Nous reconnaissons le soutien financier du Conseil national de recherches Santé et paramédical (accorder APP605524, 490037 et 1047082), le Conseil australien de la recherche (subvention DP12010061), la stratégie de l&#39;infrastructure de recherche en collaboration nationale de l&#39;Australie et le fonds d&#39;investissement de l&#39;éducation du ministère de l&#39;Innovation, de l&#39;Industrie , de la science et de la recherche. La LEMP est une récipiendaire d&#39;un prix Postgraduate australien.

Toutes les procédures ont été menées en conformité avec les politiques de l&#39;Université Macquarie et conformes au Conseil national de la santé et de la recherche médicale (NHMRC) Code australien de pratique. Le travail a été effectué en vertu de l&#39;éthique de la convention n ° 2012/017 ARA approuvé et obtenu du comité d&#39;éthique animale à l&#39;Université Macquarie. Toutes les expériences ont été réalisées sur des souris SJL / J, sauf indication contraire. 1. Souris et expérimentale paludisme Infection <ol><li> Souris maison sous température contrôlée (21 ° C) avec un cycle lumière-obscurité de 12:12 h. </li><li> Décongeler une aliquote de cryoconservés P. chabaudi adami DS avec 5% (globules rouges parasités culot globulaire) et injecter 200 pi dans la cavité intrapéritonéale de C57BL / 6 donateurs souris. </li><li> Surveiller donateurs parasitémie de souris tous les 1-2 jours en utilisant la cytométrie de flux comme décrit au paragraphe 3-4 de ce protocole. Une fois que les donateurs atteint 5 à 15% de parasitémie, recueillir le sang par ponction cardiaque comme suit: <ol><li>Aspirer 100 pl de solution d&#39;héparine (300 U / ml d&#39;héparine dans une solution souris assortie (MTR) (NaCl 154 mM, KCl 5,6, 1 mM de MgCl2, 2,2 mM de CaCl2, 20 mM de HEPES, 10 mM de glucose, 30 U / ml l&#39;héparine, pH 7,4, 0,22 uM de filtre stérilisé)) dans une seringue de 1 ml avec une aiguille 26 G. </li><li> Anesthésier la souris par inhalation avec 5% isofluorane, confirmant la profondeur désirée de l&#39;anesthésie par l&#39;absence de réponse de retrait de la pédale et les réflexes de la cornée. </li><li> Placez la souris sur le côté et l&#39;aiguille d&#39;insertion perpendiculairement juste en dessous du coude, à travers les côtes, et dans le cœur. Tirez piston de la seringue lentement et tourner aiguille jusqu&#39;à 0,5 à 1 ml de sang est obtenu. </li><li> Effectuer euthanasie par dislocation cervicale sous anesthésie. </li></ol></li><li> Calculer les pRBCs par volume de sang du donneur en supposant une numération formule sanguine de 9 x 10 6 RBC / pi (par exemple, si le donneur était à 10% de parasitémie lors du sacrifice, le sang contient 9 x 10 5pRBC / ul). Diluer sang parasité dans Krebs saline (NaCl 126 mM, KCl 2,5, 25 mM NaHCO3, 1,2 mM de NaH 2 PO 4, 1,2 mM de MgCl2, 2,5 mM de CaCl2, 0,2% de glucose, pH 7,2, 0,22 filtre uM stérilisé) tamponnée de sorte que la concentration est de 1 x 10 4 pRBCs par 200 ul et 200 ul d&#39;injecter dans la cavité intraperitoneale de souris nécessaires à l&#39;étiquetage et RBC expérience de transfusion. </li><li> Surveiller parasitémie tous les 1-2 jours en utilisant la cytométrie de flux comme décrit dans les sections 3-4 de ce protocole. </li></ol> 2. L&#39;étiquetage des globules rouges et transfusion <ol><li> Prélever le sang héparine de souris par ponction cardiaque comme décrit dans l&#39;étape 1.3, et le placer sur la glace. Gardez le sang à 4 ° C en tout temps. Recueillir environ 200 ul de sang par souris à injecter. Si nécessaire, diviser en deux échantillons de sang et traiter un échantillon comme vous le souhaitez. NOTE: De cette façon, l&#39;invasion de la samp traitéle peut être comparée à un contrôle, échantillon non traité (voir la figure 1 pour le schéma). </li><li> Préparer une solution 2x de chaque étiquette de RBC fluorescent. <ol><li> Diluer un ml de solution 2 mg / stock d&#39;Atto 