우리는 (APP605524, 490,037 및 1,047,082을 부여) 국립 보건 의학 연구위원회 (Medical Research Council)의 지원 자금을 인정 호주 연구 협의회 (DP12010061을 부여), 혁신의 부서에서 호주 국립 공동 연구 인프라 전략 및 교육 투자 기금, 산업 과학 연구. PML은 호주 대학원 상을받는 사람입니다.

모든 절차는 맥쿼리 대학의 정책에 따라 수행과 국민 건강과 의학 연구위원회 (NHMRC) 연습 호주 코드를 본했다. 이 연구는 없음 ARA 2012/017 승인하지 맥쿼리 대학의 동물 윤리위원회에서 얻은 계약 윤리에서 수행되었다. 달리 언급하지 않는 한 모든 실험은 SJL / J 마우스에 대해 수행 하였다. 1. 마우스 및 실험 말라리아 감염 <ol><li> 12시 12분 시간의 명암주기 제어 온도 (21 ° C에서) 주택의 마우스. </li><li> 냉동 보관 P.의 나누어지는 해동 5 % 기생 적혈구 (pRBCs) 및 C57BL / 6 기증자 마우스의 복강 공동으로 200 μl를 주입와 chabaudi 다미의 DS. </li><li> 이 프로토콜의 4 - 3 항에 명시된 유동 세포 계측법 사용하여 2 일 - 매 1 기증자 마우스 기생충을 모니터링합니다. 기증자가 5에 도달하면 - 15 %의 기생충을 다음과 같이 심장 구멍으로 혈액을 수집 : <ol><li>대기음 헤파린 용액 (마우스 링거액 300 U가 / ㎖ 헤파린 (MTR) (154 mM의 염화나트륨, 5.6 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2.2 mM의 CaCl2를, 20 mM의 HEPES 100 ㎕, 10 mM의 글루코오스, 30 U / ㎖ 헤파린, pH가 7.4, 0.22 μm의 필터는 26 G 바늘 1 ML의 주사기로)) 멸균. </li><li> 페달 탈퇴 응답 및 각막 반사 부재에 의해 마취 원하는 깊이를 확인하는, 5 % 이소 플루오 란으로 흡입에 의한 마우스를 마취. </li><li> 갈비뼈를 통해, 단지 팔꿈치 아래에 옆으로 마우스와 수직으로 삽입 바늘을 놓고 마음에. 천천히 주사기의 플런저를 잡아 당겨 0.5까지 바늘을 회전 - 혈액 1ml를 얻을 수있다. </li><li> 마취하에 자궁 전위에 의해 인도적인 안락사를 수행합니다. </li></ol></li><li> 희생 할 때 기증자가 10 % 기생충에 있다면, 혈액이 9 × 10 (5)를 포함 즉, 9 × 10 (6) RBC / μL (의 혈액 검사를 가정 기증자 혈액의 볼륨 당 pRBCs을 계산pRBC / μL). 크렙스에 기생 혈액 희석은 (25 mM의 NaHCO3을, 1.2mm의의 NaH 2 PO 4, 1.2 mM의의 MgCl 2, 250 mM의 CaCl2를, 0.2 % 글루코스, pH가 7.2, 멸균 0.22 μM 필터 126 mM의 염화나트륨, 2.5 mM의 KCl을) 완충 염수 농도는 200 μL 당 1 × 4 pRBCs하고 RBC 라벨 및 수혈 실험에 필요한 마우스의 복강 공동으로 200 μl를 주입 있도록. </li><li> 이 프로토콜의 4 - 3 항에 기술 된 바와 같이 유동 세포 계측법 사용하여 2 일 - 매 1 기생충을 모니터링합니다. </li></ol> 적혈구 수혈 2. 라벨링 <ol><li> 1.3 단계에 설명 된대로 심장 천자에 의해 마우스의 헤파린 혈액을 수집하고 얼음에 배치합니다. 항상 4 ° C에서 혈액을 보관하십시오. 마우스 당 약 200 ㎕의 혈액을 수집하는 주입한다. 필요한 경우, 두 개의 샘플로 혈액을 분할하고 원하는대로 하나의 샘플을 취급합니다. 