This work was supported by grants from the Novartis Foundation for Medical-Biological Research and from the Research Pool of the University of Fribourg (to MW). We thank Li Zhao, Zhan Xu, and Solange Kharoubi Hess for technical support, as well as Radu Aricescu and Yvonne Jones (Oxford University, UK) for providing the pHLsec plasmid, and Thomas Sch&#252;rpf (Harvard Medical School) for helpful discussions.

1. Producción del plásmido de expresión pHLsec-Gzm <ol><li> Preparar el ARN total de las células NK humanas (células primarias preparadas como en el 26 o la línea de células NK NK-92 que expresa los cinco Gzms humanos) utilizando un método de aislamiento de ARN adecuado y transcribir inversa utilizando un kit de primera cadena sintetizar ADNc, siguiendo el manufacturer` recomendaciones s. Amplificar ADNc Gzm usando PCR y el clon en pHLsec como se describe en 23 (especie de regalo de Radu Aricescu e Yvonne Jones, de la Universidad de Oxford, Reino Unido), utilizando los sitios AgeI y KpnI (Figura 1). NOTA: Utilice los siguientes cebadores indicados en la Tabla 1. </li><li> Confirmar inserciones correctas por secuenciación. Expandir los plásmidos de expresión en células DH5a y purificar utilizando un kit de aislamiento de plásmido libre de endotoxinas y siga las instrucciones del fabricante. </li><li> Resuspender los plásmidos purificados en libre de endotoxina, agua estéril a una concentración de 2 mg / ml y se almacena a -20 ° C until uso. </li></ol> 2. Expresión de Gzms en células HEK293T <ol><li> Preparación de los reactivos <ol><li> Preparar medio de cultivo estándar. Para Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía alta glucosa (25 mM), glutamax (4 mM), piruvato de sodio (1 mM) añadir 10% de suero estándar de ternera fetal (FCS), penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina ( 100 g / ml). </li><li> Preparar medio de transfección. Para medio de cultivo sin penicilina-estreptomicina añadir 25 g / ml de cloroquina (añadir recién en el día de la transfección de las existencias 1,000x en PBS, almacenado a -20 ° C). </li><li> Preparar medio de cultivo libre de suero: Para medio libre de suero para células HEK293 añadir glutamina (4 mM), penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina (100 g / ml), y 2,5 mg / L anfotericina B. </li><li> Preparar las soluciones descritas en la Tabla 2 y el filtro con un filtro de 0,45 micras antes de su uso: </li></ol></li><li> Ampliando las células HEK293T <ol><li> Crecer células HEK293T en 20 ml de cultomedio ure utilizando 150 x 25 mm placas de cultivo de tejidos. </li><li> Dividir celdas a 80% de confluencia (split-relación de 1: 4, por lo general cada día 3º). Las células se adhieren libremente, que pueden separarse mecánicamente sin tripsinización por rigurosamente pipeteando arriba y abajo. </li><li> Células de la placa la noche antes de la transfección para dar 60-70% de confluencia en el día de la transfección (densidad de siembra ~ 2 x 10 5 células / ml). Un tamaño habitual preparación consiste en 20 a 25 placas de cultivo. </li></ol></li><li> Transfección de fosfato de calcio <ol><li> 1 hr antes de la transfección, cambiar el medio de cultivo estándar a 20 ml de medio de transfección. Cerca del final de esta etapa de incubación 1 h, la mezcla 400 g de ADN plásmido con 10,95 ml ddH 2 0 y 1,55 ml de 2M CaCl 2 en tubos de 50 ml (1 tubo / 5 platos). </li><li> 1 a 2 min antes de la transfección, añadir 12,5 ml de 2x HBS a 12,5 ml de la solución de ADN-calcio, mezclar por inversión de los tubos y se incuba durante 30 segundos a RT. </li><li> Añadir ªmezcla e prepara en 2.3.2 directamente a las células (5 ml por placa), gota a gota en el medio. Espolvorear uniformemente sobre toda el área, convirtiendo el medio a un color ligeramente anaranjado. </li><li> Incubar las placas de cultivo de 7 a 11 horas en una incubadora de cultivo de tejidos (37 ° C, 5% de CO2 en aire humidificado). Después de la incubación, un precipitado fino es visible. Retire el medio de transfección, enjuagar cuidadosamente con PBS precalentado y añadir 20 ml de medio de cultivo