Biz (APP605524, 490.037 ve 1.047.082 hibe) Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi destek fon yny, Avustralya Araştırma Konseyi (DP12010061 hibe), Yenilik Bölümü&#39;nden Avustralya Ulusal İşbirlikçi Araştırma Altyapısı Strateji ve Eğitim yatırım fonu, Sanayi Bilim ve Araştırma. PML Avustralya Lisansüstü ödül bir alıcı olduğunu.

Tüm işlemler Macquarie Üniversitesi politikaları doğrultusunda yürütülen ve Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) uygulama Avustralya kod uyduğu bulundu. iş yok ARA 2012/017 onaylı ve Macquarie Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi&#39;nden alınan anlaşma Etik altında yapıldı. Aksi belirtilmedikçe tüm deneyler SJL / J farelerinde gerçekleştirilmiştir. 1. Fare ve Deneysel sıtma enfeksiyonu <ol><li> 12:12 saat ışık-karanlık çevrimi ile kontrol edilen bir sıcaklıkta (21 ° C) altında Ev fareler. </li><li> Kriyoprezerve P. bir kısım çözülme % 5 parazite eritrosit (prbcS) ve C57BL / 6 donör farenin periton boşluğuna 200 ul enjekte ile chabaudi adami DS. </li><li> Bu protokolün 4 - Bölüm 3 açıklandığı gibi flow sitometri kullanılarak 2 gün - her 1 donör fare paraziteminin izleyin. Donörler 5 ulaştığında -% 15 oranında paraziteminin aşağıdaki gibi, kalp ponksiyonu ile kan toplamak: <ol><li>Aspire heparin çözeltisi ile (fare Ringer çözeltisi içinde, 300 U / ml heparin (MTR) (154 mM NaCI, 5.6 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2.2 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 100 ul 10 mM glukoz, 30 U / ml Heparin, pH 7.4, 0.22 uM filtre 26 G iğne ile bir 1 ml şırınga içine)) sterilize edilmiştir. </li><li> Pedal çekilme tepkisi ve kornea refleksleri yokluğu ile anestezi istenen derinliği teyit% 5 isofluorane ile inhalasyon yoluyla fare anestezisi. </li><li> Kaburga ile, sadece dirsek altında yan fare ve dikey uç iğne yerleştirin ve kalbine. Yavaş yavaş şırınga pistonu çekin ve 0,5 kadar iğne döndürmek - 1 ml kan elde edilir. </li><li> Anestezi altında servikal dislokasyon ile insani ötenazi yapın. </li></ol></li><li> Kurban ne zaman donör% 10 parazitemya oldu, eğer kan 9 x 10 5 içerecektir yani 9 x 10 6 RBC / ul (bir kan sayımı varsayarak donör kan hacmi başına prbcS hesaplayınpRBC / ul). Krebs parazitik kan seyreltin (25 mM NaHCO 3, 1.2 mM NaH 2 PO 4, 1.2 mM MgCl2, 2.5 mM CaCl2,% 0.2 glukoz, pH 7.2, steril 0.22 mikron filtre 126 mM NaCI, 2.5 mM KCI) tamponlu tuz konsantrasyon 200 ul başına 1 x 10 4 prbcS ve RBC etiketleme ve transfüzyon deney için gerekli olan farelerin periton boşluğuna 200 ul enjekte böylece. </li><li> Bu protokolün 4 - Bölüm 3 açıklandığı gibi flow sitometri kullanılarak 2 gün - her 1 paraziteminin izleyin. </li></ol> Eritrosit ve Transfüzyon 2. Etiketleme <ol><li> Aşama 1.3 &#39;de tarif edildiği gibi kardiyak delme ile heparinize edilmiş farelerden kan toplamak ve buz üzerine yerleştirin. Her zaman, 4 ° C&#39;de kan tutun. Fare başına yaklaşık 200 ul kan toplayın enjekte edilecek. Gerekirse iki numune içine kan bölünmüş ve arzu edilen bir örnek ele. Not: tedavi SAMP Bu şekilde, istilale bir kontrole kıyasla olabilir, işlenmemiş numune (şematik için Şekil 1). </li><li> Her floresan RBC etiketinin 2x çözeltisi hazırlayın. <ol><li> Konsantrasyon 20 ug / ml olacak şekilde MTR içinde Atto 633-N-hidroksisüksinimid (Atto 633-NHS) içindeki bir 2 mg / ml stok çözeltisi ile seyreltilir. </li><li> Konsantrasyonu 250 ug / ml olacak şekilde MTR Biotin-N-hidroksisüksinimid (Biotin-NHS), bir 25 mg / ml stok çözeltisi ile seyreltilir. </li></ol></li><li> Iki tüp içine kan örnekleri bölme ve bir boru ve başka boru 2x Biotin-NHS, eşit hacimde 2x Atto 633-NHS çözeltisi eşit