Reconhecemos financiar o apoio do Conselho de Pesquisa Nacional de Saúde e Medicina (conceder APP605524, 490037 e 1047082), o Australian Research Council (conceder DP12010061), a Estratégia Nacional de Infra-estrutura Collaborative Research, da Austrália e do fundo de investimento de Educação do Departamento de Inovação, Indústria , Ciência e Investigação. PML é um receptor de um prêmio de Pós-Graduação da Austrália.

Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com as políticas da Universidade Macquarie e conformado com o Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica (NHMRC) Código australiano de prática. O trabalho foi realizado sob as Ética Nenhum Acordo ARA 2012/017 aprovados e obtido da Comissão de Ética Animal da Universidade de Macquarie. Todas as experiências foram realizadas em ratinhos SJL / J a menos que indicado de outra forma. 1. Ratos e Experimental Malaria Infection <ol><li> Camundongos com temperatura controlada (21 ° C) com um ciclo claro-escuro de 12:12 hr casa. </li><li> Descongelar uma aliquota de criopreservado P. chabaudi Adami DS com 5% de hemácias parasitadas (PRBCs) e injetar 200 mL na cavidade intra-peritoneal de camundongos C57BL / 6 camundongo doador. </li><li> Monitorar doador rato parasitemia a cada 1-2 dias, utilizando a citometria de fluxo, conforme descrito na Seção 3-4 do presente protocolo. Uma vez que os doadores atinge 5-15% parasitemia, coleta de sangue por punção cardíaca, como segue: <ol><li>Aspirar 100 ul de solução de heparina (300 U / ml de heparina em solução de Ringer rato (MTR) (NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, MgCl2 1 mM, 2,2 mM de CaCl2, 20 mM de HEPES, 10 mM de glucose, 30 U / ml heparina, pH 7,4, filtro de 0,22 ^ M esterilizado)) numa seringa de 1 ml com uma agulha G 26. </li><li> Anestesiar o mouse por inalação com 5% de isoflurano, confirmando a profundidade desejada da anestesia, pela ausência de resposta de retirada pedal e dos reflexos da córnea. </li><li> Coloque rato sobre o seu lado e perpendicularmente agulha de inserção, logo abaixo do cotovelo, através das costelas, e no coração. Puxe o êmbolo da seringa lenta e gire a agulha até 0,5-1 ml de sangue é obtido. </li><li> Execute eutanásia humanitária por deslocamento cervical sob anestesia. </li></ol></li><li> Calcular as concentrado de hemácias por volume de sangue do dador assumindo uma contagem de sangue de 9 x 10 6 de RBC / ul (ou seja, se o doador estava em 10% quando a parasitemia sacrificados, o sangue conterá 9 x 10 5CH / ul). Dilui-se sangue parasitadas em solução salina de Krebs (NaCl 126 mM, KCl 2,5 mM, NaHCO 3 25, 1,2 mM de NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgCl2, 2,5 mM de CaCl2, 0,2% de glucose, pH 7,2, filtro de 0,22 ^ M esterilizado) tamponada de modo que a concentração é de 1 x 10 4 concentrado de hemácias por 200 ul e 200 ul injectar na cavidade intraperitoneal de ratinhos necessárias para a marcação de RBC e experimento transfusão. </li><li> Monitorar parasitemia a cada 1-2 dias, utilizando a citometria de fluxo, conforme descrito nas secções 3-4 deste protocolo. </li></ol> 2. A marcação de hemácias e Transfusão <ol><li> Recolha de sangue heparinizado a partir de murganhos, por punção cardíaca, tal como descrito no passo 1.3, e colocar em gelo. Manter sangue a 4 ° C em todos os momentos. Colete aproximadamente 200 sangue ul por mouse para ser injetado. Se necessário, dividida em duas amostras de sangue e tratar uma amostra de como desejar. NOTA: Desta forma, a invasão do samp tratadale pode ser comparado com um controlo, uma amostra não tratada (ver Figura 1 para esquemática). </li><li> Prepara-se uma solução de cada etiqueta fluorescente RBC 2x. <ol><li> Dilui-se uma solução estoque a 2 mg / ml de Atto 633-N-hidroxisuccinimida (NHS Atto-633) em MTR, de modo que a concentração é de 20 ug / ml. </li><li> Dilui-se uma solução estoque de 25 mg / ml de biotina-N-hidroxissuccinimida (biotina-NHS) em MTR, de modo que a concentração é de 250 ug / ml. </li></ol></li><li> Dividir as amostras de sangue em dois tubos e adicionar um volume igual de 2x solução Atto 633-NHS para um tubo, e um volume igual de 2x a biotina-NHS para outro tubo. Misturar imediatamente. Incubar sangue a 4 ° C durante 1 h, com agitação lenta constante, ou, alternativamente, misturar cada amostra de 10 - 15 min. </li><li> Lavar 3 vezes sangue marcadas com MTRC (MTR + 0,5% albumina de soro bovino (BSA), filtro de 0,22 ^ M esterilizado) como se segue: <ol><li> Adicionar pelo menos dois volumes de MTRC, centrifugar a 750 xg durante 5 minutos, remover o sobrenadante, e resuspend o sedimento em, pelo menos, 2 volumes de MTRC. Repita mais duas vezes. </li><li> Após a lavagem final, centrifugar a 750 xg durante 5 min e combinar o sangue sedimentadas em diferentes combinações (ou seja, sem tratamento Atto 633 / Biotina tratada e não tratada Biotina / tratada Atto 633). Adicionar MTR para fazer até um volume de 200 mL por rato para ser injetado. </li></ol></li><li> Injetar sangue marcado intravascular em camundongos infectados roedor malária ou controles não infectados como se segue: <ol><li> Execute transfusão a 2 - 15% parasitemia no auge de parasita esquizogonia. NOTA: isto ocorre aproximadamente a meio do ciclo escuro (ou seja, entre 12-2 da manhã de um ciclo de luz normal, ou 12-2 pm em um ciclo de luz inverso). </li><li> Camundongos morna usando uma lâmpada de calor por 5-10 minutos para aumentar o fluxo sanguíneo, mas tomar precauções para