Nos gustaría dar las gracias a Patrick C. Wilson para CR9114 anticuerpo monoclonal. También agradecemos a Jennifer Debeauchamp y Richard Webby para los plásmidos originales A/Anhui/1/13. Soporte parcial para este trabajo fue proporcionado por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas-financiado Proyecto Programa de Subvención AI097092-01A1 y CEIRS (Centros de Excelencia para la Investigación de la Influenza y Vigilancia, HHSN26620070010C). FK fue apoyado por una beca de Erwin Schrödinger (3232 J) del Fondo de Ciencias de Austria (FMF).

1. Generación de baculovirus recombinante <ol><li> Clonación en transferencia de plásmidos de baculovirus <ol><li> Clon H7 HA y NA N9 ectodominio (o cualquier otro gen HA o NA) en plásmidos de transferencia pFastBac modificados (véase la introducción). Vectores para HA que contiene un dominio de trimerización C-terminal y una etiqueta de hexahistidina, así como para NA que contiene un dominio de tetramerización N-terminal y la etiqueta de hexahistidina, se han descrito 1,10,11,22 (Figura 1) y pueden ser solicitada desde los autores. Nota explicativa: ectodominios HA expresadas sin un dominio de trimerización se pliegan de forma incorrecta, lo que lleva a la pérdida de epítopos neutralizantes conformacionales, especialmente en el dominio de tallo. Del mismo modo, la función enzimática de NA se basa en tetramerización adecuada. </li><li> Generación de bácmidos Transformar de transferencia de baculovirus-plásmidos que contienen los genes HA y NA en bacterias DH10Bac de acuerdo con una de expresión de baculovirussistema según las instrucciones del fabricante. Aislar y purificar bácmidos utilizando un kit Midiprep de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Figura 2). </li></ol></li><li> Rescate de baculovirus recombinante y la verificación de la expresión de proteínas Nota explicativa: Los siguientes pasos se deben realizar de forma aséptica en una campana de flujo laminar. Realice este procedimiento independiente para HA y NA (o cualquier otro gen de interés). Las células de insecto son generalmente cultivadas a 28 ° C sin CO 2. Células Sf9 para este protocolo se cultivan en medios completos de células de insecto TNM-FH suplementado con 10% de FBS, 1% de Pen-Strep * y solución Pluronic F68 0,1%, si no se indica lo contrario, y se pasaron 1:04 dos veces a la semana. Células High Five se cultivan en suero libre de los medios de comunicación SFX y se pasaron 1:15 dos veces a la semana. * La adición de antibióticos debe ser considerada opcional en todo el protocolo y ajustarse de acuerdo con las prácticas utilizadas en cada laboratorio. <ol><li> Placa células de insecto Sf9 en placas de 6 pocillos a una densidad de 2 x 10 5 células / cm 2 y deje reposar durante 20 minutos en una incubadora de 28 ° C (sin CO 2). </li><li> Mezcle 2 g (concentración 0,5-2 mg / l) de bácmido recombinante con 100 l de medio TNM-FH (sin suero, 1% Pen-Strep). Mezclar 6 l de agente de transfección con 100 l de medio TNM-FH (sin suero, Pen-Strep). Combinar los dos volúmenes, mezclar suavemente y dejar reposar durante 20 minutos a temperatura ambiente (mezcla de transfección). Incluya una maqueta de transfección como control (Figura 3). </li><li> Aspirar el sobrenadante de las células Sf9 chapados (células serán ahora se adhieren a la placa) y reemplazar con 2 ml de medio TNM-FH libre de suero que contenía Pen-Strep (1%). Añadir el volumen total de la mezcla de transfección (del paso 1.2.2) y el rock de la placa de 6 pocillos cuidadosamente durante 5 segundos. Incubar en una incubadora de 28 ° C sin CO 2 durante 6 horas (Figura 3). </li><li> Reemplace wi mediosmedios th frescas completo TNM-FH (que contienen 10% de FBS, 1% de Pen-Strep y 0,1% de Pluronic F68). Incubar en una incubadora de 28 ° C sin CO 2 durante 6 días. Compruebe células de vez en cuando bajo un microscopio. Las células infectadas suelen aparecer más grande, más redondo, se han ampliado los núcleos, y comienzan a desprenderse (Figura 4). </li><li> Cosecha de células y la confirmación de la expresión de la proteína <ol><li> Células Cosecha 6 días después de la transfección por centrifugación a 2000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. El sobrenadante contiene el baculovirus