hacimde ekleyin. Hemen karıştırın. Sabit yavaş bir karıştırma ile 1 saat süreyle 4 ° C&#39;de inkübe edin kan, ya da seçenek olarak, her 10 örnek karışımı - 15 dakika. </li><li> Aşağıdaki gibi MTRC (MTR +% 0.5 sığır serum albümini (BSA), steril 0.22 mikron filtre) kan etiketli 3 kez yıkayın: <ol><li> 5 dakika boyunca 750 x g&#39;de MTRC en az 2 hacim, santrifüj ekleme süpernatant kaldırmak ve resuspenMTRC en az 2 hacim pelet d. 2 kez daha tekrarlayın. </li><li> 5 dakika ve 750 xg&#39;de son yıkama, santrifüj sonrasında farklı kombinasyonlarda topak haline kan birleştirmek (yani, işlenmemiş Atto 633 / tedavi Biotin, işlenmemiş Biyotin / Atto 633 tedavi). Enjekte edilecek, fare başına 200 ul bir hacme kadar telafi etmek MTR ekleyin. </li></ol></li><li> Aşağıdaki gibi intravasküler kemirgen sıtma enfekte edilen farelerin ya da enfekte olmamış kontrollere içindeki işaretli kan enjekte: <ol><li> Parazit schizogony zirvesinde% 15 parazitemya - 2 de transfüzyonu gerçekleştirin. NOT: Bu karanlık döngüsü boyunca yaklaşık yarım meydana gelir (yani, 12 arasında - ters ışık döngüsü 14:00 - normal ışık döngüsü 02:00, veya 12). </li><li> 5-10 dakika için bir ısı lambası kullanarak Sıcak fareler, kan akışını artırmak, ancak fareler yanmamasına tedbirleri almak. Frenleyici bir cihaz fareler yerleştirin ve intravasküler 200 ul etiketli kan enjekte (yaklaşık 1-2 x 10 9 RBKuyruk damarından Cs). </li></ol></li><li> Bölüm 3&#39;te tarif edildiği gibi enjeksiyondan sonra farklı zaman noktalarında kan örnekleri toplamak. Not: istila oranları alıcı farenin parazitemi bağlı olarak, enjeksiyondan sonra en az 10 dakika boyunca ölçülebilir. </li></ol> Akış Cytometry Kan Örneklerinin ve Hazırlık 3. Koleksiyonu <ol><li> Aşağıdaki gibi deney gününde, boyama numune başına çözeltisi artı ekstra 50 ul hazırlanması: <ol><li> Dimetil sülfoksit içinde, -20 ° C (DMSO) saklanan 6 mM JC-1 bir kısım defrost. </li><li> 37 ° C sıcak bir 50 numune başına MTRC ul, artı ilave. </li><li> Nihai konsantrasyon 12 uM olacak şekilde sürekli olarak önceden ısıtılmış MTRC vorteks iken, JC-1 ekleyin. Bu JC-1 agrega oluşumunu azaltmak için yapılır; agrega formu yoksa, bu boyama önlemek gibi değil santrifüj tüp yapmak. NOT: toplama maddesinin küçük bir miktarı sonuçlarını etkilemez. </li><li> Anti EkleCD45 APC eFluor 780 ve anti-CD71 PerCP eFluor 710 nihai konsantrasyon 1 ug / ml olacak şekilde. Etiketli eritrosit Deney durumunda nihai konsantrasyon 1 ug / ml olacak şekilde streptavidin PE-Cy7 ekleyin. </li></ol></li><li> Kuyruk içindeki kan damarı kuyruk veya laserasyon ucu amputasyon ile kuyruk kanama gerçekleştirin. Küçük tartmak tekne veya cam slayt üzerine kuyruk kan bir damla yerleştirin. Kan toplama sonra, kanama durduktan emin olun. Boyama çözeltisi 50 ul halinde kuyruk kan Pipet 3 ul 37 ° C&#39;ye önceden ısıtılmış ve 20 dakika boyunca 37 ° C&#39;de numune inkübe edin. </li><li> (355 nm lazer kullanılıyorsa) damıtılmış su içinde -20 ° C&#39;de saklandı, 4 mM Hoechst 33342 ya da (405 nm lazer kullanılıyorsa) damıtılmış su içinde -20 ° C&#39;de saklandı, 2 mM Hoechst 34580 bir kısım defrost. Sırasıyla MTRC içinde Hoechst bir 4 uM ya da 2 uM çözeltisi, örnek başına 500 ul hazırlanması, ayrıca ilave. </li><li> 4 mcM Hoechst 500 ul ekleyin33342 veya numune 2 uM, Hoechst 34580 ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 750 xg, ıskarta süpernatant, Santrifüj hücreleri 700 ul MTRC ekleyin ve flow sitometri ile analiz. </li></ol> 4. Akım Sitometri <ol><li> Bir 355/488/633 nm lazer veya 405/488/633 nm lazer cihazı kullanarak örnekleri analiz edin. </li><li> Analiz hemen önce 35 mcM hücre süzgecinden Filtre örnekleri. Örnekler ve yeniden kullanım arasında damıtılmış su ile hücre süzgecinden durulayın. </li><li> (- Numune başına 10,000,000 toplam olaylar genellikle 1.000.000) küçük nüfusu en az 500 olayları içerecek şekilde yeterli olayları kaydedin. </li><li> 355 nm lazer kullanarak Hoechs 33.342 Excite ve bir 460/50 filtresi aracılığıyla olayları algılar. 