주 : 처리 SAMP 이러한 방식으로, 침입르가 대조군에 비해 수 미처리 샘플 (회로도도 1 참조). </li><li> 각각의 형광 RBC 라벨의 2 배 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 농도가 20 ㎍ / ㎖의 MTR되도록 아토에서 633-N 히드 록시 숙신이 미드 (NHS-아토 633)의 2 ㎎ / ㎖의 스톡 용액을 희석. </li><li> 농도가 250 ㎍ / ml 인 것을되도록 MTR 비오틴 N 히드 록시 (비오틴 NHS)의 25 ㎎ / ㎖의 스톡 용액을 희석. </li></ol></li><li> 두 튜브에 혈액 시료를 분할 한 관 및 다른 튜브 배 비오틴 NHS 동일 부피의 633 배까지 아토-NHS 용액 동량을 추가한다. 즉시 섞는다. 일정 느린 혼합 1 시간 동안 4 ° C에서 혈액을 품어, 또는 대안 적으로, 매 10 샘플을 혼합 - 15 분. </li><li> 다음 MTRC (MTR + 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA), 멸균 필터 0.22 μM)로 표지 된 혈액 3 회 반복한다 : <ol><li> 5 분 750 XG에 MTRC의 최소 2 볼륨, 원심 분리기를 추가 상층 액을 제거하고 resuspenMTRC의 2 개 이상의 볼륨에 펠렛을 거라고. 2 번 이상 반복합니다. </li><li> 5 분 750 XG에 최종 세척, 원심 분리 후 다른 조합 펠렛 혈액을 결합 (즉, 치료 아토 633 / 처리 비오틴, 치료 비오틴 / 아토 (633) 처리). 주입 마우스에 200 μL의 볼륨을 만들기 위해 MTR을 추가합니다. </li></ol></li><li> 다음과 같이 혈관 내 설치류 말라리아에 감염된 마우스 또는 감염되지 않은 컨트롤에 표시된 혈액을 주입한다 : <ol><li> 기생충 schizogony의 피크에서 15 %의 기생충 - 2에서 수혈을 수행합니다. 참고 :이 어둠 사이클을 중간 쯤에 발생합니다 (즉, 12 사이 - 후진 등 사이클 오후 2 - 보통의 빛 사이클 오전 2, 12). </li><li> 5-10 분 동안 가열 램프를 사용하여 따뜻한 생쥐 혈액 흐름을 증가 시키지만 생쥐 과열하지 않도록주의를 기울일. 금지 장치에 마우스를 놓고 혈관 내 200 μL라고 표시된 혈액을 주입 (약 1 - 2 × 10 9 RB꼬리 정맥을 통해 CS). </li></ol></li><li> 제 3 항에 기재된 바와 같이 주입 후 상이한 시점에서 혈액 샘플을 수집. 참고 : 침공 요금은받는 사람 마우스의 기생충에 따라, 주사 후보다 10 분을 정량화 할 수있다. </li></ol> 유동 세포 계측법에 대한 혈액 샘플 및 준비 3. 컬렉션 <ol><li> 다음 실험의 당일에, 염색 용액 샘플 당 플러스 여분의 50 μl를 준비한다 : <ol><li> 디메틸 설폭 사이드에서 -20 ° C (DMSO)에 저장된 6 mM의 JC-1 분취 제상. </li><li> 37 ° C에 따뜻한 50 샘플 당 MTRC의 μL, 플러스 추가. </li><li> 최종 농도가 12 μM이되도록 지속적으로 미리 예열 MTRC를 텍싱 동안, JC-1을 추가합니다. 이는 JC-1 응집체의 형성을 감소시키기 위해 수행된다; 골재 형성 경우,이 염색을 차단하므로하지 원심 분리 관을한다. 참고 : 집계 소량의 결과에 영향을 미치지 않습니다. </li><li> 안티 추가CD45 APC eFluor 780 및 항 CD71를 PerCP eFluor 710 최종 농도 1 ㎍ / ml 인 것을되도록. 표지 된 RBC 실험을 수행하면 최종 농도가 1 ㎍ / ㎖의 수 있도록, 스트렙 타비 딘 PE-Cy7을 추가합니다. </li></ol></li><li> 꼬리 내 혈관의 꼬리 또는 열상의 선단의 절단에 의해 꼬리 출혈을 수행한다. 작은 무게 보트 또는 유리 슬라이드에 꼬리 방울의 피를 놓습니다. 혈액 수집 후, 출혈이 중지되었는지 확인합니다. 염색 액의 50 μL에 꼬리 혈액의 피펫 3 μL는 37 ° C로 예열하고 20 분 동안 37 ° C에서 샘플을 품어. </li><li> (355 nm의 레이저를 사용하는 경우)를 증류수에서 -20 ° C에 보관 4mM의 훽스트 33342 또는 (405 nm의 레이저를 사용하는 경우)를 증류수에서 -20 ° C에 보관 2 mM의 훽스트 34580의 분취 제상. 