Este trabajo fue apoyado por FWO-Vlaanderen, el proyecto IOF IOF10 / stARTT / 027 y la Universidad de Gante Especial de Becas de Investigación BOF12 / GOA / 014.

Nota: El siguiente protocolo de transfección y co-inmunoprecipitación se establece para un formato de placa de Petri de 9 cm. Otros formatos también son posibles después de escalar el protocolo. 1. Siembra el riñón embrionario humano (HEK) Células 293T <ol><li> Sembrar el células HEK293T un día antes de la transfección a 1,2 x 10 6 células por 9 cm placa de Petri en 12 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de ternera fetal al 10%, 2 mM L-glutamina, 0,4 mM Na-piruvato, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 100 U / ml de penicilina y 0,1 mg / ml de estreptomicina. </li><li> Cultivar las células 16 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Inspeccione visualmente la morfología y la viabilidad de las células con un microscopio de luz invertida antes de la transfección. Las células necesitan para ser sub-confluente para una óptima eficiencia de transfección. </li></ol> 2.-fosfato de calcio transfección de células HEK293T Nota: Uso 0,5-1 g de pCAXL-NP o plásmido vacío pCAXL en combinación con 1.3 g de pCAXL-Mx1 por 9 cm plato. Utilice una cantidad igual de ADN plasmídico total en todas las muestras; ajustar con el plásmido vacío si es necesario. <ol><li> Prepare los siguientes tampones de transfección: <ol><li> Preparar Tris-EDTA (TE) con concentraciones de 1,0 mM Tris-HCl pH 8,0 y EDTA 0,1 mM pH 8,0. </li><li> Preparar BS / HEPES con concentraciones de 25 mM HEPES (5,96 g / L, 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico), NaCl 274 mM (16 g / L), 10 mM KCl (0,74 g / L), 1,5 mM NaHPO 4 · 12H 2 O (0,5 g / L) y dextrosa 11,1 mM (2 g / L). Ajustar el pH a 7,05. </li><li> Preparar CaCl 2 / HEPES con concentraciones de 1,25 M CaCl 2 · 2H 2 O (183,8 g / L) y 125 mM HEPES (29,79 g / L). Ajustar el pH a 7,05 con NaOH. </li></ol></li><li> Calentar los buffers de transfección a 37 ° C antes de su uso. </li><li> Preparar las muestras de plásmido mediante la dilución del ADN plásmido en 600 l de TE.Preparar estas mezclas en pocillos de una placa de 6 pocillos. </li><li> Añadir 150 l de CaCl 2 / HEPES en un gota a gota de manera que las muestras de plásmidos y mezclar pipeteando 3 veces arriba y abajo. </li><li> Preparar la solución de transfección a gota la adición de la solución sabia plásmido (TE + ADN + CaCl 2 / HEPES; 750 l) a 750 l de tampón BS / HEPES proporcionados en una placa de 6 pocillos fresco. Distribuir el plásmido de manera uniforme sobre el buffer / HEPES BS así que contiene completa. </li><li> Agite la solución de transfección en un agitador de placas durante 90 segundos a 1000 RPM. </li><li> Incubar la mezcla durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir la solución de transfección (1,5 ml) gota a gota a las células. Utilice una micropipeta P1000 a gotear la solución de transfección en las células. Dispersar la mezcla sobre la completa 9 cm placa de Petri y agitar la placa muy suavemente. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 6 horas. A continuación, retire el medio por aspiración y sustituir de inmediato wiº 12 ml de medio fresco, pre-calentado. Añadir con cuidado el medio fresco a las células para evitar el desprendimiento de células. Para ello, mantenga la punta de la pipeta contra el lado del pozo y empuje suavemente hacia fuera el medio. </li><li> Se incuban las células durante una 16 h adicionales a 37 ° C y 5% de CO 2. </li></ol> 3. Co-inmunoprecipitación Nota: Realice el coinmunoprecipitación 24 horas después de la transfección. <ol><li> Preparación de la baja tampón de lisis sal y tampón de lavado alta en sal. <ol><li> Preparar una solución madre de 2 M N-etil-maleimida (NEM) pesando la cantidad de NEM y disolviéndolo en etanol absoluto. Preparar la solución madre NEM fresco antes de su uso. PRECAUCIÓN: NEM es muy tóxica, preparar y utilizar esta solución madre en una campana de humos. </li><li> Preparar baja tampón de lisis a concentraciones de sal