recombinante - esto se utiliza para generar reservas de trabajo de inmediato, o se puede almacenar a 4 ° C por año. </li><li> Para comprobar la expresión de proteínas recoger pellets y resuspender en 500 l de PBS. Mezclar 50 l de la suspensión con 50 l de tampón SDS-PAGE de carga (que contiene un agente reductor). Ejecutar SDS-PAGE y realizar un análisis de transferencia Western con un anticuerpo anti-hexahistidina para confirmar la expresión de genes. Incluya las células de la maquetatransfección como controles negativos (Figura 3). </li></ol></li><li> Preparación de las reservas de trabajo <ol><li> La placa 5 x 10 5 células Sf9 / cm 2 en un matraz T175 cm 2 y deje reposar por 20 min les permiten adherirse al plato. Reemplace completa medios TNM-FH con medios TNM-FH que contiene 3% de SFB (y 1% Pen-Strep, 0,1% de Pluronic F68). </li><li> Infectar las células con 100 l del sobrenadante de rescate. Incubar en una incubadora de 28 ° C y sin CO 2 durante 6 días y comprobar de vez en cuando si las células se infectan (como se describe en el paso 1.2.5.). </li><li> Giran a 2000 x g a temperatura ambiente durante 5 min y se recoge el sobrenadante. Esta es ahora tu P2 de valores. Esta acción se puede almacenar indefinidamente a 4 ° C. Repita el procedimiento de infección usando 100 l de la población P2 para infectar células. La acción resultante se denomina P3 o de stock de trabajo, que se puede almacenar a 4 º C o se usa directamente para la expresión de la proteína. El P3 valores por lo general contiene 10 &lt;sup&gt; 7 -10 9 unidades formadoras de placa / ml. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Expresión y Purificación de Proteínas Nota explicativa: células Sf9 apoyar el crecimiento de baculovirus muy bien. Sin embargo, su capacidad para secretar grandes cantidades de proteína recombinante es limitada. Por ello utilizamos otra línea de células de insecto, células High Five, para la expresión de proteínas recombinantes secretadas. Estas células no apoyar la replicación de baculovirus a títulos muy altos 13 pero tienen alta capacidad secretora. <ol><li> Al crecer las células High Five Se cultivan las células High Five en SFX medio de cultivo de células de insecto en T175 cm 2 frascos. Pasaje cada otro día 01:03. Por una cultura 200 ml expresión tendrá que crecer matraces confluentes 5. </li><li> La cosecha y la infección de células High Five <ol><li> Separe las células High Five de 5 T175 cm 2 frascos tocando los frascos con la mano. Recoger el suspe celularnsion y transferir a tubos de 50 ml de centrifugación. </li><li> Gira a 1.200 xg durante 7 minutos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante por decantación y unir los gránulos mediante resuspensión en 15 ml de stock P3. </li><li> Deje reposar durante 15 minutos en la campana de flujo (Figura 5). </li><li> Transferir 200 ml de medio de cultivo Hyclone SFX en un estéril 1,000 ml frasco agitador limpio (sin buffles, sellado con papel de aluminio antes de esterilizar, no debería haber sido utilizado para cultivos de bacterias antes). </li><li> Transferir la suspensión P3/cell en el matraz agitador. Selle con papel de aluminio estéril y frasco de transferencia en una coctelera. Agitar a 70 rpm a 28 ° C durante 72-96 horas. </li></ol></li><li> La cosecha de la proteína recombinante de High Five sobrenadantes de expresión de células <ol><li> 72-96 h después de la infección de transferencia de los sobrenadantes del cultivo en 500 ml cubos de centrifugación. Gira a 5.500 xg durante 20 min a 4 ° C. Mientras tanto enjuague los matraces de agitación 3 veces con agua bidestilada(DdH2O). </li><li> Transferencia de 3 ml de suspensión de Ni-resina en un tubo de 50 ml con 45 ml de PBS (uno necesita por 200 ml de cultivo). Agitar bien y centrifugar a 3000 xg a temperatura ambiente durante 10 min. Decantar el PBS y mantener el pellet. Mezclar el sobrenadante de células de insecto con el sedimento de Ni-resina y transferir en los matraces de agitación ya enjuagados. Se incuba a 4 º C durante 2-4 horas, mientras se agita (Figura 6). </li><li> Columna de polipropileno ml Monte 10 en una pinza en un soporte de apoyo. Retire las dos tapas y coloque un vaso debajo de la columna para recoger el flujo a través (de residuos). Tome