não superaquecer os ratos. Coloque os ratos em um dispositivo de retenção e intravascular injetar 200 mL de sangue marcado (aproximadamente 1 - 2 x 10 9 RBCs) através da veia da cauda. </li></ol></li><li> Coletar amostras de sangue em diferentes momentos após a injeção, conforme descrito na Seção 3. NOTA: As taxas de invasão pode ser quantificada inferior a 10 minutos após a injecção, dependendo da parasitemia do rato destinatário. </li></ol> 3. Recolha de amostras de sangue e Preparação para citometria de fluxo <ol><li> Preparar 50 ml de solução de coloração por amostra, e um pouco mais, no dia da experiência como se segue: <ol><li> Descongelar uma aliquota de 6 JC-1 mM armazenado a -20 ° C em dimetil-sulfóxido (DMSO). </li><li> Quente 50 ul de MTRC por amostra, e um pouco mais, a 37 ° C. </li><li> Embora a vórtex continuamente MTRC pré-aquecido, adicionar JC-1, de modo que a concentração final é de 12 uM. Isto é feito para reduzir a formação de JC-1 agregados; se agregados que formam, fazer tubo não centrífuga, pois isso vai evitar manchas. NOTA: Uma pequena quantidade de agregação não afetará o resultado. </li><li> Adicionar anti-CD45 da APC eFluor 780 e anti-CD71 PerCP eFluor 710 de modo a que a concentração final é de 1 ug / ml. Se o experimento RBC marcado, adicionar estreptavidina PE-Cy7 de modo que a concentração final é de 1 ug / ml. </li></ol></li><li> Realizar cauda sangramento por amputação da ponta da cauda ou a laceração do vaso sanguíneo dentro da cauda. Coloque uma gota de sangue da cauda para um pequeno pesar barco ou lâmina de vidro. Após a coleta de sangue, garantir que o sangramento parou. Pipeta 3 ul de sangue da cauda em 50 ul de solução de coloração pré-aquecido a 37 ° C e incubar as amostras a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Descongelar uma aliquota de 4 mM de Hoechst 33342 armazenado a -20 ° C em água destilada (se usando um laser 355 nm) ou Hoechst 34580 2 mM armazenado a -20 ° C em água destilada (se usando um laser de 405 nm). Prepare 500 mL por amostra, além de extra, de uma solução de 4 mm ou 2 M de Hoechst em MTRC, respectivamente. </li><li> Adicionar 500 uL de 4 uM Hoechst33342 ou 2 uM Hoechst 34580 para as amostras e incuba-se à temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Centrifugar células a 750 xg durante 3 min a 4 ° C, o sobrenadante de descarte, adicionar 700 ul MTRC e analisar por citometria de fluxo. </li></ol> 4. Citometria de Fluxo <ol><li> Analisar amostras usando um laser 355/488/633 nm ou 405/488/633 instrumento a laser nm. </li><li> Amostras de filtrar através de um filtro de células 35 mM imediatamente antes da análise. Enxágüe filtro de células com água destilada entre amostras e re-uso. </li><li> Grave eventos suficientes para que a menor população contém, pelo menos, 500 eventos (geralmente 1.000.000 - 10.000.000 Eventos totais por amostra). </li><li> Excite Hoechst 33342 usando um laser de 355 nm e detectar eventos através de um filtro 460/50. Excitar a Hoechst 34580 usando um laser de 405 nm e detectar eventos através de um filtro 460/50. Excitar JC-1, anti-CD71 PerCP eFluor 710 e PE-estreptavidina Cy7 utilizando um laser de 488 nm e detectar eventos através de um 530/40, 692/40, e filtrar 750LP respectivoly. Excite Atto 633 e anti-CD45 APC eFluor 780 usando um laser de 633 nm e detectar eventos através de um filtro de 670/30 ou 750LP respectivamente. </li><li> Realizar análise e compensação usando citometria de fluxo apropriado software de análise da seguinte forma: <ol><li> Selecione as células inteiras e não incluem ruído, resíduos, e plaquetas com base em FSC / propriedades SSC (Figura 2A). Selecione células individuais com base em qualquer largura de pulso de disparo (Figura 2B) ou usando a área do pico do FSC e à altura (Figura 2C). </li><li> Escolher a eritrócitos maduros, e excluir progenitores e leucócitos de RBC, com base na fluorescência negativa nas PerCP eFluor 710 e 780 APC eFluor canais (Figura 2D). </li><li> Se a realização do experimento RBC marcado, selecione cada população de hemácias marcadas com base em PE-Cy7 e Atto 633 fluorescência e analisá-las separadamente (Figura 3A). </li><li> Selecione concentrado de hemácias com base em fluorescência positiva para ambos JC-1 e Hoechst ( <strong&gt; Figura 2E-H). </li></ol></li></ol> 5. cálculos e estatísticas <ol><li> Calcular a parasitemia por divisão do número de concentrado de hemácias pelo número total de glóbulos vermelhos (ou seja, o número de eventos em Q2 portão dividido pelo número de eventos no portão G4). Ao realizar o ensaio de invasão de parasitemia as duas populações marcados podem ser calculadas dividindo o número de concentrado de hemácias marcadas pelo número de glóbulos vermelhos marcados em que a população (isto é, o número de eventos que são tanto em portas de L1 e Q2, dividido pelo número de eventos no portão L1). NOTA: Rotulado parasitemia varia consideravelmente dependendo de fatores como a parasitemia endógeno e número de merozoites circulantes. Por esta razão, é útil para relatar a proporção de parasitemia, que é calculado como a parasitemia da população marcada tratados dividido pelo parasitemia da população de controlo marcado em cada ratinho individual. Para corrigir possíveis efeitos da tintura, relatório resulta umaé uma relação média parasitemia nas duas combinações de corantes. </li><li> Determinar a significância estatística dos índices usando o teste t uma amostra com 1 como a média hipotética. </li></ol>