각각 MTRC의 훽스트 (Hoechst)의 4 μM 또는 2 μM 용액, 샘플 당 500 μl를 준비, 플러스 추가. </li><li> 4 μM 훽스트 (Hoechst)의 500 μl를 추가33342 또는 샘플에 2 μM의 Hoechst 34580 및 실온에서 20 분 동안 배양한다. </li><li> 4 ° C에서 3 분 750 XG, 폐기 뜨는, 원심 분리기 세포는 700 μL MTRC를 추가하고 유동 세포 계측법에 의해 분석한다. </li></ol> 4. 유동 세포 계측법 <ol><li> 355/488/633 nm의 레이저 또는 405/488/633 nm의 레이저 장비를 사용하여 샘​​플을 분석 할 수 있습니다. </li><li> 분석 직전 35 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터 샘플. 샘플 및 재사용을 사이에 증류수로 셀 스트레이너를 씻어. </li><li> (- 샘플 당 10,000,000 총 이벤트 일반적으로 1,000,000) 가장 작은 인구가 최소 500 이벤트를 포함하도록 충분한 이벤트를 기록합니다. </li><li> 355 nm의 레이저를 사용 훽스트 33342 익사이트 50분의 460 및 필터를 통해 이벤트를 검출한다. 405 nm의 레이저를 사용 훽스트 34580 익사이트 50분의 460 및 필터를 통해 이벤트를 검출한다. 여기 JC-1, 항 CD71를 PerCP eFluor 710 스트렙 타비 딘 PE-Cy7는 488 nm의 레이저를 사용하여 40분의 530를 통해 이벤트를 탐지, 40분의 692, 및 750LP는 각각의 필터LY. 633 nm의 레이저를 이용하여 아토 (633) 및 항 CD45 APC eFluor 780 익사이트 각각 30분의 670 또는 750LP 필터를 통해 이벤트를 감지합니다. </li><li> 다음과 같이 분석 소프트웨어 세포 계측법 적절한 흐름을 사용하여 분석 및 보정을 수행합니다 <ol><li> 전체 셀을 선택하고 FSC / SSC 특성 (그림 2A)를 기반으로 소음, 먼지, 혈소판을 제외 할 수 있습니다. 어느 트리거 펄스 폭 (도 2b) 또는 높이의 비율 (도 2C)로 FSC 피크 면적을 사용하여 단일 세포를 기반으로 선택한다. </li><li> 성숙한 적혈구를 선택하고를 PerCP eFluor (710)와 APC eFluor 780 채널 (그림 2D)에서 음의 형광을 기반으로 적혈구 전구 세포와 백혈구를 제외합니다. </li><li> 표지 된 RBC 실험을 수행하는 경우, PE-Cy7 및 아토 633 형광을 기반으로 표시된 적혈구의 각각의 인구를 선택하고이 별도로 (그림 3A)를 분석 할 수 있습니다. </li><li> (두 JC-1과 훽스트 (Hoechst)에 대한 긍정적 인 형광 기반으로 pRBCs를 선택 <str옹&gt;도 2e-H). </li></ol></li></ol> 5. 계산 및 통계 <ol><li> 적혈구의 전체 숫자로 pRBCs의 수를 분할함으로써 기생충을 계산 (즉, 게이트 G4의 이벤트로 나눈 게이트 Q2의 이벤트의 수). 두 표지 개체군 침입 검정 기생충을 수행 할 때 (즉, 집단에서 표지 된 RBC의 숫자로 표시된 pRBCs의 개수를 나눔으로써 계산 될 수있다, 즉, 게이트들 L1 및 Q2 모두에있는 이벤트의 수, 이벤트로 나눈 게이트 L1에서). 참고 : 레이블이 기생충은 크게 내인성 기생충 및 순환 merozoites의 수 등의 요인에 따라 달라집니다. 이 때문에, 각 개별 마우스에 표시된 제어 인구의 기생충에 의해 분할 처리 표지 인구 기생충로서 계산된다 기생충 율을보고하는 것이 도움이된다. 가능한 염료 효과를 해결하려면, 보고서 결과두 염료 조합에서 평균 기생충 비율이야. </li><li> 가상의 수단으로 1 일 표본 t의 -test를 사용 비율의 통계적 유의성을 확인합니다. </li></ol>