mM Tris-HCl 50 pH 8, NaCl 150 mM, ácido etilendiaminotetraacético 5 mM (EDTA), 1% de NP40 y un cóctel inhibidor de la proteasa (1 disolver tablat en tampón de lisis 50 ml). Añadir NEM a una concentración final de 25 mM (es decir, diluir 1:80). Mantener en hielo después de la adición de los inhibidores de la proteasa y NEM. Nota: Siempre agregue los inhibidores de la proteasa y NEM recién antes de su uso. </li><li> Preparar un tampón de lavado de sal alta en concentraciones de 50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 500 mM, EDTA 5 mM y 1% de NP40. Tenga en cuenta que el tampón de lavado alta en sal no contiene NEM. </li></ol></li><li> Preparación de lisados ​​celulares. <ol><li> Retire el medio y se lavan las células con 2 ml de hielo frío buffer fosfato salino (PBS). Añadir Muy suavemente el tampón de lavado, como células HEK293T se desprenden fácilmente. </li><li> Retire el PBS y añadir 600 l de tampón enfriado con hielo bajo lisis sal por 9 cm placa de Petri. </li><li> Se incuban las placas durante 20 minutos en hielo. Asegúrese de que las placas se mantienen horizontal, para asegurar la cobertura completa de la superficie de la placa con tampón de lisis. Agite suavemente las placas cada 5 minutos. </li><li> Recoger el lisado de células en una microcentrífuga de 1,5 mltubo y centrifugar durante 3 min a 4 ° C y 16.000 xg para sedimentar la fracción insoluble. </li><li> Transferencia de la fracción soluble, es decir, el lisado celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y mantenerla en hielo. Inmediatamente continuar con el protocolo de co-inmunoprecipitación, para evitar la disociación de las proteínas que interactúan. Realice todos los pasos siguientes en lo posible en el hielo o a 4 ° C para limitar la actividad proteolítica en los lisados. </li></ol></li><li> Generación de complejos inmunes. Nota: En este paso, la proteína de interés está vinculado por el anticuerpo apropiado. Para estudiar la interacción NP-Mx1, utilizar un anticuerpo monoclonal anti-NP ratón. <ol><li> Para cada muestra, mezclar 135 l de lisado con 2 l de anti-NP anticuerpo monoclonal y 113 l de tampón de lisis de baja sal (volumen total de 250 l). Almacenar el lisado restante a -20 ° C para su posterior análisis como el Western Blot, para documentar los niveles de expresión de la Intera conjeturadosocios cción en las células transfectadas. Nota: Como alternativa, medir la concentración de proteína del lisado (por ejemplo, con el reactivo de Bradford) y el uso de una cantidad fija de proteína total, por ejemplo, 400 g, para cada lisado. </li><li> Se incuba la mezcla de anticuerpos lisado durante 3 horas en una rueda giratoria a 4 ° C. Este paso se puede extender a una incubación durante la noche. </li></ol></li><li> Preparación de la proteína G cuentas. Nota: Las perlas de proteína G se envían y se almacenan en etanol al 20% para su conservación. El talón suspensión normalmente consiste de 50% de perlas y estas perlas necesitan ser lavados antes de ser utilizados para inmunoprecipitar los complejos inmunes. <ol><li> Utilice 50 l de perlas, es decir, 100 l de perlas en suspensión, para cada muestra. Lavar la cantidad de perlas necesarios para todas las muestras en el ensayo de co-inmunoprecipitación en un solo tubo. Cortar la punta de una punta de pipeta de 1 ml para facilitar el pipeteado de la perla de la lechada. </li><li> Centrifugar la proteína G perlas suspensión a 8000 xg y 4 ° C durante 30 seg. Retirar la solución de etanol y añadir un volumen igual de tampón de lisis de baja sal. Centrifugar la proteína G bead-suspensión a 8000 xg y 4 ° C durante 30 segundos y retirar el sobrenadante con suavidad. Repita este paso de lavado 3 veces. Nota: El tampón de lisis de baja sal utilizada para lavar las perlas no necesita contener inhibidores de la proteasa o NEM. </li><li> Estimar el volumen de la proteína G cuentas y añadir un volumen igual de tampón de baja lisis sal para hacer un nuevo 50% del grano-suspensión en tampón de baja lisis sal. </li><li> Para cada muestra, la transferencia de 100 l de