libre de suero preparado en 2.1.3. Incubar durante 72 horas en una incubadora de cultivo de tejidos. </li><li> Analizar la eficacia de transfección y expresión mediante la ejecución de una muestra (~ 20 l) del sobrenadante celular en SDS-PAGE y tinción con azul brillante de Coomassie para visualizar una banda de granzima. </li></ol></li><li> Purificación de Gzms del sobrenadante del cultivo por Nickel-IMAC <ol><li> Después de la incubación, decantar los sobrenadantes de cultivo de células en tubos de 250 ml y clara por centrifugación. Llevar a cabo una primera vuelta (400 xg, 10 min, 4 °C) que despejará el medio de células separadas. Transferir el sobrenadante en fresco 250 ml tubos y centrifugado a 4000 xg, 30 min a 4 ° C para eliminar cualquier residuo de células restante. </li><li> Añadir 5 ml de NaCl 5 M, 6,25 ml de 2 M Tris-Base (pH 8) y 1 ml de 0,25 M NiSO4 por 250 ml de sobrenadante clarificado. Filtrar el sobrenadante usando una unidad de filtro de vacío 500 ml (0,45 mm). </li><li> Equilibrar una columna de níquel-IMAC con Su-tampón de unión A (10 volúmenes de columna, CV) utilizando un sistema de FPLC adecuado. </li><li> Aplicar el sobrenadante aclarado a la columna equilibrada a un caudal de 0,5 ml / min a 4 ° C. </li><li> Después se aplicó el sobrenadante, lavar la columna con Su-tampón de unión hasta la línea base de absorbancia UV se alcanza (por lo general 10 CV). </li><li> Eluir Gzms con un 20 ml-gradiente lineal (0 a 250 mM imidazol) a una velocidad de flujo de 0,5 ml / min mientras que la recogida de 2 ml fracciones. Analizar las fracciones de elución por SDS-PAGE y tinción de Coomassie. </li></ol></li><li> Enteroquinasa (EK)el tratamiento y la limpieza final por cromatografía de intercambio catiónico <ol><li> Piscina Gzm contiene fracciones en un tubo de diálisis con ≤10 MWCO. Guarde una pequeña muestra a -20 ° C como control pre-EK. </li><li> Añadir EK en 0,02 unidades / 50 ml de sobrenadante inicial directamente a la fracción reunida en el tubo de diálisis y diálisis O / N (al menos 16 horas) a temperatura ambiente en EK-buffer (4 L, el cambio búfer una vez). </li><li> El día siguiente, analizar EK tratada Gzms en comparación con el control pre-EK por SDS-PAGE y tinción de Coomassie. </li><li> Cuando el procesamiento N-terminal es completa, cambiar tampón de diálisis a S tampón A (4 L) y se dializa durante otras 4 horas a RT. Dializado filtro (0,45 m). </li><li> Equilibrar un S-columna con tampón S A. Cargar la muestra en la columna con un caudal de 0,5 ml / min a 4 ° C. </li><li> Después de cargar la muestra, lavar la columna con tampón A hasta S UV absorbancia se alcanza la línea de base (sobre 10 CV). Eluir los Gzms con un gradiente lineal de 30 ml (150 a 1000 mM de NaCl). GzmA correolaúdes en ~ 650 mM NaCl, GzmB en ~ 700 mM NaCl y GzmM en ~ 750 mM NaCl. </li><li> Analizar las fracciones de elución por SDS-PAGE y ensayos colorimétricos (véase más adelante). Fracciones que contienen Gzms piscina y concentrado (aproximadamente 30 veces, a una concentración de aproximadamente 100 mM) en filtros de giro (15 ml, 10 MWCO). Alícuota los preparativos GZM concentrados y almacenar a -80 ° C. </li></ol></li></ol> Actividad 3. Prueba Gzm <ol><li> Preparación de los reactivos <ol><li> Preparar tampón de ensayo colorimétrico: 50 mM Tris-Base, pH 7. <ol><li> Para la medición de GzmA, añadir Na-CBZ-L-lisina tiobencilo éster (S-Bzl) (BLT) para el tampón de ensayo a una concentración final de 0,2 mM y 5,5&#39;-ditio-bis (ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) a una concentración de 0,22 mM. Para GzmB, incluir 0,2 mM Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl mM DTNB (AAD) y 0.22. Para GzmM, incluir 0,2 mM Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilida (pNA) (AAPL). Los péptidos sintéticos se añaden de soluciones de reserva adecuadas (en DMSO, stored a -20 ° C) a la memoria intermedia recién antes del ensayo. </li></ol></li><li> Preparar tampón de ensayo de escisión: NaCl 100 mM, 50 mM Tris-Base, pH 7,5 </li></ol></li><li> Ensayos colorimétricos <ol><li> Distribuir muestras