This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).

El siguiente protocolo describe técnicas para la investigación de los principios de la migración celular endotelial. El cultivo apropiado de las células endoteliales vasculares requiere pre-revestimiento de frascos de cultivo celular con gelatina para asegurar la proliferación y el mantenimiento de un fenotipo endotelial. 1. Pre-recubrimiento de frascos de cultivo celular <ol><li> Disolver la gelatina en PBS 0,1 M a una concentración final de 0,1%. </li><li> Autoclave la solución con parámetros para autoclave líquido (para más detalles ver las instrucciones del autoclave específico). </li><li> Añadir un volumen suficiente de la solución de gelatina en autoclave a un matraz de cultivo celular estéril (por ejemplo, al menos 5 ml para un matraz de cultivo celular T25). </li><li> Transferencia de los matraces en una incubadora (37 ° C, 5% de CO 2 no es necesaria, pero no interfiere) durante al menos 30 min. </li><li> Retire la solución de gelatina restante. Utilice los frascos previamente recubierto posteriormente (véase el cultivo celular) o srasgó en condiciones estériles hasta su uso. </li></ol> 2. El cultivo celular de las células endoteliales primeros Nota: células madre embrionarias derivadas de células endoteliales primeros (CEE) se obtuvieron a partir de cuerpos embrioides murinos diferenciados por clasificación de células magnético activado de la fracción de células PECAM-1 positivo como se describe anteriormente 10,11. <ol><li> Cultura CEE sobre placas de cultivo celular recubiertas con gelatina en DMEM suplementado con 15% de FCS, 50 U / ml de penicilina, 50 U / ml de estreptomicina, 200 mM L-glutamina, 100 mM ß-mercaptoetanol y 1% de aminoácidos no esenciales. Manipular células en condiciones estériles. Cultivar las células con 5% de CO 2 a 37 ° C y 95% de humedad hasta sub-confluencia (máx. 80%). </li><li> En sub-confluencia, dividir las células a una proporción de 1: 5. Nota: El desprendimiento de las células endoteliales es un paso crítico. <ol><li> Recoger las células con RT accutase. Retire los medios de comunicación, enjuagar con PBS y añadir 1 ml de accutase por 25 cm <sup&gt; 2. </li><li> Incubar el matraz a temperatura ambiente durante 2-10 min hasta que las células se han desprendido. Dispersar las células y transferirlos a la aplicación deseada. Nota: Un neutralización química de la accutase no se requiere, ya que tiene lugar cuando las células sembradas se almacenan en la incubadora a 37 ° C. Sin embargo, accutase actividad también se puede disminuir mediante la adición de DMEM que contiene FCS. </li></ol></li></ol> 3. Cámara Boyden Nota: Los ensayos de cámara de Boyden se llevan a cabo mediante el uso de sistemas de inserción de tereftalato de polietileno de luz opaca con 8 micras de tamaño de poro. <ol><li> Pre-coat los insertos de filtro (que caben dentro de pocillos de cultivo celular, creando así una cámara de Boyden) mediante la adición de 500 l de 0,1% de gelatina disueltos en 0,1 M PBS durante al menos 30 min. </li><li> Si las células son de estar expuestos a productos químicos tóxicos, exponer de acuerdo con el diseño experimental específico antes de la recolección de células. Nota: Las células fueron expuestas a 12,5 g clorambucil / ml DMEMdurante 24 horas. Con respecto al diseño experimental específica, las instrucciones pueden variar. </li><li> Cosecha CEE y determinar el número de células mediante el uso de una cámara de celular contando. Nota: Los dispositivos automáticos de conteo pueden utilizarse, pero deben usarse con precaución: el recuento de células manual es más precisa y es muy recomendable. </li><li> Añadir 500 l medio de cultivo celular en el compartimiento de la cámara inferior de la cámara de Boyden. </li><li> Agregar exactamente 10 4 500 CEE en medio de cultivo celular l por elemento filtrante en el compartimiento de la cámara superior. Eliminar las burbujas. </li><li> Incubar los insertos de filtro en la incubadora durante exactamente 8 horas. </li><li> Enjuagar con PBS una vez y reemplazar el medio con 0,5 ml 4% de paraformaldehído en ambos compartimientos durante 25 min para la fijación celular. Lavar el filtro ampliamente pero por lo menos 3 veces con 0,1 M PBS. </li><li> Extirpar las membranas con un bisturí. </li><li> Monte la membrana entre dos cubreobjetos de vidrio con medio de montaje que contiene DAPI para stainin nuclearg. Preste atención a la orientación. Asegúrese de que sólo las células que han migrado hacia el lateral del compartimento inferior de la membrana se cuentan. </li><li> Recuento de células que han migrado hacia el lateral del compartimento inferior de la membrana con un microscopio de fluorescencia a una ampliación de 400X. No confunda poros de la membrana con células migraron (Figura 1A, 1B). Investigar un número razonable de réplicas biológicas (al menos 3 repeticiones biológica por condición). </li></ol> 4. Curación de Heridas Ensayo <ol><li> Dependiendo del equipo disponible, elegir con cuidado las placas de cultivo celular o placas: Cuando se utiliza la microscopía DIC, evitar la superficie de plástico placas de cultivo basados ​​o placas bien pero utilizar dispositivos basados ​​vidrio en su lugar. Nota: Si se utiliza la microscopía de contraste de fase, basada en platos de plástico también se pueden utilizar. </li><li> Cultivar CEE en un dispositivo de cultivo celular adecuado (por ejemplo, 4 cm con fondo de cristal placa de Petri adecuado para imágenes