633-N-hydroxysuccinimide (633 Atto-NHS) MTR sorte que la concentration est de 20 ug / ml. </li><li> Diluer un ml solution à 25 mg / ml de biotine-N-hydroxysuccinimide (biotine-NHS) MTR sorte que la concentration est de 250 pg / ml. </li></ol></li><li> Diviser les échantillons de sang en deux tubes et ajouter un volume égal de solution 633 2x Atto-NHS à un tube, et un volume égal de 2x le biotine-NHS à l&#39;autre tube. Mélanger immédiatement. Incuber le sang à 4 ° C pendant 1 heure avec un mélange constant lente, ou encore, l&#39;échantillon mélanger tous les 10 à 15 min. </li><li> Laver 3 fois sang marqués avec MTRC (MTR + 0,5% albumine de sérum bovin (BSA), 0,22 uM de filtre stérilisé) comme suit: <ol><li> Ajouter au moins deux volumes de MTRC, centrifuger à 750 g pendant 5 min, retirer le surnageant, et resuspenD le culot dans au moins deux volumes de MTRC. Répétez deux fois plus. </li><li> Après le lavage final, centrifuger à 750 g pendant 5 min et de combiner le sang granulés dans des combinaisons différentes (ce est à dire, non traitée Atto 633 / biotine traités, non traités biotine / traité Atto 633). Ajouter MTR de faire jusqu&#39;à un volume de 200 ul par souris à injecter. </li></ol></li><li> Injecter du sang marqué par voie intravasculaire dans des souris infectées murins ou témoins non infectés comme suit: <ol><li> Effectuer une transfusion à 2-15% de parasitémie au sommet de parasite schizogonie. REMARQUE: cela se produit à mi-chemin à travers le cycle d&#39;obscurité (ce est à dire, entre 12 à 2 heures du matin un cycle de lumière normale, ou 12-2 h un cycle de feu de recul). </li><li> Souris chaude en utilisant une lampe chauffante pendant 5-10 minutes pour augmenter le flux sanguin, mais de prendre des précautions pour ne pas surchauffer les souris. Placez la souris dans un dispositif de retenue et injecter par voie intravasculaire 200 pi de sang marqué (environ 1-2 x 10 9 RBCs) via la veine caudale. </li></ol></li><li> Prélever des échantillons de sang à différents points de temps après l&#39;injection comme décrit dans la section 3. REMARQUE: les taux d&#39;invasion peuvent être quantifiés moins de 10 minutes après l&#39;injection, en fonction de la parasitémie de la souris receveuse. </li></ol> 3. Prélèvement des échantillons de sang et préparation pour cytométrie en flux <ol><li> Préparer 50 ul de solution de coloration par échantillon, et un peu plus, le jour de l&#39;expérience comme suit: <ol><li> Décongeler une aliquote de 6 mM de JC-1 stockée à -20 ° C dans du diméthylsulfoxyde (DMSO). </li><li> Chaud 50 pi de MTRC par échantillon, et un peu plus, à 37 ° C. </li><li> Alors que le vortex continu MTRC préchauffée, ajouter JC-1 de sorte que la concentration finale est de 12 pM. Ceci est fait pour réduire la formation de JC-1 agrégats; si agrégats ne forment, faire le tube centrifugeuse pas que cela permettra d&#39;éviter la coloration. NOTE: Une petite quantité d&#39;agrégation ne affectera pas les résultats. </li><li> Ajouter anti-CD45 APC eFluor 780 et anti-CD71 PerCP eFluor 710 de sorte que la concentration finale soit de 1 ug / ml. Si l&#39;exécution de l&#39;expérience RBC marqué, ajouter de la streptavidine PE-Cy7 de sorte que la concentration finale soit de 1 ug / ml. </li></ol></li><li> Effectuer queue saignements par l&#39;amputation de l&#39;extrémité de la queue ou de lacération du vaisseau sanguin dans la queue. Placez une goutte de sang de la queue sur un petit bateau ou peser lame de verre. Après la collecte de sang, se assurer que le saignement se est arrêté. Pipette 3 ul de sang de la queue dans 50 ul de solution de coloration pré-chauffé à 37 ° C et incuber les échantillons à 37 ° C pendant 20 min. </li><li> Décongeler une aliquote de 4 mM de Hoechst 33342 stocké à -20 ° C dans l&#39;eau distillée (si l&#39;on utilise un laser de 355 nm) ou 2 mM de Hoechst 34580 stocké à -20 ° C dans l&#39;eau distillée (si