<ol>
	<li>Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+malaria+parasite-infected+blood+by+flow+cytometry.">Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry.</a> Cytometry. 4 (3), 228-237 (1983).</li><li>Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum:+rapid+quantification+of+parasitemia+in+fixed+malaria+cultures+by+flow+cytometry.">Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry.</a> Exp Parasitol. 62 (2), 275-282 (1986).</li><li>Makler, M. T., Lee, L. G., Recktenwald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazole+orange:+a+new+dye+for+Plasmodium+species+analysis.">Thiazole orange: a new dye for Plasmodium species analysis.</a> Cytometry. 8 (6), 568-570 (1987).</li><li>Heyde, H. C., Elloso, M. M., van de Waa, J., Schell, K., Weidanz, W. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Plasmodium+falciparum+growth+and+development+by+UV+flow+cytometry+using+an+optimized+Hoechst-thiazole+orange+staining+strategy.">Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy.</a> Cytometry A. 73 (6), 546-554 (2008).</li><li>Theron, M., Hesketh, R. L., Subramanian, S., Rayner, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adaptable+two-color+flow+cytometric+assay+to+quantitate+the+invasion+of+erythrocytes+by+Plasmodium+falciparum+parasites.">An adaptable two-color flow cytometric assay to quantitate the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum parasites.</a> Cytometry A. 77 (11), 1067-1074 (2010).</li><li>Bei, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometry-based+assay+for+measuring+invasion+of+red+blood+cells+by+Plasmodium+falciparum.">A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum.</a> Am J Hematol. 85 (4), 234-237 (2010).</li><li>Clark, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBC+barcoding+allows+for+the+study+of+erythrocyte+population+dynamics+and+P.+falciparum+merozoite+invasion.">RBC barcoding allows for the study of erythrocyte population dynamics and P. falciparum merozoite invasion.</a> PLoS One. 9 (7), e101041 (2014).</li><li>Malleret, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+robust+tri-color+flow+cytometry+assay+for+monitoring+malaria+parasite+development.">A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development.</a> Sci Rep. 1 (118), (2011).</li><li>Jimenez-Diaz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+Plasmodium-infected+erythrocytes+in+murine+models+of+malaria+by+flow+cytometry+using+bidimensional+assessment+of+SYTO-16+fluorescence.">Quantitative measurement of Plasmodium-infected erythrocytes in murine models of malaria by flow cytometry using bidimensional assessment of SYTO-16 fluorescence.</a> Cytometry A. 75 (3), 225-235 (2009).</li><li>Jimenez-Diaz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+detection+specificity+of+Plasmodium-infected+murine+erythrocytes+by+flow+cytometry+using+autofluorescence+and+YOYO-1.">Improvement of detection specificity of Plasmodium-infected murine erythrocytes by flow cytometry using autofluorescence and YOYO-1.</a> Cytometry A. 67 (1), 27-36 (2005).</li><li>Jun, G., Lee, J. S., Jung, Y. J., Park, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+Plasmodium+parasitemia+by+flow+cytometry+and+microscopy.">Quantitative determination of Plasmodium parasitemia by flow cytometry and microscopy.</a> J Korean Med Sci. 27 (10), 1137-1142 (2012).</li><li>Lelliott, P. M., Lampkin, S., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+assay+to+quantify+invasion+of+red+blood+cells+by+rodent+Plasmodium+parasites+in+vivo.">A flow cytometric assay to quantify invasion of red blood cells by rodent Plasmodium parasites in vivo.</a> Malar J. 13 (1), 100 (2014).</li><li>Morohashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+abnormalities+in+the+spleen+of+an+mFtz-F1+gene-disrupted+mouse.">Structural and functional abnormalities in the spleen of an mFtz-F1 gene-disrupted mouse.</a> Blood. 93 (5), 1586-1594 (1999).</li><li>Shet, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+platelet+abnormalities+in+Berkeley+sickle+cell+mice.">Morphological and functional platelet abnormalities in Berkeley sickle cell mice.</a> Blood Cells Mol Dis. 41 (1), 109-118 (2008).</li><li>Duraisingh, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+variation+of+Plasmodium+falciparum+merozoite+proteins+directs+receptor+targeting+for+invasion+of+human+erythrocytes.">Phenotypic variation of Plasmodium falciparum merozoite proteins directs receptor targeting for invasion of human erythrocytes.</a> EMBO J. 22 (5), 1047-1057 (2003).</li><li>Okoyeh, J. N., Pillai, C. R., Chitnis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+field+isolates+commonly+use+erythrocyte+invasion+pathways+that+are+independent+of+sialic+acid+residues+of+glycophorin+A.">Plasmodium falciparum field isolates commonly use erythrocyte invasion pathways that are independent of sialic acid residues of glycophorin A.</a> Infect Immun. 67 (11), 5784-5791 (1999).</li><li>Dolan, S. A., Miller, L. H., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+switching+mechanism+in+the+invasion+of+erythrocytes+by+Plasmodium+falciparum.">Evidence for a switching mechanism in the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum.</a> J Clin Invest. 86 (2), 618-624 (1990).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Descrevemos um método para a medição de ambos parasitemia e merozóitos de invasão in vivo amostras. Em relação à medida da parasitemia, este método oferece uma vantagem sobre os métodos anteriores em que 10-13 HJ-GVs podem ser distinguidas a partir de concentrado de hemácias, reduzindo assim o número de eventos positivos falsos. Enquanto HJ-hemácias são geralmente rara em humanos, alguns estudos relatam altos níveis em ratos 15,16 fazendo a distinção entre essas células e...