de células vivas) Hasta 80% de confluencia. Importante: no cultivar las células para completar confluencia. </li><li> Raspe las monocapas con 10 puntas de pipeta estériles l. Empuje la punta suavemente sin demasiada presión sobre la superficie del plato y moverlo en línea recta suavemente de un lado a other.Wash las células dos veces con 0,1 M PBS para eliminar las células desprendidas. </li><li> Añadir un volumen suficiente de medio a la placa de cultivo. En su caso, añadir compuestos que deben ser investigados. Nota: 1,5 ml de medio que contiene 15 ng / ml alfa se añadió ácido linolénico. </li><li> Monte la placa de cultivo con un microscopio capaz de imágenes de células vivas. Asegúrese de 5% de CO2, 37 ° C y una atmósfera húmeda. Nota: La humidificación es especialmente importante para evitar la evaporación medio. </li><li> Adquirir imágenes con lapso de tiempo de más de 24 horas a intervalos de 10 min. Plan de archivos de gran tamaño. Nota: Una resolución de 512 x 512 píxeles suele ser suficiente; Sin embargo, se recomienda el uso de imágenes de al menos 1024 x 1,024. </li><li> Mida la anchura del hueco en t = 0 horas y en t = 24 h utilizando la herramienta de longitud del software suministrado con el microscopio o el uso de software de código abierto (por ejemplo, ImageJ). Nota: En general, el software específico de adquisición y análisis de imagen es proporcionada por el fabricante. Por lo tanto, para los detalles técnicos relacionados con el uso del software, consulte el manual. </li></ol> Seguimiento 5. celular <ol><li> Dependiendo del equipo disponible, elegir con cuidado las placas de cultivo celular o placas: Cuando se utiliza la microscopía DIC, evitar la superficie de plástico placas de cultivo basados ​​o placas bien pero utilizar dispositivos basados ​​vidrio en su lugar. Nota: Si se utiliza la microscopía de contraste de fase, basada en platos de plástico también se pueden utilizar. </li><li> Semilla de 5 x 10 4 CEE en DMEM complementado en un dispositivo de cultivo celular adecuado (por ejemplo, placa de 24 pocillos múltiples) y cultivar las células con 5% de CO 2 a 37 ° C y 95% de humedad durante 1-2 días. </li><li> Cuando las células han crecido hasta un 80% De confluencia, retire los medios y la cultura de las células con los nuevos medios de comunicación en la presencia de las sustancias de ensayo respectivos (por ejemplo, 12,5 g clorambucil / ml de DMEM). Siempre incluir células de control (tratados con el disolvente, por ejemplo, etanol) a 37 ° C durante un cierto período de tiempo (24 hr, dependiendo del sistema de ensayo individual). </li><li> Montar la placa de cultivo bajo un microscopio capaz de formación de imágenes en vivo de células (37 ° C, 5% de CO 2 y 95% de humedad). Adquirir imágenes con lapso de tiempo de más de 24 horas a intervalos predefinidos. Adquirir imágenes a intervalos de 10 min. </li><li> Realizar seguimiento manual del CEE, por el uso del plugin de ImageJ MTrackJ. Elija 10 células al azar desde el campo de visión y un seguimiento de sus movimientos mediante la adición de un punto de datos por cada punto en el tiempo con el &quot;Añadir&quot; mando de MTrackJ. </li></ol> Nota: MTrackJ está disponible de forma gratuita en y ImageJ es availab [Meijering, Mtrackj &quot;http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/&quot;.]le a [Rasband, ImageJ. &quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/&quot;]. Un manual detallado sobre el plugin MTrackJ está disponible en &quot;http://www.imagescience.org&quot;. 6. Imágenes de células vivas / Evaluación de la membrana mitocondrial Potencial <ol><li> Cultivar CEE en un dispositivo de cultivo celular adecuado (por ejemplo, 4 cm de vidrio placa de Petri fondo adecuado para imágenes de células vivas) hasta una confluencia del 80%. Importante: No cultivar las células para completar confluencia. </li><li> En su caso, exponer las células a los productos químicos. Nota: Las células fueron expuestas a 12,5 mg / ml clorambucil durante 24 horas. Con respecto al diseño experimental específica, las instrucciones pueden variar. </li><li> Preparar una solución madre 10 mM de tetrametilrodamina (TMRM) en DMSO. Proteger de la luz. Nota: La solución madre se puede almacenar a -20 ° C. </li><li> Diluir la solución madre en medio de cultivo celular a una solución de trabajo con una concentración de 10 micras (1: 1000 dilución). Proteger de la luzy utilizar tan pronto como sea posible. Nota: La solución de trabajo se puede mantener a temperatura ambiente durante algún tiempo (&gt; 1 hr), sin embargo, es muy recomendable preparación de una solución de trabajo fresco. </li><li> Añadir 2 l de la solución de trabajo de 1 ml de medio (solución) de carga fresca de cultivo celular. </li><li> Cargar las células mediante la sustitución del medio de cultivo celular con la solución de carga. Incubar durante 15 minutos a 37 ° C, 5% de CO 2 y el ambiente humidificado (incubadora). Precaución: Casi todos los indicadores de fluorescencia son exportados por las células a través del tiempo de vida; por lo tanto, evitar la carga prolongada o retardada análisis. </li><li> Sin lavado, colocar el plato con un microscopio adecuado para imágenes de células vivas. Importante: los indicadores de fluorescencia son muy sensibles a la luz, por lo tanto, evitar la exposición a la luz innecesaria. </li><li> Adquirir imágenes sin cambiar los parámetros de adquisición para asegurar la comparabilidad entre las diferentes imágenes. </li></ol>