l&#39;on utilise un laser à 405 nm). Préparer 500 ul par échantillon, et un peu plus, d&#39;une solution 4 uM ou 2 M de Hoechst dans MTRC, respectivement. </li><li> Ajouter 500 ul de 4 um Hoechst33 342 2 uM ou Hoechst 34580 à échantillons et incuber à température ambiante pendant 20 min. </li><li> Centrifuger les cellules à 750 g pendant 3 min à 4 ° C, surnageant défausse, ajouter 700 ul MTRC et analysent par cytométrie de flux. </li></ol> 4. cytométrie en flux <ol><li> Analyser des échantillons en utilisant un laser 355/488/633 nm ou 405/488/633 instrument laser nm. </li><li> Filtrer les échantillons à travers un tamis cellulaire immédiatement 35 uM avant l&#39;analyse. Rincer la crépine de la cellule avec de l&#39;eau distillée entre les échantillons et réutilisation. </li><li> Enregistrer suffisamment d&#39;événements de telle sorte que la plus petite population contient au moins 500 événements (généralement 1.000.000 - 10.000.000 événements totales par échantillon). </li><li> Exciter Hoechst 33342 en utilisant un laser de 355 nm et détecter des événements par l&#39;intermédiaire d&#39;un filtre à 460/50. Exciter Hoechst 34580 en utilisant un laser de 405 nm et détecter des événements par l&#39;intermédiaire d&#39;un filtre à 460/50. Excite JC-1, anti-CD71 PerCP eFluor 710 et Streptavidin PE-Cy7 utilisant un laser de 488 nm et détecter des événements à travers un 530/40, 692/40 et 750LP filtre respectifLy. Exciter Atto 633 et anti-CD45 APC eFluor 780 en utilisant un laser de 633 nm et détecter des événements par l&#39;intermédiaire d&#39;un filtre à 670/30 ou 750LP respectivement. </li><li> Effectuer l&#39;analyse et la rémunération en utilisant la cytométrie en flux approprié logiciel d&#39;analyse comme suit: <ol><li> Sélectionnez les cellules entières et d&#39;exclure le bruit, les débris et les plaquettes basé sur FSC / Propriétés SSC (figure 2A). Sélectionner des cellules individuelles sur la base de chaque largeur d&#39;impulsion de déclenchement (figure 2B) ou en utilisant la surface du pic à FSC rapport de hauteur (figure 2C). </li><li> Sélectionnez globules rouges matures, et d&#39;exclure les progéniteurs et les leucocytes RBC, basées sur la fluorescence négative dans les PerCP eFluor 710 et APC eFluor 780 canaux (Figure 2D). </li><li> Si l&#39;exécution de l&#39;expérience RBC marqué, sélectionner chaque population de globules rouges marqués sur la base de PE-Cy7 et Atto 633 fluorescence et les analyser séparément (figure 3A). </li><li> Sélectionnez pRBCs basée sur la fluorescence positive tant pour JC-1 et Hoechst ( <strong&gt; Figure 2E-H). </li></ol></li></ol> 5. Calculs et statistiques <ol><li> Calculer la parasitémie en divisant le nombre de culot globulaire par le nombre total de globules rouges (ce est à dire, nombre d&#39;événements dans la porte Q2 divisé par le nombre d&#39;événements dans la porte G4). Lors de la réalisation de la parasitémie de dosage d&#39;invasion des deux populations marquées peut être calculé en divisant le nombre de culot globulaire marqués par le nombre de globules rouges marqués dans cette population (nombre d&#39;événements qui sont dans les deux portes L1 et Q2, divisé par le nombre d&#39;événements dans la porte L1). REMARQUE: Marqué parasitémie varie considérablement en fonction de facteurs tels que la parasitémie endogène et nombre de mérozoïtes circulation. Pour cette raison, il est utile de signaler le taux de parasitémie, qui est calculé comme la parasitémie de la population marquée traité divisé par la parasitémie de la population contrôle de souris marqué à chaque individu. Pour corriger les effets possibles de colorants, rendre compte des résultats d&#39;uns un rapport de la parasitémie moyenne dans les deux combinaisons de colorants. </li><li> Déterminer la signification statistique des ratios utilisant le t -test d&#39;un échantillon avec une comme la moyenne hypothétique. </li></ol>