el matraz de agitador de la coctelera y empezar a transferir la mezcla de sobrenadante / suspensión sobre la columna; retendrá la resina Ni-y sólo el sobrenadante fluirá a través. Pasar todo el volumen sobre la columna (Figura 7). </li><li> Lavar los 4x de resina con 15 ml de tampón de lavado (50 mM de Na 2 HCO 3, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 8). Deje que todo el drenaje de tampón de lavadode la columna y cerrarlo con la tapa (lado inferior). </li><li> Añadir 2 ml de tampón de elución (50 mM Na 2 HCO 3, NaCl 300 mM, imidazol 300 mM, pH 8) y dejar reposar durante 5 minutos. Abra la columna y recoger el eluido. Repita esto 3 veces más (un total de 8 ml de tampón de elución). El eluato que contiene altas concentraciones de proteína típicamente muestra de espuma cuando se agitan (Figura 7). Mantenga eluido en hielo húmedo siempre que sea posible. </li></ol></li><li> El cambio de tampón y la concentración <ol><li> Prespin 15 ml unidades de centrifugación de ultrafiltración (30 kDa de corte para HA / NA, pero puede variar dependiendo del tamaño de la proteína purificada) con PBS (pH 7.4 a 7.6) a 3.000 xga 4 º C durante 20 min. Deseche el flujo a través y eluido carga sobre la columna de centrifugación. Llenar con 5 ml de, helada PBS estéril y centrifugado durante 60 minutos a 3000 xga 4 º C. </li><li> Flujo de descarga a través de nuevo, vuelva a llenar con 15 ml de PBS helado y centrifugado durante 60 minutos a 3000 xga 4 º C. Repita este procedimientoDuré una vez más. </li><li> Tome la columna de centrifugación de la centrífuga y se recoge el tampón intercambiado concentrado (típicamente 200 l). Esto está muy concentrado de proteína recombinante. Enjuague la columna de centrifugación con 400 l de hielo frío PBS estéril y añadir este al concentrado. Mantener el concentrado en hielo en todo momento. </li></ol></li></ol> 3. Caracterización y Control de Calidad <ol><li> Medición de la concentración de proteínas Tomar una alícuota del concentrado y medirlo usando su método de cuantificación de proteínas de elección. Establecer la concentración de proteínas a 1 mg / ml mediante la adición de PBS y congelar pequeñas alícuotas a -80 ° C. Ciclos de congelación y descongelación dañan la estructura de la proteína y pueden conducir a la agregación. </li><li> SDS-PAGE y tinción de Coomassie Correr 500 ng de su proteína en una SDS-PAGE y realizar una tinción de Coomassie. Para la tinción rápida y conveniente utilizar el reactivo de Coomassie en combinación con un protocolo de microondas. Proteínas HA suelen aparecer a los 64 añoskDa mientras que las proteínas NA deben ejecutar en un tamaño de alrededor de 56 kDa (Figuras 8A y B). Utilizando el protocolo descrito no debería ver cualquiera de los productos de degradación. Si se produce la degradación por lo general es una señal de contaminación de levadura / hongos durante la expresión. En este caso, repita el procedimiento y asegúrese de mantener todo estéril. </li><li> Western blot / ELISA Con el fin de verificar la identidad de proteínas se recomienda hacer para una transferencia de Western o ensayo ELISA con un anticuerpo específico. Idealmente, los ensayos de ELISA se realizan con un anticuerpo que se une a epítopos conformacionales (por ejemplo, anticuerpos anti-HA tallo 1). Uso de un anticuerpo tal el correcto plegamiento de la proteína se puede confirmar (Figura 8C). </li><li> Medición de la actividad de NA Plegamiento correcto de la NA viral también se puede determinar midiendo la actividad de NA. Se recomienda realizar esta prueba utilizando el ensayo NA * STAR disponible comercialmente (sólo tienes que seguir las directrices para el usuario). </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Aunque la expresión de virus de la gripe HA y NA proteínas en células de insecto utilizando el sistema de expresión de baculovirus es generalmente sencillo, hay varios puntos importantes a considerar. Es importante, como se ha señalado en la introducción, que los ectodominios de HA y NA se expresan en fusión con dominios de trimerización o tetramerización, respectivamente. Estos dominios garantizar el correcto plegado de las moléculas normalmente ayudado por el dominio de transmembrana, que no está presente s...