perlas en suspensión en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml fresco y almacenar en hielo hasta su uso. Tenga cuidado para resuspender la suspensión de perlas antes de dividir, ya que estas perlas se sedimentan rápidamente a la parte inferior del tubo. </li></ol></li><li> La inmunoprecipitación de los complejos inmunes de perlas de proteína G y su elución. <ol><li> Antes de utilizar las proteínas G bolas para la inmunoprecipitación, todos los tubos de centrífuga de 30 segundos a 8000 xg y 4 ° C yverificar mediante inspección visual de que hay una cantidad igual de perlas presente en todas las muestras. Si es necesario ajustar la cantidad de perlas en algunas de las muestras y se centrifuga de nuevo. Deseche los sobrenadantes. Tenga cuidado de no molestar a las proteínas G bolas sedimentadas. </li><li> Centrifugar brevemente los complejos inmunes (es decir., Lisados ​​con el anticuerpo, 250 l) durante 30 segundos a 8000 xg y 4 ° C para recoger la muestra completa en la parte inferior del tubo. La transferencia de los complejos inmunes a las perlas proteína G (50 l). </li><li> Incubar 60 min en una rueda de inflexión a 4 ° C. No incubar estos complejos inmunes más de 75 min con las perlas para reducir la unión no específica de proteínas a la proteína G cuentas. </li><li> Centrifugar las perlas de proteína G (con complejos inmunes ligados) durante 30 segundos a 8000 xg y 4 ° C y retirar los sobrenadantes. Tenga cuidado de no molestar a las proteínas G bolas sedimentadas. Opcional: almacenar estos sobrenadantes a 4 ° C o -20 ° C para su posterior análisis,por ejemplo, para estimar la cantidad de proteína no unida. </li><li> Lavar las proteínas G bolas durante aproximadamente 5 min con 900 l de tampón de lisis de alta sal. Asegúrese de que las cuentas están completamente resuspendidas en el tampón de lavado para el lavado óptimo. Centrifugar las proteínas G bolas durante 30 segundos a 8.000 xg y 4 ° C y descartar el sobrenadante. Repita este paso de lavado 4 veces. Tenga cuidado de no alterar las perlas de proteína G sedimentadas para evitar la pérdida de material inmunoprecipitado. </li><li> Después de la última etapa de lavado, se añaden 50 l de tampón de muestra 2x Laemmli a las perlas y se calienta la suspensión durante 10 min a 95 ° C para eluir los (co) proteínas inmunoprecipitadas. <ol><li> Preparar 10 ml de tampón de Laemmli 6x con 1 g de dodecil-sulfato de sodio, 3,5 ml de glicerol, 3,5 ml de 1 M Tris-HCl pH 6,8 y 420 l de β-mercaptoetanol. Ajustar a un volumen total de 10 ml por adición de agua destilada. Diluir 3 veces en agua destilada para obtener tampón Laemmli 2x. PRECAUCIÓN: &amp;# 946; mercaptoetanol es tóxico, preparar y usar tampón Laemmli en una campana de humos. </li></ol></li><li> Después de calentar, centrifugar las proteínas G bolas durante 30 segundos a 8.000 xg y almacenar las muestras a 4 ° C (corto plazo) o -20 ° C (a largo plazo). </li></ol></li></ol> 4. Analizar la (co) inmunoprecipitaron proteínas <ol><li> Visualizar las proteínas presentes en el lisado de células y eluato de la co-inmunoprecipitación por SDS-PAGE 20 y el oeste de transferencia de 21,22. Normalmente cargar medio del eluido Laemmli en gel. Tenga cuidado de no molestar a los granos G de proteínas sedimentadas al tomar muestras para carga de gel. Mx1 y expresión NP se revelaron con un anti-Mx1 y anticuerpo-NP anti, respectivamente 14. Las bandas se detectaron con quimioluminiscencia basado-HRP y un desarrollador de película de rayos X. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El estudio de la interacción entre las proteínas antivirales y sus dianas virales es muy importante para entender los detalles del mecanismo antiviral de estas proteínas. Esto puede dar nuevas pistas sobre cómo coevolucionado virus y sus anfitriones y ser la base para el desarrollo de nuevas estrategias antivirales. El protocolo de co-inmunoprecipitación optimizado descrito aquí permite estudiar la interacción entre la proteína Mx1 de ratón y su diana viral, la proteína NP de la gripe. El aspecto más importan...