<ol>
	<li>Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+malaria+parasite-infected+blood+by+flow+cytometry.">Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry.</a> Cytometry. 4 (3), 228-237 (1983).</li><li>Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum:+rapid+quantification+of+parasitemia+in+fixed+malaria+cultures+by+flow+cytometry.">Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry.</a> Exp Parasitol. 62 (2), 275-282 (1986).</li><li>Makler, M. T., Lee, L. G., Recktenwald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazole+orange:+a+new+dye+for+Plasmodium+species+analysis.">Thiazole orange: a new dye for Plasmodium species analysis.</a> Cytometry. 8 (6), 568-570 (1987).</li><li>Heyde, H. C., Elloso, M. M., van de Waa, J., Schell, K., Weidanz, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+hydroethidine+and+flow+cytometry+to+assess+the+effects+of+leukocytes+on+the+malarial+parasite+Plasmodium+falciparum.">Use of hydroethidine and flow cytometry to assess the effects of leukocytes on the malarial parasite Plasmodium falciparum.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 2 (4), 417-425 (1995).</li><li>Pattanapanyasat, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+malaria+parasites+in+two+different+red+blood+cell+populations+using+biotin+and+flow+cytometry.">Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry.</a> Cytometry. 25 (3), 287-294 (1996).</li><li>Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Plasmodium+falciparum+growth+and+development+by+UV+flow+cytometry+using+an+optimized+Hoechst-thiazole+orange+staining+strategy.">Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy.</a> Cytometry A. 73 (6), 546-554 (2008).</li><li>Theron, M., Hesketh, R. L., Subramanian, S., Rayner, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adaptable+two-color+flow+cytometric+assay+to+quantitate+the+invasion+of+erythrocytes+by+Plasmodium+falciparum+parasites.">An adaptable two-color flow cytometric assay to quantitate the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum parasites.</a> Cytometry A. 77 (11), 1067-1074 (2010).</li><li>Bei, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometry-based+assay+for+measuring+invasion+of+red+blood+cells+by+Plasmodium+falciparum.">A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum.</a> Am J Hematol. 85 (4), 234-237 (2010).</li><li>Clark, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBC+barcoding+allows+for+the+study+of+erythrocyte+population+dynamics+and+P.+falciparum+merozoite+invasion.">RBC barcoding allows for the study of erythrocyte population dynamics and P. falciparum merozoite invasion.</a> PLoS One. 9 (7), e101041 (2014).</li><li>Malleret, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+robust+tri-color+flow+cytometry+assay+for+monitoring+malaria+parasite+development.">A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development.</a> Sci Rep. 1 (118), (2011).</li><li>Jimenez-Diaz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+Plasmodium-infected+erythrocytes+in+murine+models+of+malaria+by+flow+cytometry+using+bidimensional+assessment+of+SYTO-16+fluorescence.">Quantitative measurement of Plasmodium-infected erythrocytes in murine models of malaria by flow cytometry using bidimensional assessment of SYTO-16 fluorescence.</a> Cytometry A. 75 (3), 225-235 (2009).</li><li>Jimenez-Diaz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+detection+specificity+of+Plasmodium-infected+murine+erythrocytes+by+flow+cytometry+using+autofluorescence+and+YOYO-1.">Improvement of detection specificity of Plasmodium-infected murine erythrocytes by flow cytometry using autofluorescence and YOYO-1.</a> Cytometry A. 67 (1), 27-36 (2005).</li><li>Jun, G., Lee, J. S., Jung, Y. J., Park, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+Plasmodium+parasitemia+by+flow+cytometry+and+microscopy.">Quantitative determination of Plasmodium parasitemia by flow cytometry and microscopy.</a> J Korean Med Sci. 27 (10), 1137-1142 (2012).</li><li>Lelliott, P. M., Lampkin, S., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+assay+to+quantify+invasion+of+red+blood+cells+by+rodent+Plasmodium+parasites+in+vivo.">A flow cytometric assay to quantify invasion of red blood cells by rodent Plasmodium parasites in vivo.</a> Malar J. 13 (1), 100 (2014).</li><li>Morohashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+abnormalities+in+the+spleen+of+an+mFtz-F1+gene-disrupted+mouse.">Structural and functional abnormalities in the spleen of an mFtz-F1 gene-disrupted mouse.</a> Blood. 93 (5), 1586-1594 (1999).</li><li>Shet, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+platelet+abnormalities+in+Berkeley+sickle+cell+mice.">Morphological and functional platelet abnormalities in Berkeley sickle cell mice.</a> Blood Cells Mol Dis. 41 (1), 109-118 (2008).</li><li>Duraisingh, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+variation+of+Plasmodium+falciparum+merozoite+proteins+directs+receptor+targeting+for+invasion+of+human+erythrocytes.">Phenotypic variation of Plasmodium falciparum merozoite proteins directs receptor targeting for invasion of human erythrocytes.</a> EMBO J. 22 (5), 1047-1057 (2003).</li><li>Okoyeh, J. N., Pillai, C. R., Chitnis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+field+isolates+commonly+use+erythrocyte+invasion+pathways+that+are+independent+of+sialic+acid+residues+of+glycophorin+A.">Plasmodium falciparum field isolates commonly use erythrocyte invasion pathways that are independent of sialic acid residues of glycophorin A.</a> Infect Immun. 67 (11), 5784-5791 (1999).</li><li>Dolan, S. A., Miller, L. H., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+switching+mechanism+in+the+invasion+of+erythrocytes+by+Plasmodium+falciparum.">Evidence for a switching mechanism in the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum.</a> J Clin Invest. 86 (2), 618-624 (1990).</li></ol>