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	<li>Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis,+vasculogenesis,+and+induction+of+healing+in+chronic+wounds.">Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds.</a> Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).</li><li>Reinke, J. M., Sorg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).</li><li>Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation.+1:+Its+role+in+the+healing+of+acute+wounds.">Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds.</a> Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).</li><li>Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=endothelial+progenitor+cell+mobilization,+and+diabetic+wound+healing.">endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).</li><li>Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperbaric+oxygen+and+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cells+in+diabetic+wound+healing.">Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing.</a> Vascular. 14, 328-337 (2006).</li><li>Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+toxicology+of+sulfur+mustard-induced+cutaneous+inflammation+and+blistering.">Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering.</a> Toxicology. 263, 12-19 (2009).</li><li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+mustard+(Chlorambucil)+has+a+negative+influence+on+early+vascular+development.">Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development.</a> Toxicology. 263, 32-40 (2009).</li><li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+N-acetyl+cysteine+and+alpha-linolenic+acid+on+sulfur+mustard+caused+impairment+of+in+vitro+endothelial+tube+formation.">Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation.</a> Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).</li><li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorambucil+(nitrogen+mustard)+induced+impairment+of+early+vascular+endothelial+cell+migration+-+Effects+of+alpha-linolenic+acid+and+N-acetylcysteine.">Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine.</a> Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).</li><li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+endostatin+on+embryonic+vasculo-+and+angiogenesis.">Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis.</a> Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).</li><li>Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cell+separations.">Methods in cell separations.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+VEGF-induced+endothelial+cell+migration+by+mitochondrial+reactive+oxygen+species.">Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species.</a> American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+culture+conditions+on+endothelial+cell+growth+and+responsiveness.">Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness.</a> Tissue &amp; Cell. 30, 525-530 (1998).</li><li>Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+substrates+for+human+umbilical+vein+endothelial+cell+culture.">A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).</li><li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient:+a+practical+usage+guide.">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> BioTechniques. 50, 98-115 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La exposición dérmica a productos químicos tóxicos a menudo resulta en el trastorno de la cicatrización de heridas graves. Los mecanismos subyacentes son en gran parte desconocido. La cicatrización de heridas es un proceso complejo que consta de diferentes fases (hemostasia, inflamación, proliferación y remodelación). La migración celular está involucrado en cada fase, sin embargo, es de suma importancia para la formación del tejido de granulación. Aquí, los nuevos vasos sanguíneos se forman ya sea por an...