Como primera respuesta a la reciente aparición de la nueva cepa del virus de la influenza H7N9 en China, adquirimos plásmidos portadores de las secuencias genómicas de la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) genes de los dos primeros aislamientos. El uso de estos plásmidos que pudimos construir rápidamente los vectores de expresión de baculovirus para la producción de HA y NA recombinante en células de insecto. Este sistema de expresión está bien establecida en nuestro laboratorio y ha demostrado ser fundamental para muchos de nuestros proyectos de investigación en curso 1-8. Las células de insectos son capaces de doblar correctamente y después de la traducción modificar proteínas complejas. Estas modificaciones incluyen la glicosilación ligada a N, lo cual es importante para muchas glicoproteínas virales. Como tal, no es sorprendente que el sistema de baculovirus es bastante establecido para la expresión de antígenos de superficie del virus de la gripe. De hecho, muchas de las estructuras cristalinas de HA y NA han sido resueltos utilizando proteínas de las células de insectos expresado 9-11. Otra ventaja de lasistema se encuentra en sus rendimientos fiables de alto valor proteico de hasta 30 mg de cultivo celular HA / L (en base a nuestra experiencia con más de 50 diferentes proteínas HA) - Una consecuencia de la expresión dirigida por virus la infección por el fuerte promotor de la polihedrina. La eliminación de la transmembrana y endodominio de las proteínas HA y NA permite la expresión de versiones secretables, solubles de las proteínas y por lo tanto facilita en gran medida el proceso de purificación. Además, estos ectodominios se hexahistidina etiquetados y por lo tanto se pueden purificar utilizando cromatografía de afinidad utilizando Ni 2 +-resina. Los dominios transmembrana de las proteínas HA y NA contribuyen a la formación de homotrímero y homotetrámero, respectivamente. Con el fin de preservar estas oligomerizaciones, se añade un dominio de trimerización C-terminal para el HA-, y un tetramerización dominio N-terminal a la AN construcciones (Figura 1). Hemos demostrado de manera concluyente que tal dominio de trimerización estabiliza funcional, conserved epítopos conformacionales en el tallo en el dominio de HA 1. El tetramerización correcta de la NA también podría contribuir a corregir el plegado y la función NA 10. Secuencias y vectores de baculovirus de transferencia de albergar dominios de trimerización o tetramerización pueden solicitarse a los autores o de otros laboratorios en el campo, 9,10,12. Otra cuestión importante para la expresión de proteínas secretadas en células de insecto es la elección de la línea celular de la derecha. Mientras Spodoptera frugiperda deriva células Sf9 soportan la replicación de baculovirus muy bien y se utilizan generalmente para el rescate y la propagación del virus, que tienen una capacidad de secretar grandes cantidades de proteína limitado. Trichoplusia ni deriva BTI-TN-5B1-4 células (comúnmente conocidos como High Five) tener una capacidad mayor secreción y son la línea celular de elección para la expresión en este protocolo 13,14. Además, es útil para reducir o incluso eliminar el suero bovino fetal (FBS) a partir de cultivos de expresión. Por lo tanto, utilizamos los medios de comunicación con reducida (3%) Contenido de FBS para el crecimiento de las reservas de trabajo de virus, y llevamos a cabo la expresión de proteínas en medio libre de suero. Proteínas HA y NA recombinantes se utilizan para muchas técnicas inmunológicas. Tal vez la más común se encuentra en ensayos de ELISA para medir la seroconversión tras la vacunación en humanos o animales 4,6,7,15. HAs y NAS también se utilizan en ensayos de ELISPOT como ambas moléculas estimuladoras y reactivos de detección de células secretoras de anticuerpos 16. Su uso como cebos moleculares permite ordenar específicamente para plasmablasts u otros tipos de células B, que luego se pueden utilizar para aislar anticuerpos monoclonales (terapéuticos) (mAbs). Recombinantes HA y NA moléculas son más utilizados en la caracterización de estos mAb 8. Otros ejemplos incluyen el estudio de la estabilidad del pH o de la especificidad del receptor de ha expresado por diferentes cepas de virus, o cuantitativamente evaluar enzimática específica NAla actividad o la resistencia a los inhibidores. Además, recombinante, purificada de HA se puede utilizar para normalizar el contenido de HA de las vacunas de virus de la gripe inactivados. Es importante destacar que rHA (y hasta cierto punto NA) vacunas candidatas están actualmente en evaluación en modelos animales y ensayos clínicos en humanos con una vacuna candidata está autorizada por la FDA en 2013 2,17-19. La ventaja de estas nuevas vacunas es que, debido a la naturaleza recombinante de estas proteínas, el proceso de trabajo intensivo de generación de virus de genomas reordenados de alto crecimiento podría ser evitado. Quizás aún más importante es el hecho de que su rendimiento HA es alta y reproducible de cepa a cepa. También, ya que estas vacunas se producen en un sistema libre de huevo, que no contienen contaminantes proteicos que son problemáticos para individuos con alergia al huevo. Aquí hemos elegido para expresar las proteínas HA y NA de dos aislamientos del nuevo virus de influenza H7N9 Chino, A / Anhui/1/13 y A/Shanghai/1/13 20,21. Estos son ejemplos oportunos, pero el protocolo descrito se pueden utilizar para la expresión de cualquier gripe A y B proteínas HA o NA y se pueden adaptar para expresar cualquier otras proteínas virales o celulares secretadas. Proteínas transmembrana trimérica o tetraméricas pueden ser clonados en los casetes de expresión utilizados para la HA y NA, respectivamente. Sin embargo, las proteínas celulares secretadas más solubles, como los interferones, por ejemplo, no es necesario un dominio adicional para la estabilización y se pueden expresar únicamente con una etiqueta de hexahistidina C-terminal.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus expression system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10359-016</td>
			<td>Follow manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNM-FH insect medium</td>
			<td>Gemini Bioproducts</td>
			<td>600-311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone SFX-Insect</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SH30278.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellfectin II Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N58760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1000702664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC902024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Columns (5 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max efficiency DH10Bac bacteria</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10361-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399-100G</td>
			<td>for elution and wash buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td><a href="http://www.atcc.org/Products/All/CRL-1711.aspx" target="_blank">CRL-1711</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Five cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B85502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of functional recombinant hemagglutinin and neuraminidase proteins from the novel h7n9 influenza virus using the baculovirus expression system

