Este protocolo proporciona un nuevo método para una técnica antigua, y proporcionará un nuevo enfoque para un gran número de investigadores científicos básicos. Las principales ventajas de esta técnica son su naturaleza rentable, así como su adaptabilidad para ser utilizada por un público científico más amplio. Para preparar una placa de migración, utilice un marcador permanente de color claro para dibujar una línea hacia abajo en el centro de la parte posterior de cada pozo de una placa de 48 pozos y para dibujar tres marcas de hash para dividir cada pozo en tres áreas de interés separadas.
Luego plato 1.5 a dos veces 10 al cuarto paso de fibroblastos cardíacos en cada pozo y cultivar las células en condiciones normales de cultivo durante 24 a 48 horas hasta que alcanzan 90 a 95% confluencia. Cuando las células estén listas, retire el sobrenadante de cada pozo y utilice una punta de pipeta P200 estéril para hacer un rasguño de una pasada a lo largo de las líneas dibujadas. Enjuague los pozos con un medio sérico bajo para eliminar cualquier fibroblastos cardíacos no asociados y añadir 500 microlitros de bajo medio sérico a cada pozo.
Si se utilizan agentes farmacológicos, añada los agentes a los pozos apropiados. A continuación, utilice un microscopio invertido con un objetivo de 20x para capturar imágenes de dos horas cero por pozo utilizando las marcas para colocar cada pozo para permitir la toma de imágenes de la mitad superior de la línea rayada. A continuación, mueva la placa para colocar la mitad inferior de la línea rayada a la vista para recoger la segunda imagen y colocar la placa en la incubadora de cultivo celular durante 24 horas.
Al final de la incubación, lavar cada pocóvolo con PVS no estéril y añadir 500 microlitros de 4%paraformaldehído a cada pozo en una campana de humo. Después de 10 minutos a temperatura ambiente, lave cada pozo tres veces en PBS fresco durante cinco minutos por lavado. Después del último lavado, permeabilizar las células con 300 microlitros de solución permeabilizante por pozo y balanceo suave durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, sustituya la solución permeabilizante por una mancha azul brillante de 1%Kumasi para una incubación de 10 minutos con un suave balanceo a temperatura ambiente. Seguido de tres, cinco lavados de minutos en PBS con mecedora. Después del último lavado, agregue 300 microlitros de PBS a cada pozo y coloque cuidadosamente la placa en la misma posición que para la imagen de la hora cero antes de capturar dos imágenes de 24 horas por cada vez así como se ha demostrado.
Al final del experimento, abra las imágenes y un programa de software de análisis de imágenes adecuado y cree una nueva capa en la imagen de la hora cero. Haga doble clic para cambiar el nombre de la nueva capa de línea de capa y seleccione la herramienta de pincel. Cambie el tamaño del píxel a 10 y el color a rojo y dibuje dos líneas separadas para delinear el rasguño.
Las líneas no deben tocar ninguna celda. Abra la imagen de 24 horas en el software de imágenes y seleccione la herramienta de movimiento. Manteniendo pulsado el botón de control, haga clic en las líneas y las capas de fondo, haga clic en el centro de la imagen de la hora cero y arrastre ambas capas al centro de la imagen de 24 horas.
En la imagen de 24 horas, haga clic en la capa de fondo de la hora cero y cambie la opacidad a 50%Manteniendo el botón de control, haga clic en las capas de fondo y línea de la hora cero y haga clic en editar y transformar libremente las capas Usando la transformación libre, alinee el fondo de la hora cero y las imágenes de línea con la imagen de fondo de 24 horas para que las líneas de migración del área se coloquen correctamente en la imagen de 24 horas. Cuando la capa de línea se haya superpueste correctamente, haga clic con el botón derecho para eliminar la capa de fondo de la hora cero. La capa de línea restante se puede utilizar para determinar el número de celdas que migraron al área de rayado durante 24 horas.
A continuación, guarde la nueva imagen de migración como un archivo Photoshop y TIFF o JPEG. Para cuantificar el número de celdas migratorias, abra la imagen de migración y un programa que acepte archivos TIFF o JPEG y cuente manualmente el número de celdas ubicadas entre ellas y tocando las dos líneas rojas para ambas imágenes para cada pozo. A continuación, registre el número de celdas migratorias por imagen.
Para determinar el área de migración, abra la imagen de 24 horas que contiene las líneas de migración en el software de imágenes y guarde la imagen como imagen de área de migración. Después de guardar, haga clic en la capa de fondo y haga clic con el botón derecho para eliminar la capa. Utilice la herramienta de pincel para rellenar el área entre las líneas de rayado, con el mismo color que se utilizó para las líneas y haga clic en imagen, modo y escala de grises para cambiar la imagen a blanco y negro.
Guarde la imagen y abra la imagen del área de migración y un programa de software de análisis de imágenes adecuado. Haga clic en Editar e invertir. Para determinar el área de la línea de migración, haga clic en imagen, ajuste y umbral.
El área de migración negra se volverá roja y el área de porcentaje se indicará en el cuadro de umbral. A continuación, registre el área de porcentaje para la línea de migración y confirme que este valor está emparejado con el número de celdas de migración para la misma imagen. En este análisis, 46 fibroblastos de corazones no diabéticos y 129 fibroblastos de corazones diabéticos migraron durante el período experimental de 24 horas.
La medición del área de migración como se demostró, reveló que el área de arañazos no diabéticos comía el 24,78% del área total medida, mientras que el área de rascado de migración diabética comía el 16,77% del área total medida. Normalizarse al área de migración proporciona una evaluación mejor y más rigurosa de la migración celular y niega un posible error humano. Por ejemplo, si solo se compara el número de fibroblastos migrados, aparecería en este análisis que el número de celdas que migraron en este pozo era el doble que el de las celdas migradas en el segundo pozo.
Sin embargo, cuando se utilizó el área del rasguño para normalizar los datos, se observó que la relación de los fibroblastos con el área de migración era casi la misma en ambos pozos. Asegúrese de recuperar el área de migración en la imagen de 24 horas, tal como se capturó en la imagen de hora cero. Después de este procedimiento, la inmunohistoquímica se puede llevar a cabo para examinar la expresión de proteínas dentro de las células.
Creemos que este nuevo enfoque del ensayo de migración de arañazos permitirá abrir más vías de investigación científica que antes no estaban disponibles.