La migración celular es importante en muchos procesos fisiológicos y fisiopatológicos, incluyendo el desarrollo, diversas enfermedades, y curación de heridas después de una lesión de la piel. Después de una lesión de la piel, la inflamación elimina unidades de tejido de granulación y dañadas o necróticas cierre de la herida preliminar y permite la formación de una red de nuevos capilares a través de la vasculogénesis (formación de novela) o la angiogénesis (surgimiento de vesículas existentes) 1-3. Tanto vasculopatía y la angiogénesis requieren migración de las células endoteliales. La creciente red de vasos sanguíneos es esencial para el transporte de oxígeno y nutrientes a la proliferación de los queratinocitos que sufren en última instancia, la queratinización, formar un nuevo epitelio y proporcionar cierre de la herida. Deterioro de la migración de las células endoteliales es una causa subyacente de la cicatrización de heridas trastorno 4,5. Por lo tanto, los métodos para evaluar la migración de las células endoteliales primeros están obligados a explorar la pathophysiolgía de trastornos de la migración celular y para identificar nuevas estrategias para la intervención terapéutica. La exposición dérmica a los agentes alquilantes (por ejemplo, azufre y mostazas de nitrógeno) provoca la cicatrización de heridas trastorno 6. Estos compuestos se utilizan como agentes de guerra química en varios conflictos en el siglo 20 y se mantienen razón de gran preocupación debido a las reservas existentes en regiones políticamente inestables y la relativamente simple síntesis. Aunque la mostaza de azufre se sintetizó por primera vez en 1822, la patología molecular y clínica de la exposición SM no se entiende en detalle y no antídoto para la exposición SM ha sido identificado. Se han realizado varios estudios para entender y modelar problemas de cicatrización de la herida después de la exposición SM y para detectar si existen compuestos candidatos potenciales capaces de reservar ese efecto. Schmidt et al. (2009) probó el efecto de clorambucilo, un compuesto alquilante con propiedades similares a SM en mouSE modelos de cuerpo embrioide y encontrado una, a veces dramática reducción de más del 99% en la formación de vasos 7. Este efecto adverso fue más pronunciado en una etapa de desarrollo que, en condiciones fisiológicas, está dominada por la proliferación y migración de las células precursoras endoteliales vasculares. Por lo tanto, se identificaron estas células para ser particularmente sensibles a los agentes alquilantes. Steinritz et al. (2010) probó eliminadores de especies reactivas de oxígeno (ROS), en particular, N-acetilcisteína (NAC) y el ácido alfa linolénico (ALA) por su capacidad para reducir la toxicidad SM en modelos de ratón del cuerpo embrioide y, en particular, a restaurar la formación de vasos 8. Se observaron efectos protectores temporales, lo que indica que la formación excesiva de ROS era probable que contribuya a los efectos adversos de SM en la cicatrización de heridas. Estos efectos no eran permanentes y los dos compuestos candidatos pueden no ser capaz de restaurar la formación de vasos y la cicatrización de heridas en el largo plazo 8. However, esos experimentos se realizaron en un modelo 3D complejo que hizo permitir la investigación de la migración celular. Por lo tanto, posteriormente probado NAC y ALA para los efectos beneficiosos sobre la migración de células de CEE que tienen un papel clave en el proceso de formación de vasos 9. Además, hay evidencia de que se requiere la polaridad celular para la migración celular. La disfunción mitocondrial que conduce a la formación de ROS se demostró que deteriorar la polaridad celular y por lo tanto puede afectar adversamente la migración celular. Por lo tanto, se realizó imágenes de células vivas con respecto a la función mitocondrial y se examinaron los efectos de los basureros ROS. El siguiente protocolo describe los requisitos generales para el cultivo de la CEE, el ensayo de cámara de Boyden, la cicatrización de heridas ensayo incluyendo el análisis de rastreo celular y el uso de TMRM para la evaluación de la función mitocondrial en detalle. Se destacan aspectos importantes de protocolos experimentales para el cultivo CEE y la migración.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Boyden Chamber&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 &#181;m</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>#351151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 &#181;m</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>#351152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound&#160; healing assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Word Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>#FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assessment of mitochondrial potential</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#T669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>PAA, Pasching, Austria</td>
			<td># L11-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Linolenic acid</td>
			<td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td>
			<td>&#160;# L2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorambucil</td>
			<td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td>
			<td># 23125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td>
			<td># G2500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of endothelial cell migration after exposure to toxic chemicals