pequeñas gzm (&lt;5 l) de fracciones de elución o poblaciones concentradas en las placas de 96 pocillos de fondo plano. Incluya un control positivo (preparaciones GZM probados o crudo lisados ​​de células NK) y un control negativo (tampón solamente). </li><li> Añadir 100 l de tampón de ensayo a cada pocillo (usando una pipeta multicanal). Incubar durante 10 minutos a 37 ° C. Medir la DO a 405 nm en un lector de microplacas. </li></ol></li><li> Ensayo de escisión <ol><li> Para los ensayos de escisión utilizando sustratos purificados, co-incubar un sustrato de proteína (nativo o recombinante, 100-400 nM; algunos ejemplos de sustratos gzm eficientes se presentan en la sección de resultados y en la nota al final de esta sección) con diluciones en serie de un Gzm (a partir de 400 nM) en tampón de ensayo durante diversos tiempos.Analizar mediante SDS-PAGE y tinción con plata o Coomassie; o mediante transferencia Western usando anticuerpos específicos. </li><li> Para los ensayos de escisión utilizando lisados ​​de células, suspender 10 6 células HeLa (o cualquier línea de células tumorales disponible) en 1 ml de tampón de ensayo y se lisan por congelación en un / baño de hielo seco de etanol y descongelación a 37 ° C tres veces. Eliminar los restos celulares por centrifugación (15.000 xg durante 10 min a 4 ° C). </li><li> Co-incubar el lisado aclarado con Gzms en diferentes concentraciones y tiempos que el anterior. La escisión se detecta por inmunotransferencia utilizando anticuerpos apropiados. NOTA: Algunos ejemplos de sustratos de buena fe para que los anticuerpos comerciales están disponibles: Oferta (BH3-interacción agonista muerte de dominio) y la caspasa 3 escindida por GzmB 27,28; múltiples ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (hnRNPA1, A2 y U) escindidas por GzmA 29; citomegalovirus fosfoproteína 71 por GzmM 30. </li></ol></li></ol>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+human+recombinant+granzyme+A+zymogen+and+its+activation+by+the+cysteine+proteinase+cathepsin+C.">Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C.</a> The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).</li><li>Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+colorimetric+assay+that+specifically+measures+Granzyme+B+proteolytic+activity:+hydrolysis+of+Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl.">A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419 (2014).</li><li>Huang, M. T., Gorman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intervening+sequences+increase+efficiency+of+RNA+3'+processing+and+accumulation+of+cytoplasmic+RNA.">Intervening sequences increase efficiency of RNA 3' processing and accumulation of cytoplasmic RNA.</a> Nucleic Acids Res. 18, 937-947 (1990).</li><li>Luthman, H., Magnusson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+polyoma+DNA+transfection+of+chloroquine+treated+cells.">High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308 (1983).</li><li>Magee, A. I., Grant, D. A., Hermon-Taylor, J., Offord, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+one-stage+method+for+assay+of+enterokinase+activity+by+release+of+radiolabelled+activation+peptides+from+alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen+and+the+effect+of+calcium+ions+on+the+enzyme+activity.">Specific one-stage method for assay of enterokinase activity by release of radiolabelled activation peptides from alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen and the effect of calcium ions on the enzyme activity.</a> Biochem J. 197, 239-244 (1981).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

El papel clásico y ampliamente estudiado de GzmA y GzmB es la inducción de apoptosis en células de mamífero después de su entrega citosólica por la proteína formadora de poros PFN 1. Recientemente, el espectro citotóxica de los Gzms se amplió de manera significativa a partir de células de mamíferos a las bacterias 9,10, así como a ciertos parásitos 11. Además, las funciones no clásicos, extracelulares de GzmA y GzmB así como la importancia biológica de los diversos Gzms ...