405 nm lazer kullanarak Hoechs 34.580 Excite ve bir 460/50 filtresi aracılığıyla olayları algılar. Excite JC-1 anti-CD71 PerCP eFluor 710 ve Streptavidin PE-Cy7 488 nm lazer kullanarak ve 530/40 ile olayları tespit, 692/40 ve 750LP ilgili filtrely. Bir 633 nm lazer kullanarak ATTO 633 ve anti-CD45 APC eFluor 780 Excite ve sırasıyla 670/30 veya 750LP filtresi aracılığıyla olayları algılar. </li><li> Aşağıdaki gibi analiz yazılımı sitometri uygun akışını kullanarak analiz ve tazminat gerçekleştirin: <ol><li> Bütün hücreleri seçin ve FSC / SSC özellikleri (Şekil 2A) dayalı gürültü, enkaz ve trombosit dahil değildir. Her iki tetik darbe genişliği (Şekil 2B) veya yükseklik oranı (Şekil 2C) FSC pik alanı kullanılarak dayalı tek hücreleri seçin. </li><li> Olgun eritrositlerde seçin ve PerCP eFluor 710 ve APC eFluor 780 kanalları (Şekil 2B) negatif floresan dayalı RBC atalarıdır ve lökositler, dışarıda. </li><li> Etiketli RBC deneyi gerçekleştirmek ise, PE-Cy7 ve ATTO 633 floresan dayalı etiketli eritrosit her nüfusu seçin ve bu ayrı (Şekil 3A) analiz. </li><li> (Ikisi de JC-1 ve Hoechst pozitif floresan dayalı prbcS seçin <strOng&gt; Şekil 2E-H) &#39;. </li></ol></li></ol> 5. Hesaplamalar ve İstatistik <ol><li> Eritrosit toplam sayısına göre prbcS sayısına bölünmesiyle paraziteminin hesaplayın (yani, kapı G4 olayların sayısına bölünmesiyle kapı Q2 olayların sayısı). İki etiketli nüfusun işgali tahlil paraziteminin yapılırken (bu popülasyonda etiketli eritrosit sayısına göre etiketli prbcS sayısına bölünmesiyle hesaplanır, yani kapıları L1 ve Q2 hem de olan olayların sayısı, olayların sayısına bölünmesiyle kapı L1). NOT: Etiketli parazitemisi ölçüde böyle endojen parazitemya ve dolaşımdaki merozoit sayısı gibi faktörlere bağlı olarak değişir. Bu nedenle, her bir fare kontrol etiketli nüfusun parazitemi bölünmesiyle tedavi etiketli nüfusun parazitemi olarak hesaplanır parazitemi oranını rapor yararlıdır. Olası boya efektleri düzeltmek için, rapor sonuçları birİki boya kombinasyonları arasında ortalama parazitemisi oranı s. </li><li> Varsayımsal ortalama olarak 1 ile bir örnek t-testi kullanılarak oranlarının istatistiksel olarak anlamlı belirleyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+malaria+parasite-infected+blood+by+flow+cytometry.">Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry.</a> Cytometry. 4 (3), 228-237 (1983).</li><li>Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum:+rapid+quantification+of+parasitemia+in+fixed+malaria+cultures+by+flow+cytometry.">Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry.</a> Exp Parasitol. 62 (2), 275-282 (1986).</li><li>Makler, M. T., Lee, L. G., Recktenwald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazole+orange:+a+new+dye+for+Plasmodium+species+analysis.">Thiazole orange: a new dye for Plasmodium species analysis.</a> Cytometry. 8 (6), 568-570 (1987).</li><li>Heyde, H. C., Elloso, M. M., van de Waa, J., Schell, K., Weidanz, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+hydroethidine+and+flow+cytometry+to+assess+the+effects+of+leukocytes+on+the+malarial+parasite+Plasmodium+falciparum.">Use of hydroethidine and flow cytometry to assess the effects of leukocytes on the malarial parasite Plasmodium falciparum.