<ol>
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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometry-based+assay+for+measuring+invasion+of+red+blood+cells+by+Plasmodium+falciparum.">A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum.</a> Am J Hematol. 85 (4), 234-237 (2010).</li><li>Clark, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBC+barcoding+allows+for+the+study+of+erythrocyte+population+dynamics+and+P.+falciparum+merozoite+invasion.">RBC barcoding allows for the study of erythrocyte population dynamics and P. falciparum merozoite invasion.</a> PLoS One. 9 (7), e101041 (2014).</li><li>Malleret, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+robust+tri-color+flow+cytometry+assay+for+monitoring+malaria+parasite+development.">A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development.</a> Sci Rep. 1 (118), (2011).</li><li>Jimenez-Diaz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+Plasmodium-infected+erythrocytes+in+murine+models+of+malaria+by+flow+cytometry+using+bidimensional+assessment+of+SYTO-16+fluorescence.">Quantitative measurement of Plasmodium-infected erythrocytes in murine models of malaria by flow cytometry using bidimensional assessment of SYTO-16 fluorescence.</a> Cytometry A. 75 (3), 225-235 (2009).</li><li>Jimenez-Diaz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+detection+specificity+of+Plasmodium-infected+murine+erythrocytes+by+flow+cytometry+using+autofluorescence+and+YOYO-1.">Improvement of detection specificity of Plasmodium-infected murine erythrocytes by flow cytometry using autofluorescence and YOYO-1.</a> Cytometry A. 67 (1), 27-36 (2005).</li><li>Jun, G., Lee, J. S., Jung, Y. J., Park, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+Plasmodium+parasitemia+by+flow+cytometry+and+microscopy.">Quantitative determination of Plasmodium parasitemia by flow cytometry and microscopy.</a> J Korean Med Sci. 27 (10), 1137-1142 (2012).</li><li>Lelliott, P. M., Lampkin, S., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+assay+to+quantify+invasion+of+red+blood+cells+by+rodent+Plasmodium+parasites+in+vivo.">A flow cytometric assay to quantify invasion of red blood cells by rodent Plasmodium parasites in vivo.</a> Malar J. 13 (1), 100 (2014).</li><li>Morohashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+abnormalities+in+the+spleen+of+an+mFtz-F1+gene-disrupted+mouse.">Structural and functional abnormalities in the spleen of an mFtz-F1 gene-disrupted mouse.</a> Blood. 93 (5), 1586-1594 (1999).</li><li>Shet, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+platelet+abnormalities+in+Berkeley+sickle+cell+mice.">Morphological and functional platelet abnormalities in Berkeley sickle cell mice.</a> Blood Cells Mol Dis. 41 (1), 109-118 (2008).</li><li>Duraisingh, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+variation+of+Plasmodium+falciparum+merozoite+proteins+directs+receptor+targeting+for+invasion+of+human+erythrocytes.">Phenotypic variation of Plasmodium falciparum merozoite proteins directs receptor targeting for invasion of human erythrocytes.</a> EMBO J. 22 (5), 1047-1057 (2003).</li><li>Okoyeh, J. N., Pillai, C. R., Chitnis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+field+isolates+commonly+use+erythrocyte+invasion+pathways+that+are+independent+of+sialic+acid+residues+of+glycophorin+A.">Plasmodium falciparum field isolates commonly use erythrocyte invasion pathways that are independent of sialic acid residues of glycophorin A.</a> Infect Immun. 67 (11), 5784-5791 (1999).</li><li>Dolan, S. A., Miller, L. H., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+switching+mechanism+in+the+invasion+of+erythrocytes+by+Plasmodium+falciparum.">Evidence for a switching mechanism in the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum.</a> J Clin Invest. 86 (2), 618-624 (1990).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