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

Nous avons décrit un procédé pour la mesure à la fois de la parasitémie et mérozoïte invasion d&#39;échantillons in vivo. En termes de mesure de la parasitémie, cette méthode offre un avantage par rapport aux méthodes précédentes de 10 à 13 dans ce HJ-globules rouges peut être distinguée de pRBCs, réduisant ainsi le nombre d&#39;événements de faux positifs. Alors que HJ-globules rouges sont généralement rare chez les humains, certaines études rapportent des niveaux élevés chez...

The clinical symptoms associated with malaria occur during the Plasmodium parasite&#8217;s asexual replicative cycle within red blood cells (RBCs). Merozoites, released during the liver stage of infection, quickly attach to and invade RBCs. After gaining entry into the cell, the parasite grows and matures, eventually undergoing schizogony, splitting open the cell, and releasing a cluster of newly formed merozoites which go on to repeat this cycle. As such, an assessment of malaria infection often involves monitoring both parasitemia, which is the percentage of RBCs appropriated by one or more parasites, and the rate of merozoite invasion into uninfected RBCs. 
Flow cytometry is a powerful tool which can be used to record the properties of vast numbers of cells in a short period of time. This technique has clear applicability for the measurement of malaria parasitemia and invasion, and offers several advantages over traditional microscopy techniques. These include the accurate measurement of very low parasitemia, which would be prohibitively time consuming by microscopy, the unbiased nature of the measurement, and the ability to measure multiple cell parameters simultaneously. Flow cytometry is widely used to determine both parasitemia and merozoite invasion in in vitro culture1-9, however, techniques for measuring these parameters in vivo are less well developed, and can be complicated by the presence of additional cell types which interfere with analysis. No assays have been described for measurement of in vivo invasion, and while some assays exist for the analysis of in vivo parasitemia, these lack the ability to distinguish between parasitized RBCs (pRBCs) and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs)10-13. The later issue is particularly important as in mice HJ-RBCs may account for up to 0.9% of mature RBCs14-16, thereby preventing the accurate measurement of low parasitemia. 
We have previously demonstrated an approach for the measurement of parasitemia and merozoite invasion in a rodent model of malaria infection14. Here, we provide a more detailed protocol and accompanying video. This approach builds on previous methodologies and allows for the accurate identification of parasitized RBCs, as distinct from leukocytes, RBC progenitors, and HJ-RBCs. Additionally, this assay allows the simultaneous measurement of merozoite invasion into two labeled RBC populations, a treated, or target, population, and a control population, thereby providing a robust platform for the assessment of invasion into different cell types.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Hoechst 33342. Store a 4mM stock solution at -20 &#176;C in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 34580</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63493</td>
			<td>Store a 2mM stock solution at -20 &#176;C in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 Dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T-3168</td>
			<td>Store small aliquots of 6mM stock solution at -20 &#176;C in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-0451-80</td>
			<td>Clone 30-F11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>46-0711-80</td>