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 2 (4), 417-425 (1995).</li><li>Pattanapanyasat, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+malaria+parasites+in+two+different+red+blood+cell+populations+using+biotin+and+flow+cytometry.">Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry.</a> Cytometry. 25 (3), 287-294 (1996).</li><li>Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Plasmodium+falciparum+growth+and+development+by+UV+flow+cytometry+using+an+optimized+Hoechst-thiazole+orange+staining+strategy.">Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy.</a> Cytometry A. 73 (6), 546-554 (2008).</li><li>Theron, M., Hesketh, R. L., Subramanian, S., Rayner, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adaptable+two-color+flow+cytometric+assay+to+quantitate+the+invasion+of+erythrocytes+by+Plasmodium+falciparum+parasites.">An adaptable two-color flow cytometric assay to quantitate the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum parasites.</a> Cytometry A. 77 (11), 1067-1074 (2010).</li><li>Bei, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometry-based+assay+for+measuring+invasion+of+red+blood+cells+by+Plasmodium+falciparum.">A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum.</a> Am J Hematol. 85 (4), 234-237 (2010).</li><li>Clark, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBC+barcoding+allows+for+the+study+of+erythrocyte+population+dynamics+and+P.+falciparum+merozoite+invasion.">RBC barcoding allows for the study of erythrocyte population dynamics and P. falciparum merozoite invasion.</a> PLoS One. 9 (7), e101041 (2014).</li><li>Malleret, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+robust+tri-color+flow+cytometry+assay+for+monitoring+malaria+parasite+development.">A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development.</a> Sci Rep. 1 (118), (2011).</li><li>Jimenez-Diaz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+Plasmodium-infected+erythrocytes+in+murine+models+of+malaria+by+flow+cytometry+using+bidimensional+assessment+of+SYTO-16+fluorescence.">Quantitative measurement of Plasmodium-infected erythrocytes in murine models of malaria by flow cytometry using bidimensional assessment of SYTO-16 fluorescence.</a> Cytometry A. 75 (3), 225-235 (2009).</li><li>Jimenez-Diaz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+detection+specificity+of+Plasmodium-infected+murine+erythrocytes+by+flow+cytometry+using+autofluorescence+and+YOYO-1.">Improvement of detection specificity of Plasmodium-infected murine erythrocytes by flow cytometry using autofluorescence and YOYO-1.</a> Cytometry A. 67 (1), 27-36 (2005).</li><li>Jun, G., Lee, J. S., Jung, Y. J., Park, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+Plasmodium+parasitemia+by+flow+cytometry+and+microscopy.">Quantitative determination of Plasmodium parasitemia by flow cytometry and microscopy.</a> J Korean Med Sci. 27 (10), 1137-1142 (2012).</li><li>Lelliott, P. M., Lampkin, S., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+assay+to+quantify+invasion+of+red+blood+cells+by+rodent+Plasmodium+parasites+in+vivo.">A flow cytometric assay to quantify invasion of red blood cells by rodent Plasmodium parasites in vivo.</a> Malar J. 13 (1), 100 (2014).</li><li>Morohashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+abnormalities+in+the+spleen+of+an+mFtz-F1+gene-disrupted+mouse.">Structural and functional abnormalities in the spleen of an mFtz-F1 gene-disrupted mouse.</a> Blood. 93 (5), 1586-1594 (1999).</li><li>Shet, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+platelet+abnormalities+in+Berkeley+sickle+cell+mice.">Morphological and functional platelet abnormalities in Berkeley sickle cell mice.