우리는 생체 시료의 양 및 기생충 merozoite 침윤 측정하는 방법을 설명 하였다. 기생충 측정의 관점에서,이 방법은 이에 위양성 이벤트의 수를 감소 pRBCs 구별 할 수있는 HJ-적혈구 10-13에서 이전의 방법보다 이점을 제공한다. HJ-적혈구는 인간의 보통 드문 반면, 일부 연구는 설치류 기생충의 정확한 측정을 위해 중요한 이러한 세포와 pRBCs의 구분을 마우스 15, 16의 높은 수준을?...

The clinical symptoms associated with malaria occur during the Plasmodium parasite&#8217;s asexual replicative cycle within red blood cells (RBCs). Merozoites, released during the liver stage of infection, quickly attach to and invade RBCs. After gaining entry into the cell, the parasite grows and matures, eventually undergoing schizogony, splitting open the cell, and releasing a cluster of newly formed merozoites which go on to repeat this cycle. As such, an assessment of malaria infection often involves monitoring both parasitemia, which is the percentage of RBCs appropriated by one or more parasites, and the rate of merozoite invasion into uninfected RBCs. 
Flow cytometry is a powerful tool which can be used to record the properties of vast numbers of cells in a short period of time. This technique has clear applicability for the measurement of malaria parasitemia and invasion, and offers several advantages over traditional microscopy techniques. These include the accurate measurement of very low parasitemia, which would be prohibitively time consuming by microscopy, the unbiased nature of the measurement, and the ability to measure multiple cell parameters simultaneously. Flow cytometry is widely used to determine both parasitemia and merozoite invasion in in vitro culture1-9, however, techniques for measuring these parameters in vivo are less well developed, and can be complicated by the presence of additional cell types which interfere with analysis. No assays have been described for measurement of in vivo invasion, and while some assays exist for the analysis of in vivo parasitemia, these lack the ability to distinguish between parasitized RBCs (pRBCs) and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs)10-13. The later issue is particularly important as in mice HJ-RBCs may account for up to 0.9% of mature RBCs14-16, thereby preventing the accurate measurement of low parasitemia. 
We have previously demonstrated an approach for the measurement of parasitemia and merozoite invasion in a rodent model of malaria infection14. Here, we provide a more detailed protocol and accompanying video. This approach builds on previous methodologies and allows for the accurate identification of parasitized RBCs, as distinct from leukocytes, RBC progenitors, and HJ-RBCs. Additionally, this assay allows the simultaneous measurement of merozoite invasion into two labeled RBC populations, a treated, or target, population, and a control population, thereby providing a robust platform for the assessment of invasion into different cell types.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Hoechst 33342. Store a 4mM stock solution at -20 &#176;C in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 34580</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63493</td>
			<td>Store a 2mM stock solution at -20 &#176;C in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 Dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T-3168</td>
			<td>Store small aliquots of 6mM stock solution at -20 &#176;C in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-0451-80</td>
			<td>Clone 30-F11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>46-0711-80</td>
			<td>Clone R17217</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto 633 NHS ester</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1464</td>
			<td>Atto 633-NHS. Store a 2mg/ml stock solution at -20 &#176;C in DMF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21335</td>
			<td>Biotin-NHS. Store a 25mg/ml stock solution at -20 &#176;C in DMF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-4317-82</td>
			<td>Streptavidin PE-Cy7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35&#181;M filter cap tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer: BD LSRFortessa</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer: BD FACSAria II</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer: BD Influx</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assessment of rodent plasmodium parasitemia and merozoite invasion by flow cytometry

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an exponential increase in the proportion of malaria infected RBCs, known as parasitemia. We describe a flow cytometry based protocol which utilizes a combination of the DNA dye Hoechst, and the mitochondrial membrane potential dye, JC-1, to identify RBCs which contain parasites and therefore the parasitemia, of in vivo blood samples from Plasmodium chabaudi adami DS infected mice. Using this approach, in combination with fluorescently conjugated antibodies, parasitized RBCs can be distinguished from leukocytes, RBC progenitors, and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs), with a limit of detection of 0.007% parasitemia. Additionally, we outline a method for the comparative assessment of merozoite invasion into two different RBC populations. In this assay RBCs, labeled with two distinct compounds identifiable by flow cytometry, are transfused into infected mice. The relative rate of invasion into the two populations can then be assessed by flow cytometry based on the proportion of parasitized RBCs in each population over time. This combined approach allows the accurate measurement of both parasitemia and merozoite invasion in an in vivo model of malaria infection.

기생충의 측정. 기생충의 측정을 위해, 혈액 세포를 먼저 선택되어야하고, 소음, 파편 및 혈소판 FSC / SSC 속성 (도 2A)에 기초하여, 배제. 사용 된 세포 계측기에 따라, 단일 세포를 면적비 (도 2c)에 대한 하나의 트리거 펄스 폭 (도 2B), 또는 FSC 피크 높이에 기초하여 선택되어야한다. 이벤트가 백혈구로 구성되어야 남은, APC eFluor 780에 대한 긍?...

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In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

적혈구 내에서 말라리아 기생충 침입하여 및 복제합니다. merozoite 침공과 기생충의 정확한 평가는 말라리아 감염의 과정을 평가에 따라서 매우 중요합니다. 여기에서 우리는 말라리아의 마우스 모델에서 이러한 매개 변수의 측정을위한 기반 프로토콜 유동 세포 계측법을 설명합니다.

유동 세포 계측법에 의해 쥐 말라리아 기생충의 생체 내 평가와 Merozoite 침공

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

9.5K 조회수.  Macquarie University.  적혈구 내에서 말라리아 기생충 침입하여 및 복제합니다. merozoite 침공과 기생충의 정확한 평가는 말라리아 감염의 과정을 평가에 따라서 매우 중요합니다. 여기에서 우리는 말라리아의 마우스 모델에서 이러한 매개 변수의 측정을위한 기반 프로토콜 유동 세포 계측법을 설명합니다. 