Estos métodos se pueden utilizar para caracterizar las respuestas al estrés en C.elegans y para determinar si las perturbaciones genéticas o farmacológicas afectan la activación de las vías celulares protectoras. Estos métodos permiten pruebas rápidas y de alto rendimiento de cientos de perturbaciones como la reducción genética tanto en los niveles moleculares como fisiológicos. Para asegurarse de que el ensayo se realiza correctamente, incluya controles positivos y negativos.
Sincronice animales sanos y bien alimentados a la etapa adecuada y use platos frescos para el experimento. La visualización de la micromanipulación de los gusanos con una selección puede ayudar a los nuevos usuarios a entender cómo se pueden alinear y evaluar los gusanos para su viabilidad. Demostrando los procedimientos estarán Phil Frankino, Holly Gildea y Melissa Metcalf, estudiantes graduados en nuestro laboratorio.
Utilizar animales que expresen GFP bajo el promotor de la proteína de choque térmico cuatro para la activación de la respuesta de proteína desdoplasmática desplegada de retículo, crecer animales reporteros sincronizados a 20 grados celsius hasta la etapa L4 y lavar los gusanos de la placa utilizando el medio M9 y transferirlos a un tubo. Después de recoger los gusanos por centrifugación, reemplace el M9 por 25 nanogramos por mililitro del fármaco de interés en M9 o sulfóxido de dimetil en M9 en los tubos de control de los animales. A continuación, coloque los gusanos en una plataforma giratoria durante tres a cuatro horas a 20 grados centígrados.
Al final de la incubación, centrifugar los gusanos para asentarse antes de reemplazar la solución de tratamiento con 15 mililitros de M9 solo. Después de dos lavados, transfiera a los animales a placas NGM o placas de interferencia de ARN NGM según corresponda y permita que los gusanos se recuperen durante la noche a 20 grados centígrados. Cuando los gusanos se hayan recuperado, agregue de cinco a 10 microlitros de azida sódica de 100 milimolares a una placa NGM estándar sin bacterias y coloque una placa de gusanos bajo un microscopio de disección.
Transfiera de 10 a 20 animales del plato a la mancha de azida sódica. Los animales deben tomar el movimiento poco después de aterrizar en la solución de sal. Una vez que el azida sódica se haya evaporado, alinee a los animales en la configuración de imagen deseada con los lados anterior y posterior en la misma orientación para todos los animales e inmediatamente coloque la placa de los animales bajo un microscopio estéreo.
Inicie el software de imágenes del microscopio estéreo y, en la pestaña de adquisiciones, haga clic en abrir proyectos y carpetas para abrir un nuevo proyecto. Haga clic con el botón derecho y seleccione cambiar el nombre para cambiar el nombre de la carpeta. Coloque la muestra de gusano bajo el objetivo del microscopio y utilice el ajuste Brightfield para localizar el punto focal correcto de los gusanos para minimizar el blanqueo fluorescente.
El centro de la muestra será el punto en el que la línea de huevos es claramente visible y no difusa. Establezca el tiempo de exposición para asegurarse de que los píxeles no están saturados y también para asegurarse de que la señal está por encima del límite de detección. Después de ajustar el tiempo de exposición, el zoom, el enfoque y los condensadores Brightfield a los ajustes adecuados, haga clic en el botón Capturar imagen para adquirir una imagen.
Para obtener imágenes con un microscopio compuesto de campo ancho, coloque la placa de tratamiento de control basal en la etapa del microscopio de campo ancho compuesto y utilice el panel táctil para iniciar el programa de control. Cree un nuevo álbum y nombre de archivo y coloque la placa debajo de la lente objetivo. Utilice el control de línea base y las placas de control positivas para ajustar el tiempo de exposición y la intensidad de fluorescencia de modo que la señal sea visible pero no saturada.
A continuación, guarde las imágenes FITC de Brightfield y GFP. Para cuantificar la inducción del reportero por citometría de flujo de partículas grandes, primero encienda los láseres del citometro y abra el software del citometro. Haga clic en Iniciar para encender los láseres en la ventana del software y haga clic en Ejecutar para iniciar el láser en la ventana emergente de control láser de argón.