</a> Blood Cells Mol Dis. 41 (1), 109-118 (2008).</li><li>Duraisingh, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+variation+of+Plasmodium+falciparum+merozoite+proteins+directs+receptor+targeting+for+invasion+of+human+erythrocytes.">Phenotypic variation of Plasmodium falciparum merozoite proteins directs receptor targeting for invasion of human erythrocytes.</a> EMBO J. 22 (5), 1047-1057 (2003).</li><li>Okoyeh, J. N., Pillai, C. R., Chitnis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+field+isolates+commonly+use+erythrocyte+invasion+pathways+that+are+independent+of+sialic+acid+residues+of+glycophorin+A.">Plasmodium falciparum field isolates commonly use erythrocyte invasion pathways that are independent of sialic acid residues of glycophorin A.</a> Infect Immun. 67 (11), 5784-5791 (1999).</li><li>Dolan, S. A., Miller, L. H., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+switching+mechanism+in+the+invasion+of+erythrocytes+by+Plasmodium+falciparum.">Evidence for a switching mechanism in the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum.</a> J Clin Invest. 86 (2), 618-624 (1990).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu, in vivo örneklerin her ikisi de parazitemi ve Merozoit istilası ölçümü için bir yöntem tanımlanmıştır. Parazitemi ölçümü açısından, bu yöntem, ve böylece yanlış pozitif olayların sayısını azaltarak, prbcS ayırt edilebilir HJ-eritrositlerde önceki yöntemlerin 10-13 üzerinde bir avantaj sağlar. HJ-eritrosit insanlarda genellikle nadir olmakla birlikte, bazı çalışmalar kemirgen parazitemya doğru ölçümü için önemli olan bu hücreler ve prbcS arasındaki ayr?...

The clinical symptoms associated with malaria occur during the Plasmodium parasite&#8217;s asexual replicative cycle within red blood cells (RBCs). Merozoites, released during the liver stage of infection, quickly attach to and invade RBCs. After gaining entry into the cell, the parasite grows and matures, eventually undergoing schizogony, splitting open the cell, and releasing a cluster of newly formed merozoites which go on to repeat this cycle. As such, an assessment of malaria infection often involves monitoring both parasitemia, which is the percentage of RBCs appropriated by one or more parasites, and the rate of merozoite invasion into uninfected RBCs. 
Flow cytometry is a powerful tool which can be used to record the properties of vast numbers of cells in a short period of time. This technique has clear applicability for the measurement of malaria parasitemia and invasion, and offers several advantages over traditional microscopy techniques. These include the accurate measurement of very low parasitemia, which would be prohibitively time consuming by microscopy, the unbiased nature of the measurement, and the ability to measure multiple cell parameters simultaneously. Flow cytometry is widely used to determine both parasitemia and merozoite invasion in in vitro culture1-9, however, techniques for measuring these parameters in vivo are less well developed, and can be complicated by the presence of additional cell types which interfere with analysis. No assays have been described for measurement of in vivo invasion, and while some assays exist for the analysis of in vivo parasitemia, these lack the ability to distinguish between parasitized RBCs (pRBCs) and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs)10-13. The later issue is particularly important as in mice HJ-RBCs may account for up to 0.9% of mature RBCs14-16, thereby preventing the accurate measurement of low parasitemia. 
