrollo de nuevas terapias, es esencial explorar los mecanismos de inmunidad celular a la etapa parasitaria de la malaria. Demostrando el procedimiento seremos yo, Luna de Lacerda y Christopher Gomes, un estudiante de pregrado del laboratorio de Caroline. Para comenzar, aspire 100 microlitros de solución de heparina en una jeringa de un mililitro con una aguja de calibre 26.
Coloque el ratón de lado e inserte perpendicularmente la aguja justo debajo del codo, a través de las costillas y en el corazón. Saque el émbolo de la jeringa lentamente y gire la aguja hasta obtener de 0,5 a un mililitro de sangre. Limpie asépticamente el lado izquierdo del ratón con etanol al 70%.
Con tijeras quirúrgicas, haga un corte en el lado izquierdo del ratón, pasando a través de la piel y el peritoneo. Localice el bazo y retírela. Coloque el bazo del ratón en una placa de Petri con cinco mililitros de medio completo para purificar la población de células efectoras deseada.
Coloque un colador de células 100 micromolares sobre un tubo cónico de 50 mililitros y transfiera el bazo extirpado al filtro celular utilizando pinzas anatómicas. Triture el bazo a través del colador con un émbolo de jeringa. Lave las células a través del colador con 10 mililitros de medios completos.
Centrifugar las células a 300 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Luego, deseche el sobrenadante. Resuspender el pellet celular en dos mililitros de tampón de lisis RBC frío e incubar la suspensión durante cinco minutos en hielo.
Lave la suspensión celular con 10 mililitros de medios completos de cuatro grados centígrados y retire cualquier coágulo celular entre lavados para bazos de ratones infectados con plasmodio. Centrifugar las células a 400 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Luego, deseche el sobrenadante.
Ahora coloque una columna LS o LD en el campo magnético y prepare la columna enjuagándola con tres mililitros de tampón MACS. A continuación, aplique la suspensión de celdas sobre la columna. Después de lavar la columna tres veces con tres mililitros de tampón MACS, recoja el flujo que contiene las células esplénicas.
Cosechar 10 microlitros de las células esplénicas y añadir 10 microlitros de azul de tripano para comprobar la viabilidad celular. Agregue las células al hemocitómetro. Cuente los esplenocitos en una solución de azul de tripano y verifique la viabilidad celular.
Centrifugar todos los esplenocitos y desechar el sobrenadante. Resuspender el pellet celular en 40 microlitros de tampón MACS. Agregue 10 microlitros de un cóctel de anticuerpos de biotina a las células, mezcle bien e incube durante cinco minutos en hielo.
Después de incubar las microperlas antibiotina en hielo durante 10 minutos, coloque la columna MACS LS en el soporte del campo magnético y prepare la columna enjuagándola con tres mililitros de tampón MACS. Aplique suspensión celular sobre la columna. Lave la columna tres veces con tres mililitros de tampón MACS y recoja el flujo que contiene todas las células citotóxicas no marcadas.
Después de centrifugar la sangre recolectada a 350 veces G durante cinco minutos, deseche el suero y resuspenda la sangre en un mililitro de RPMI sin FBS. Después de colocar la columna LS en el soporte del campo magnético, enjuague con RPMI y pase la suspensión RBC a través de la columna. Una vez que las células pasan a través de la columna, centrifugar el flujo, desechar el sobrenadante y volver a aplicar un mililitro del flujo a través de la columna para aislar más iRBC.
Lave la columna dos veces con cinco mililitros de RPMI. Realice los pasos de lavado agregando alícuotas de tampón tan pronto como el depósito de columna esté vacío. Agregue cinco mililitros de RPMI, retire la columna y purgue los iRBC en un nuevo tubo de 15 mililitros.
Diluir un microlitro de una solución CFSE de 10 milimolares en un mililitro RPMI sin FBS. Después de resuspender los glóbulos rojos en 500 mililitros de RPMI sin FBS, agregue 500 mililitros del CFSE diluido e incube durante ocho minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. Lave las células tres veces con 14 mililitros de medio completo y centrifugar las células dos veces.
Para el cocultivo de linfocitos citotóxicos, coloque las células en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Agregue los linfocitos purificados y los iRBC marcados con CFSE en la relación efector/célula diana deseada hasta un volumen final de 200 mililitros y homogeneice. Preparar cada condición por triplicado e incubar las células a 37 grados centígrados.
Los iRBC se purificaron de ratones infectados con P. yoelii utilizando columnas LS. La purificación se destaca por los frotis de sangre de la sangre recolectada antes y después del enriquecimiento de la columna. La estrategia de compuerta necesaria para evaluar el porcentaje de lisis de glóbulos rojos se presenta aquí.
La puerta de parada se establece en la población de cuentas de conteo. La estrategia de compuerta se inicia seleccionando las celdas individuales, excluyendo los desechos, en función de la relación altura-área del pico de dispersión hacia adelante, seguida de la selección de la población de glóbulos rojos en Ter119 + y CD8-Luego, seleccione IBC vivos como CFSE alto positivo. Aquí está el análisis aplicado a un ejemplo experimental utilizando diferentes efectores para las proporciones objetivo, mostrando glóbulos rojos vivos después de la cocultura.
Se muestra una representación gráfica del porcentaje de lisis de RBC, calculado en base a esta fórmula. La significación entre los grupos que utilizaron CD8 citotóxico o CD8 no naïve se evaluó mediante ANOVA bidireccional con comparaciones múltiples. El método actual explora la lisis de glóbulos rojos por contacto celular directo con células asesinas, y se puede planificar para descubrir los mecanismos involucrados utilizando anticuerpos bloqueadores a receptores o moléculas específicas.
Este ensayo de muerte in vitro presenta una estrategia novedosa para aclarar los mecanismos de inmunidad mediada por células a la malaria en etapa sanguínea, lo que ayudará al progreso de nuevas terapias y vacunas contra la malaria.