The clinical symptoms associated with malaria occur during the Plasmodium parasite&#8217;s asexual replicative cycle within red blood cells (RBCs). Merozoites, released during the liver stage of infection, quickly attach to and invade RBCs. After gaining entry into the cell, the parasite grows and matures, eventually undergoing schizogony, splitting open the cell, and releasing a cluster of newly formed merozoites which go on to repeat this cycle. As such, an assessment of malaria infection often involves monitoring both parasitemia, which is the percentage of RBCs appropriated by one or more parasites, and the rate of merozoite invasion into uninfected RBCs. 
Flow cytometry is a powerful tool which can be used to record the properties of vast numbers of cells in a short period of time. This technique has clear applicability for the measurement of malaria parasitemia and invasion, and offers several advantages over traditional microscopy techniques. These include the accurate measurement of very low parasitemia, which would be prohibitively time consuming by microscopy, the unbiased nature of the measurement, and the ability to measure multiple cell parameters simultaneously. Flow cytometry is widely used to determine both parasitemia and merozoite invasion in in vitro culture1-9, however, techniques for measuring these parameters in vivo are less well developed, and can be complicated by the presence of additional cell types which interfere with analysis. No assays have been described for measurement of in vivo invasion, and while some assays exist for the analysis of in vivo parasitemia, these lack the ability to distinguish between parasitized RBCs (pRBCs) and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs)10-13. The later issue is particularly important as in mice HJ-RBCs may account for up to 0.9% of mature RBCs14-16, thereby preventing the accurate measurement of low parasitemia. 
We have previously demonstrated an approach for the measurement of parasitemia and merozoite invasion in a rodent model of malaria infection14. Here, we provide a more detailed protocol and accompanying video. This approach builds on previous methodologies and allows for the accurate identification of parasitized RBCs, as distinct from leukocytes, RBC progenitors, and HJ-RBCs. Additionally, this assay allows the simultaneous measurement of merozoite invasion into two labeled RBC populations, a treated, or target, population, and a control population, thereby providing a robust platform for the assessment of invasion into different cell types.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Hoechst 33342. Store a 4mM stock solution at -20 &#176;C in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 34580</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63493</td>
			<td>Store a 2mM stock solution at -20 &#176;C in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 Dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T-3168</td>
			<td>Store small aliquots of 6mM stock solution at -20 &#176;C in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-0451-80</td>
			<td>Clone 30-F11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>46-0711-80</td>
			<td>Clone R17217</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto 633 NHS ester</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1464</td>
			<td>Atto 633-NHS. Store a 2mg/ml stock solution at -20 &#176;C in DMF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21335</td>
			<td>Biotin-NHS. Store a 25mg/ml stock solution at -20 &#176;C in DMF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-4317-82</td>
			<td>Streptavidin PE-Cy7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35&#181;M filter cap tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer: BD LSRFortessa</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer: BD FACSAria II</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer: BD Influx</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assessment of rodent plasmodium parasitemia and merozoite invasion by flow cytometry