			<td>Clone R17217</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto 633 NHS ester</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1464</td>
			<td>Atto 633-NHS. Store a 2mg/ml stock solution at -20 &#176;C in DMF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21335</td>
			<td>Biotin-NHS. Store a 25mg/ml stock solution at -20 &#176;C in DMF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-4317-82</td>
			<td>Streptavidin PE-Cy7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35&#181;M filter cap tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer: BD LSRFortessa</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer: BD FACSAria II</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer: BD Influx</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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in vivo assessment of rodent plasmodium parasitemia and merozoite invasion by flow cytometry

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an exponential increase in the proportion of malaria infected RBCs, known as parasitemia. We describe a flow cytometry based protocol which utilizes a combination of the DNA dye Hoechst, and the mitochondrial membrane potential dye, JC-1, to identify RBCs which contain parasites and therefore the parasitemia, of in vivo blood samples from Plasmodium chabaudi adami DS infected mice. Using this approach, in combination with fluorescently conjugated antibodies, parasitized RBCs can be distinguished from leukocytes, RBC progenitors, and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs), with a limit of detection of 0.007% parasitemia. Additionally, we outline a method for the comparative assessment of merozoite invasion into two different RBC populations. In this assay RBCs, labeled with two distinct compounds identifiable by flow cytometry, are transfused into infected mice. The relative rate of invasion into the two populations can then be assessed by flow cytometry based on the proportion of parasitized RBCs in each population over time. This combined approach allows the accurate measurement of both parasitemia and merozoite invasion in an in vivo model of malaria infection.

Mesure de la parasitémie. Pour la mesure de la parasitémie, cellules de sang doivent d&#39;abord être sélectionnés, et le bruit, les débris et les plaquettes exclus, basée sur FSC / SSC propriétés (figure 2A). Selon le cytomètre utilisé, les cellules individuelles doivent alors être sélectionnés en fonction de chaque largeur d&#39;impulsion de déclenchement (figure 2B), ou FSC hauteur de crête à rapport de surface (figure 2C). ...

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In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

Les envahit de parasites du paludisme et répétitions dans les globules rouges. L&#39;évaluation précise de l&#39;invasion des mérozoïtes et la parasitémie est donc crucial pour évaluer l&#39;évolution de l&#39;infection du paludisme. Nous décrivons ici un protocole basé sur la cytométrie en flux pour la mesure de ces paramètres dans un modèle de souris de la malaria.

Dans l&#39;évaluation in vivo de rongeurs Plasmodium Parasitémie et Merozoite Invasion par cytométrie en flux

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

9.5K vues.  Macquarie University.  Les envahit de parasites du paludisme et répétitions dans les globules rouges. L'évaluation précise de l'invasion des mérozoïtes et la parasitémie est donc crucial pour évaluer l'évolution de l'infection du paludisme. Nous décrivons ici un protocole basé sur la cytométrie en flux pour la mesure de ces paramètres dans un modèle de souris de la malaria. 