El sistema de expresión de baculovirus es una herramienta poderosa para la expresión de proteínas recombinantes. Aquí lo utilizamos para producir versiones correctamente plegadas y glicosilados de la influenza A virus glicoproteínas de superficie - la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA). A modo de ejemplo, hemos elegido las proteínas HA y NA expresadas por el nuevo virus H7N9 que emergió recientemente en China. Sin embargo, el protocolo se puede adaptar fácilmente para las proteínas HA y NA expresadas por cualquier otro de la gripe A y B cepas de virus. Proteínas recombinantes HA (rHA) y NA (ARN) son reactivos importantes para ensayos inmunológicos tales como ELISPOT y ELISA, y también son de uso generalizado para la normalización de la vacuna, el descubrimiento de anticuerpos, el aislamiento y la caracterización. Además, las moléculas de NA recombinantes pueden usarse para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas y son útiles para la caracterización de la función enzimática de la AN, así como su sensibilidad a los antivirales. Proteínas HA recombinantes también son being probado como vacunas experimentales en modelos animales, y una vacuna basada en HA recombinante fue autorizado recientemente por la FDA para su uso en seres humanos. El método como se describe aquí para producir estas moléculas es sencillo y puede facilitar la investigación en laboratorios de la gripe, ya que permite la producción de grandes cantidades de proteínas rápidas y a un bajo costo. Aunque aquí nos centramos en las glicoproteínas de superficie del virus de la gripe, este método también puede ser usado para producir otras proteínas de superficie virales y celulares.