Resistencia Myxovirus (Mx) las proteínas son una parte importante de la defensa inmune innata contra los patógenos virales. Estas proteínas son grandes GTPasas-dynamin como que son inducidos por el tipo I y tipo III interferones. Los genes MX correspondientes están presentes en casi todos los vertebrados en una o varias copias y sus productos génicos inhiben una amplia gama de virus, incluyendo Orthomyxoviridae (por ejemplo., Virus de la gripe), Rhabdoviridae (por ejemplo., Virus de la estomatitis vesicular), Bunyaviridae (por ejemplo. , el virus de la crosse) y Retroviridae (por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana-1) 1-4. No está claro cómo estas proteínas reconocen una amplia gama de virus tales, sin ninguna secuencia primaria compartida aparente motivos en estos virus. El análisis de la interacción de proteínas Mx con sus objetivos virales, potencialmente involucra complejos de orden superior con otros factores de la célula huésped, le ayudará a comprender los mecanismos moleculares tsombrero de haber evolucionado en la carrera armamentista entre los virus y sus anfitriones. La interacción entre las proteínas de mamíferos Mx y objetivos virales se ha estudiado más ampliamente para MxA humano. MxA humano puede inhibir la replicación de muchos virus, incluyendo el ortomixovirus influenza A y virus Thogoto. MxA une los complejos de ribonucleoproteína virus Thogoto (vRNPs), impidiendo de este modo su entrada nuclear, lo que resulta en el bloque 5 de la infección. Esta interacción entre MXa y Thogoto vRNPs virus se ha demostrado con co-sedimentación y co-inmunoprecipitación experimentos 6-9. Cómo proteínas Mx obstaculizan virus de influenza A que está menos claro. Un problema importante es que no es fácil de demostrar una interacción entre una proteína Mx y un producto génico influenza. Un informe mostró una interacción entre MxA humana y la proteína NP de la gripe A células infectadas por virus 10. Esta interacción sólo se pudo demostrar por co-immunoprecipitation si las células habían sido tratados con los ditiobis reactivo de reticulación (propionato de succinimidilo) antes de la lisis, lo que sugiere que la interacción es transitorio y / o débil. Estudios más recientes han demostrado que el diferencial Mx sensibilidad de las distintas cepas de la gripe A se determina por el origen de la proteína NP 11,12. En línea con esto, los virus de la influenza A pueden escapar parte del control Mx mutando residuos específicos en la proteína NP 13. Esto sugiere que el principal objetivo de los virus de la gripe A para el host Mx es la proteína NP, probablemente NP montado en complejos vRNP. Sin embargo, ninguno de estos estudios más recientes demostraron una interacción entre la gripe NP o vRNPs y, o bien MxA humano o de ratón Mx1. Recientemente hemos demostrado, por primera vez, una interacción entre la influenza NP y la proteína Mx1 de ratón con un protocolo de co-inmunoprecipitación optimizado 14, que se describe aquí en detalle. En general, co-immunoprecipitation es uno de los enfoques bioquímicos utilizados más frecuentemente para investigar las interacciones proteína-proteína. Esta técnica se prefiere a menudo sobre las técnicas alternativas, por ejemplo, dos híbridos de levadura, ya que permite investigar las interacciones proteína-proteína en su entorno natural. Co-inmunoprecipitación se puede llevar a cabo en las proteínas expresadas endógenamente si los anticuerpos contra las proteínas de interés están disponibles. Alternativamente, las proteínas de interés se pueden expresar en la célula a través de la transfección o infección y una etiqueta de afinidad pueden ser utilizados. Además de las ventajas mencionadas anteriormente, el protocolo de co-inmunoprecipitación descrita permite la detección de interacciones débiles y / o transitorios de proteínas. El componente principal de este protocolo optimizado es la adición de N-etilmaleimida (NEM) en el tampón de lisis celular. NEM es un reactivo de alquilación que reacciona con los grupos tiol libres tales como presente en cisteínas, a un pH de 6.5 a 7.5, para formar un éster tio-estable(Figura 1). A mayor pH, NEM también puede reaccionar con grupos amino o someterse a hidrólisis 15. NEM se utiliza típicamente para bloquear los grupos tiol libres, con el fin de prevenir la formación de enlaces disulfuro o inhibir la actividad enzimática. Por ejemplo, NEM se utiliza a menudo para bloquear enzimas desumoylating, que son proteasas de cisteína. En el protocolo de co-inmunoprecipitación descrita, NEM se incluyó en el tampón de lisis porque había sido informado de que la sumoilación de las proteínas de la gripe puede influir en la interacción entre las proteínas virales 16. Inesperadamente, la adición de NEM resultó ser clave para documentar la interacción entre la gripe NP y el ratón Mx1 por co-inmunoprecipitación. No está claro por qué la adición de NEM es crucial para detectar la interacción NP-Mx1. Posiblemente la interacción es demasiado transitoria y / o débil. NEM podría estabilizar la interacción, por ejemplo, mediante la preservación de una conformación específica de Mx1, una proteína viral o incluso un tercero desconocido componente. Tal efecto estabilizador de NEM se ha observado antes, por ejemplo, para la interacción entre la ribonucleótido reductasa M1 y su gemcitabina inhibidor (F2dC) 17. Mx1 y NP ambos contienen múltiples residuos de cisteína que podrían ser modificados por NEM. Por ejemplo, un estudio reciente de Rennie et al. Demostró que una variante sin pecíolo MxA contiene tres residuos de cisteína expuestos de disolventes que pueden ser modificados por yodoacetamida. La mutación de estos residuos de serinas no influyó en la actividad enzimática de MxA, pero impide la agregación mediada por disulfuro de 18. Como estas cisteínas se conservan en Mx1, esto sugiere que las cisteínas análogos en Mx1 pueden ser modificados por NEM y como tal influencia su conformación o solubilidad. Además, NEM también podría afectar a la actividad GTPasa de Mx1, que es esencial para la actividad anti-influenza de Mx1, y con ello estabilizar la interacción entre Mx1 y NP. Sin embargo, un efecto directo de NEM en la GTPasa actividad de Mx1 es improbable, ya que también se requiere NEM para detectar la interacción entre la gripe NP y GTPasa mutantes inactivas de la proteína Mx1 14. Claramente, se necesita más investigación para desentrañar el efecto de NEM en la interacción NP-Mx1. En resumen, el protocolo de co-inmunoprecipitación descrita permite estudiar la interacción entre la proteína antiviral Mx1 y su diana viral, la proteína NP de la gripe. Este protocolo también podría ser utilizado para estudiar otras interacciones débiles o transitorios que dependen de la estabilización de las conformaciones de proteínas específicas. Interacción proteína-proteína que dependen de conformaciones específicas se han descrito antes, por ejemplo, para las proteínas de unión a calcio tales como calmodulina 19. Por último, el papel beneficioso de NEM también podría ser utilizado en otros métodos que detectan interacciones proteína-proteína, tales como ensayos de co-sedimentación.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52100-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-3876</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-30212</td>
			<td>also known as NP40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 873 580 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NP monoclonal antibody</td>
			<td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td>
			<td>NR-4282</td>
			<td>ascites blend of clones A1 and A3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RNP polyclonal serum</td>
			<td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td>
			<td>NR-3133</td>
			<td>directed against A/Scotland/840/74 (H3N2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose 4FF</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0618-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperfilm ECL 18 x 24 cm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9068-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>32106</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-immunoprecipitation of the mouse mx1 protein with the influenza a virus nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