La exposición a sustancias químicas (incluyendo alquilantes agentes de guerra química, como mostazas de azufre y nitrógeno) causa una gran cantidad de síntomas clínicos incluyendo trastorno de cicatrización de heridas. El proceso fisiológico de la cicatrización de la herida es muy compleja. La formación de tejido de granulación es un paso clave en este proceso resulta en un cierre de la herida preliminar y proporcionar una red de nuevos vasos sanguíneos capilares - ya sea a través de la vasculogénesis (formación de novela) o la angiogénesis (crecimiento de vasos existentes). Tanto vasculopatía y la angiogénesis requieren funcional, la migración dirigida de células endoteliales. Por lo tanto, la investigación de la migración temprana de células endoteliales (CEE) es importante para comprender la fisiopatología de los trastornos inducidos química herida curativa y potencialmente identificar nuevas estrategias para la intervención terapéutica. Se evaluó la alteración de la cicatrización de la herida después de la exposición alquilantes agente y probado compuestos candidatos potenciales para el tratamiento. Se utilizó un conjunto de técnicas descritas en este protocolo. Una cámara de Boyden modificada para investigar cuantitativamente chemokinesis del CEE se describe. Además, se ilustra el uso de la cicatrización de la herida ensayo en combinación con el análisis de pista para evaluar cualitativamente la migración. Finalmente, se demuestra el uso de la TMRM colorante fluorescente para la investigación del potencial de membrana mitocondrial para identificar los mecanismos subyacentes de la migración celular perturbada. El siguiente protocolo describe las técnicas básicas que han sido adaptados para la investigación de la CEE.

La exposición dérmica a los agentes alquilantes provoca eritema, formación de ampollas y la ulceración dérmica que está asociada con un trastorno de cicatrización de la herida. La cicatrización de heridas requiere vasculogénesis y angiogénesis, que se basa en la migración de las células endoteliales. Migración cuantitativa se puede evaluar mediante el uso del ensayo de cámara de Boyden. Como se muestra en la Figura 1C de la exposición a la CEE clorambucil agente alquilante dado lugar a un...

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Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Evaluación de la migración de células endoteliales después de la exposición a sustancias químicas tóxicas

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

assessment-endothelial-cell-migration-after-exposure-to-toxic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.6K vistas.  Bundeswehr Institute of Pharmacology and Toxicology. Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

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Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell migration. However, when explants are established, these cells also move collectively, maintaining many of the features which make individual keratocytes an attractive model to study migration: rapid rates of motility, extensive actin-rich lamellae with a perpendicular actin cable, and relatively constant speed and direction of migration. In early explants, the rapid interconversion of cells migrating individually with those migrating collectively allows the study of the role of cell-cell adhesions in determining the mode of migration, and emphasizes the molecular links between the two modes of migration. Cells in later explants lose their ability to migrate rapidly and collectively as an epithelial to mesenchymal transition occurs and genes associated with wound healing and inflammation are differentially expressed. Thus, keratocyte explants can serve as an in vitro model for the reepithelialization that occurs during cutaneous wound healing and can represent a unique system to study mechanisms of collective cell migration in the context of a defined program of gene expression changes. A variety of mutant and transgenic zebrafish lines are available, which allows explants to be established from fish with different genetic backgrounds. This allows the role of different proteins within these processes to be uniquely addressed. The protocols outlined here describe an easy and effective method for establishing these explant cultures for use in a variety of assays related to collective cell migration.