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an exponential increase in the proportion of malaria infected RBCs, known as parasitemia. We describe a flow cytometry based protocol which utilizes a combination of the DNA dye Hoechst, and the mitochondrial membrane potential dye, JC-1, to identify RBCs which contain parasites and therefore the parasitemia, of in vivo blood samples from Plasmodium chabaudi adami DS infected mice. Using this approach, in combination with fluorescently conjugated antibodies, parasitized RBCs can be distinguished from leukocytes, RBC progenitors, and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs), with a limit of detection of 0.007% parasitemia. Additionally, we outline a method for the comparative assessment of merozoite invasion into two different RBC populations. In this assay RBCs, labeled with two distinct compounds identifiable by flow cytometry, are transfused into infected mice. The relative rate of invasion into the two populations can then be assessed by flow cytometry based on the proportion of parasitized RBCs in each population over time. This combined approach allows the accurate measurement of both parasitemia and merozoite invasion in an in vivo model of malaria infection.

Medição da parasitemia. Para a medição da parasitemia, células sanguíneas devem primeiro ser seleccionado, e o ruído, detritos e plaquetas excluídos, com base no FSC / SSC propriedades (Figura 2A). Dependendo do citómetro usado, células individuais devem, então, ser seleccionado com base em qualquer largura de impulsos de disparo (Figura 2B), ou FSC altura de pico com razão de área (Figura 2C). Restante eventos deve ser composto de...

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In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

Os invade parasita da malária e repetições dentro das células vermelhas do sangue. A avaliação precisa da invasão merozoite e parasitemia é fundamental para avaliar o curso da infecção da malária. Aqui nós descrevemos um protocolo de citometria de fluxo com base para a medição desses parâmetros em um modelo de rato da malária.

A avaliação in vivo de Rodent Plasmodium parasitemia e Merozoito Invasion por citometria de fluxo

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

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Immunology and Infection

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

9.5K visualizações.  Macquarie University.  Os invade parasita da malária e repetições dentro das células vermelhas do sangue. A avaliação precisa da invasão merozoite e parasitemia é fundamental para avaliar o curso da infecção da malária. Aqui nós descrevemos um protocolo de citometria de fluxo com base para a medição desses parâmetros em um modelo de rato da malária. 