N-etil-maleimida es un compuesto orgánico que se puede utilizar para modificar irreversiblemente grupos tiol libres, por ejemplo, para inhibir las proteasas de cisteína (Figura 1). La proteína antiviral Mx1 inhibe la replicación del virus influenza A mediante la interacción con la nucleoproteína viral. El protocolo coinmunoprecipitación optimizado descrito aquí permite estudiar esta interacción NP-Mx1. Células HEK293T fueron transfectadas con vectores de e...

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Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-inmunoprecipitación de la proteína de ratón Mx1 con la Influenza A nucleoproteína del virus

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.6K vistas.  VIB. This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Generación de recombinantes del virus de influenza a partir del ADN plásmido

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Investigación

Inmunología e Infección

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Utilizando imágenes bioluminiscentes encargado de investigar la sinergia entre Streptococcus pneumoniae Y el Virus de la Influenza en ratones lactantes

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Purificación por afinidad de los complejos de ribonucleoproteína Influenza Virus de la cromatina de las células infectadas

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Propagación del virus de la influenza en embrionados de pollo Huevos

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Nasal Toallitas para Influenza A Detección de Virus y aislamiento de los cerdos

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Un ensayo de microarrays miniaturizada glicanos para la evaluación de avidez y especificidad del virus de la gripe A Hemaglutininas

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro El desmontaje de virus de influenza A cápsides por centrifugación en gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

La neuraminidasa Ensayo de inhibición basado en la fluorescencia para evaluar la susceptibilidad de los virus de la influenza a El Inhibidor de la neuraminidasa clase de antivirales

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.