Moléculas de HA de A/Shanghai/1/13 y A/Anhui/1/13 expresaron bien con rendimientos de aproximadamente 20 cultura mg / l. Moléculas de NA de ambas cepas mostraron niveles de expresión moderados que van desde 0,2 mg / l de cultivo para A/Shanghai/1/13 a 0,7 mg / L para A/Anhui/1/13. Los cuatro preparaciones de proteína tenían muy poco o nada de las impurezas (Figuras 8A y B) con El ser de mayor pureza que AN que puede explicarse por el nivel de expresión. A/Shanghai/1/13 HA se anali...

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Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Aquí se describe una forma de expresar antígenos de superficie del virus de la influenza correctamente plegadas y funcionales derivadas del nuevo virus H7N9 chino en células de insecto. La técnica se puede adaptar para expresar ectodominios de cualquiera de las proteínas de superficie virales o celulares.

Expresión de funcionales recombinante hemaglutinina y neuraminidasa Proteínas del Virus Novel H7N9 Influenza usando el sistema de expresión de baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

expression-functional-recombinant-hemagglutinin-neuraminidase

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.8K vistas.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  Aquí se describe una forma de expresar antígenos de superficie del virus de la influenza correctamente plegadas y funcionales derivadas del nuevo virus H7N9 chino en células de insecto. La técnica se puede adaptar para expresar ectodominios de cualquiera de las proteínas de superficie virales o celulares. 

Video: Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Generación de recombinantes del virus de influenza a partir del ADN plásmido

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Investigación

Inmunología e Infección

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Utilizando imágenes bioluminiscentes encargado de investigar la sinergia entre Streptococcus pneumoniae Y el Virus de la Influenza en ratones lactantes

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7. 
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter. 
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein. 
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
<a href="http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf</a> 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.

Lentiviral expression vectors are the most effective vehicles for stably expressing different effector molecules or reporter constructs in dividing and non-dividing mammalian cells and whole organisms. Here we provide a protocol on how to package lentivector expression constructs in pseudoviral particles and to transduce target cells using the pseudoviral particles.

Embalaje VIH o FIV basados ​​en lentivirus Construcciones de expresiones y de transducción de la VSV-G partículas virales pseudotyped

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Purificación por afinidad de los complejos de ribonucleoproteína Influenza Virus de la cromatina de las células infectadas

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

Diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por Trasplante de Médula Ósea

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

Rescate del virus de la enfermedad de Newcastle recombinante a partir de cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-inmunoprecipitación de la proteína de ratón Mx1 con la Influenza A nucleoproteína del virus

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Nasal Toallitas para Influenza A Detección de Virus y aislamiento de los cerdos

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Un ensayo de microarrays miniaturizada glicanos para la evaluación de avidez y especificidad del virus de la gripe A Hemaglutininas

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

La neuraminidasa Ensayo de inhibición basado en la fluorescencia para evaluar la susceptibilidad de los virus de la influenza a El Inhibidor de la neuraminidasa clase de antivirales

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...