Zebrafish keratocytes migrate in cell sheets from explants and provide an in vitro model for the study of the mechanisms of collective cell migration in the context of epithelial wound healing. These protocols detail an effective way to establish primary explant cultures for use in collective cell migration assays.

Pez cebra queratocitos explantes para estudiar la migración celular colectiva y reepitelización en Curación de Heridas cutáneas

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Optimización del ensayo arañazos herida para detectar cambios en Murino mesenquimales estromales migración de células después de daño por Soluble Extracto humo del cigarrillo

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing cardiovascular progenitors during development and disease. While a number of factors have been implicated in epicardium-derived cell (EPDC) mobilization, the mechanisms governing their subsequent migration and differentiation are poorly understood. Here, we present in vitro and ex vivo strategies to study EPDC motility and differentiation. First, we describe a method of obtaining primary epicardial cells by outgrowth culture from the embryonic mouse heart. We also introduce a detailed protocol to assess three-dimensional migration of labeled EPDC in an organ culture system. We provide evidence using these techniques that genetic deletion of myocardin-related transcription factors in the epicardium attenuates EPDC migration. This approach serves as a platform to evaluate candidate modifiers of EPDC biology and could be used to develop genetic or chemical screens to identify novel regulators of EPDC mobilization that might be useful for cardiac repair.

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

Consecuencia del epicardio y Ensayo de Cultivo<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Evaluación de la migración de células derivadas del epicardio

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analizando<em&gt; En Vivo</em&gt; Migración de células usando trasplantes de células y time-lapse en embriones de pez cebra

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Aislamiento de las células murinas embrionarias Hemogenic endoteliales

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Una nueva técnica de trasplante de grasa mamaria para visualizar la generación de vasos de células madre endoteliales vasculares

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including embryogenesis and development, wound healing, tumor growth and metastasis, and ocular and cardiovascular diseases. Effective in vitro models that recapitulate the biology of angiogenesis are needed to appropriately study this process and identify mechanisms of regulation that can be ultimately targeted for novel therapeutic strategies. The bead angiogenesis assay has been previously demonstrated to recapitulate the multiple stages of endothelial sprouting in vitro. However, a limitation of this assay is a lack of endothelial &#8211; mural cell interactions, which are key to the molecular and phenotypic regulation of endothelial cell function in vivo. The protocol given here presents a methodology for the incorporation of mural cells into the bead angiogenesis assay and demonstrates a tight association of endothelial cells and pericytes during sprouting in vitro. The protocol also details a methodology for effective silencing of target genes using siRNA in endothelial cells for mechanistic studies. Altogether, this protocol provides an in vitro assay that more appropriately models the diverse cell types involved in sprouting angiogenesis, and provides a more physiologically-relevant platform for therapeutic assessment and novel discovery of mechanisms of angiogenesis regulation.

This protocol presents a novel in vitro bead assay that more appropriately models the process of in vivo sprouting angiogenesis by incorporating pericytes. This modification enables the bead assay to more faithfully recapitulate the heterotypic cellular interactions between endothelial cells and mural cells that are critical for angiogenesis.

Incorporación de pericitos en un grano de célula endotelial brotación ensayo

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

Visualización de la migración celular tangencial en el Tectum óptico de Chick en desarrollo

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected tissues via a well-characterized cascade of pro-adhesive receptors which are upregulated on the leukocyte cell surface upon the inflammatory trigger. Inflammatory responses differ between individuals in the population and the genetic background can contribute to these differences. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have been shown to be a reliable source of ECs (hiPSC-ECs), thus representing an unlimited source of cells that capture the genetic identity and any genetic variants or mutations of the donor. hiPSC-ECs can therefore be used for modeling inflammatory responses in donor-specific cells. Inflammatory responses can be modeled by determining leukocyte adhesion to the hiPSC-ECs under physiological flow. This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Ensayo de microfluidos para la evaluación de la adherencia del leucocito a células endoteliales derivado de célula de vástago de Pluripotent inducidas humanas (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

En los ensayos de Vitro para evaluar la migración, invasión y proliferación de las líneas de células inmortalizadas trofoblasto humano de primer trimestre

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...