We have previously demonstrated an approach for the measurement of parasitemia and merozoite invasion in a rodent model of malaria infection14. Here, we provide a more detailed protocol and accompanying video. This approach builds on previous methodologies and allows for the accurate identification of parasitized RBCs, as distinct from leukocytes, RBC progenitors, and HJ-RBCs. Additionally, this assay allows the simultaneous measurement of merozoite invasion into two labeled RBC populations, a treated, or target, population, and a control population, thereby providing a robust platform for the assessment of invasion into different cell types.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Hoechst 33342. Store a 4mM stock solution at -20 &#176;C in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 34580</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63493</td>
			<td>Store a 2mM stock solution at -20 &#176;C in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 Dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T-3168</td>
			<td>Store small aliquots of 6mM stock solution at -20 &#176;C in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-0451-80</td>
			<td>Clone 30-F11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>46-0711-80</td>
			<td>Clone R17217</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto 633 NHS ester</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1464</td>
			<td>Atto 633-NHS. Store a 2mg/ml stock solution at -20 &#176;C in DMF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21335</td>
			<td>Biotin-NHS. Store a 25mg/ml stock solution at -20 &#176;C in DMF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-4317-82</td>
			<td>Streptavidin PE-Cy7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35&#181;M filter cap tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer: BD LSRFortessa</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer: BD FACSAria II</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer: BD Influx</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assessment of rodent plasmodium parasitemia and merozoite invasion by flow cytometry

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an exponential increase in the proportion of malaria infected RBCs, known as parasitemia. We describe a flow cytometry based protocol which utilizes a combination of the DNA dye Hoechst, and the mitochondrial membrane potential dye, JC-1, to identify RBCs which contain parasites and therefore the parasitemia, of in vivo blood samples from Plasmodium chabaudi adami DS infected mice. Using this approach, in combination with fluorescently conjugated antibodies, parasitized RBCs can be distinguished from leukocytes, RBC progenitors, and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs), with a limit of detection of 0.007% parasitemia. Additionally, we outline a method for the comparative assessment of merozoite invasion into two different RBC populations. In this assay RBCs, labeled with two distinct compounds identifiable by flow cytometry, are transfused into infected mice. The relative rate of invasion into the two populations can then be assessed by flow cytometry based on the proportion of parasitized RBCs in each population over time. This combined approach allows the accurate measurement of both parasitemia and merozoite invasion in an in vivo model of malaria infection.

Parazitemya ölçümü. Parazitemya ölçümü için kan hücreleri ilk seçilmelidir ve gürültü, enkaz ve trombositler FSC / SSC özellikleri (Şekil 2A) dayalı hariç. Kullanılan sitometresinde bağlı olarak, tek hücreler, daha sonra alan oranı (Şekil 2C) için iki pals genişliği (Şekil 2B), veya FSC pik yüksekliğine göre seçilmelidir. Etkinlik lökositlerin oluşmalıdır kalan APC eFluor 780 için pozitif boyandı, PerCP eFl...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry at JoVE.com

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

kırmızı kan hücrelerinin içinde sıtma paraziti girdiği, ve çoğaltır. Merozoit işgali ve parazitemya doğru değerlendirme sıtma enfeksiyonu seyrini değerlendirmede nedenle çok önemlidir. Burada sıtma bir fare modelinde bu parametrelerin ölçülmesi için tabanlı protokol sitometri akışı tarif eder.

Akış Cytometry tarafından Kemirgen Plasmodium parazitemi Vivo Değerlendirilmesi ve Merozoit Invasion

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

in-vivo-assessment-rodent-plasmodium-parasitemia-merozoite-invasion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

9.5K Görüntüleme.  Macquarie University.  kırmızı kan hücrelerinin içinde sıtma paraziti girdiği, ve çoğaltır. Merozoit işgali ve parazitemya doğru değerlendirme sıtma enfeksiyonu seyrini değerlendirmede nedenle çok önemlidir. Burada sıtma bir fare modelinde bu parametrelerin ölçülmesi için tabanlı protokol sitometri akışı tarif eder. 