Cuando el láser alcanza alrededor de 12 milivatios y el nivel de fuente de luz 488 sube a alrededor de 12, haga clic en hecho y compruebe los cuatro valores de presión. Si los valores son similares a los observados en la configuración original, marque la casilla de presión OK. A continuación, para asegurarse de que no haya burbujas de aire o escombros que bloqueen el flujo de vaina y la muestra a través de la celda de flujo, haga clic en limpiar varias veces.
A continuación, desactive la ordenación y la vaina para reiniciar el flujo. Para comprobar el caudal, recoja la vaina durante 60 segundos. Recoger la vaina en un tubo de 15 mililitros durante 60 segundos.
El caudal debe ser de nueve a 10 mililitros por minuto. Para ejecutar las muestras, ajuste la potencia del fotomultiplicación láser a un nivel lo suficientemente alto como para que la señal esté por encima del límite de detección, pero no por encima del límite de saturación. Realice gating de tamaño para excluir burbujas, escombros, huevos y otras partículas pequeñas no deseadas e incluir solo a los animales de interés como los adultos.
Cuando se hayan establecido los parámetros de cribado, agregue los gusanos preparados a una taza y haga clic en adquirir. Observe para asegurarse de que todo el líquido no se lleva a la máquina, ya que esto hará que el citometro de flujo tome aire y cree burbujas dentro del detector. Cuando la muestra sea baja y/o se hayan recogido suficientes animales, haga clic en stop.
Para almacenar datos cerrados basándose únicamente en las restricciones de tamaño, haga clic en configuración, almacenamiento de datos, solo cerrado y almacenar cerrado para guardar los datos. A continuación, enjuague la taza de recogida con agua desionizada y retire el lavado al vacío tres veces antes de repetir el análisis con la siguiente muestra. Para medir la sensibilidad al estrés mitocondrial y oxidativo, agregue de 50 a 75 microlitros de Paraquat en M9 a ocho a 10 pozos por condición de una placa plana inferior de 96 pozos y transfiera de ocho a 10 gusanos por condición a cada pozo de Paraquat.
Cada dos horas, toque el plato suavemente para hacer que los animales vivos golpee o se doble para permitir la puntuación del número de animales muertos por pozo. Para medir la sensibilidad a la temperatura de los animales, incubar los gusanos durante tres a cuatro días a 20 grados centígrados antes de chapar de 10 a 15 animales por placa por condición para un total de cuatro a seis placas. A continuación, coloque las placas en una incubadora de 34 o 37 grados Celsius y puntues la supervivencia del gusano cada dos horas como se acaba de demostrar.
El reportero hsp-4 tiene una mínima impresión basal en ausencia de estrés, pero exhibe una expresión robusta de la GFP cuando los animales están expuestos al estrés retículo endoplasmático usando el medicamento Tunicamicina. Estas diferencias también se pueden cuantificar utilizando un gran citometro de flujo de partículas. Además, la inducción del transgén bajo tensión de retículo endoplasmático puede ser completamente suprimida por derribo de XBP-1 a través de interferencia de ARN.
Se pueden realizar ensayos similares para medir el estrés mitocondrial, el estrés oxidativo y el estrés por calor. Las respuestas fisiológicas de animales enteros al estrés también se pueden medir utilizando varios ensayos de supervivencia. Por ejemplo, la exposición a tunicamicina se utiliza para medir la sensibilidad al estrés retículo endoplasmático.
El derribo del gen XBP-1 da como resultado un aumento significativo en la sensibilidad a la tunicamicina. Además, la exposición al agente químico Paraquat se utiliza para medir la sensibilidad al estrés oxidativo y mitocondrial. El derribo del gen DAF-2 da como resultado un aumento significativo en la resistencia a Paraquat.
La termolerancia se puede medir determinando la supervivencia de los animales a temperaturas elevadas y se puede trazar como una curva de supervivencia. Estos ensayos deben realizarse al menos cuatro a seis veces y todas las réplicas deben trazarse entre sí, ya que la termotolerancia demuestra una variabilidad increíblemente alta en comparación con otros ensayos de estrés. Al tomar imágenes de animales, es fundamental establecer los parámetros de manera que no haya una saturación excesiva o inferior de la señal y asegurarse de que se utilizan los mismos parámetros durante todo el experimento.
Los protocolos de diagnóstico por imágenes descritos aquí son susceptibles de detección a gran escala, incluidas las pantallas de ancho del genoma, y son ideales tanto para estudios exploratorios como confirmatorios que pueden ser seguidos por los ensayos fisiológicos descritos.