Los Gzms son una familia de serina proteasas altamente homólogas localizadas en los lisosomas especializados de CTL y células NK 1. Los gránulos citotóxicos de estas células asesinas también contienen las proteínas de la membrana de alteración PFN y GNLY que se liberan simultáneamente con los Gzms en el reconocimiento de una célula diana destinada para la eliminación de 2,3. Hay cinco Gzms en humanos (GzmA, B, H, K y M), y 10 Gzms en ratones (GzmA - G, K, M y N). GzmA y GzmB son los más abundantes y ampliamente estudiado en seres humanos y ratones 1. Sin embargo, estudios más recientes han comenzado a investigar las vías de muerte celular, así como los efectos biológicos adicionales mediadas por los otros llamados Gzms, huérfanos en la salud y la enfermedad 4. La función mejor conocida de las Gzms, en particular de GzmA y GzmB, es la inducción de la muerte celular programada en células de mamíferos cuando se entrega en las células diana por PFN 5,6. Sin embargo, Estudios más recientes también demostraron efectos extracelulares de los Gzms con profundo impacto en la regulación inmune y la inflamación, independientemente de la entrega citosólica por PFN 7,8. El espectro de las células que mueren de manera eficiente después de la entrada citosólica de las Gzms también fue recientemente se amplió a partir de células de mamíferos a las bacterias 9,10 e incluso ciertos parásitos 11. Estos recientes descubrimientos abrieron un campo completamente nuevo para los investigadores GZM. Por lo tanto, un sistema de expresión de mamíferos de alto rendimiento rentable aliviará significativamente el camino para los estudios futuros. Humanos, de ratón y de rata Gzms nativos se han purificado con éxito de la fracción de gránulos de CTL y NK células líneas 12-14. Sin embargo, en nuestras manos el rendimiento de tales técnicas de purificación está en el intervalo de menos de 0,1 mg / L de cultivo celular (observación no publicada y 12). Además, la resolución cromatográfica de un solo Gzm sin contaminación por other Gzms y / o proteínas que también están presentes en los gránulos es un reto (datos no publicados y 12,14). Gzms recombinantes se producen en bacterias, levaduras 15 16, células de insecto y en 17 incluso en las células de mamífero tales como HEK 293 18,19. Sólo los sistemas de expresión de mamífero tienen el potencial de producir enzimas recombinantes con modificaciones postraduccionales idéntica a la proteína citotóxica nativo. Modificaciones postraduccionales han sido implicados con la captación específica por endocitosis y la localización intracelular de la proteasa dentro de las células diana 20-22. Por lo tanto, mediante el uso de pHLsec 23 (una especie de regalo de Radu Aricescu e Yvonne Jones, de la Universidad de Oxford, Reino Unido) como la columna vertebral plásmido para la expresión Gzm, establecimos un sistema simple, tiempo y costo eficiente para la producción de proteínas de alto rendimiento en células HEK293T. pHLsec combina un promotor de CMV con un promotor-Β-actina de pollo; En conjunto, estos elementos demostrated el más fuerte promotor de la actividad en diversas líneas celulares 24. Además, el plásmido contiene un intrón de conejo Β-globina, señales de secreción y Kozak optimizada, una Lys-6xHis-tag y un poli-A de la señal. Los insertos se pueden clonar convenientemente entre la señal de secreción y la 6xHis-Lys-tag (Figura 1) asegurar la expresión óptima y eficacia de secreción para proteínas que carecen de dominios N-terminales apropiados. Para la expresión de los Gzms, que sustituye la secuencia señal de secreción endógena con la señal de secreción proporcionada por el vector seguido por una enteroquinasa (EK) sitio (DDDDK), de modo que el tratamiento EK activado el Gzms secretadas (Gzms activos comenzar con el N-terminal secuencia de aminoácidos IIGG 25). Adicionalmente a favor de este método, las células HEK293T crecen rápidamente en un medio de bajo precio, como medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), y son muy adecuadas para el método de transfección de fosfato de calcio rentable.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-026</td>
			<td>Total RNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14571C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enterokinase from bovine intestine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4906</td>
			<td>recombinant, &#8805;20&#160;units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap Excel 5ml-column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-3712-06&#160;</td>
			<td>Nickel IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap SP HP 5 ml-column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1152-01&#160;</td>
			<td>S column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-&#945;-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3647</td>
			<td>GzmA substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2193608 _10mg</td>
			<td>GzmB substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL)</td>
			<td>Bachem</td>
			<td></td>
			<td>GzmM substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,5&#8242;-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8130</td>
			<td>Ellman`s reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high yield and cost-efficient expression system of human granzymes in mammalian cells

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their cytotoxic granule content to eliminate the target cells and the intracellular pathogen. Death of the host cells and intracellular pathogens is triggered by the granule serine proteases, granzymes (Gzms), delivered into the host cell cytosol by the pore forming protein perforin (PFN) and into bacterial pathogens by the prokaryotic membrane disrupting protein granulysin (GNLY). To investigate the molecular mechanisms of target cell death mediated by the Gzms in experimental in-vitro settings, protein expression and purification systems that produce high amounts of active enzymes are necessary. Mammalian secreted protein expression systems imply the potential to produce correctly folded, fully functional protein that bears posttranslational modification, such as glycosylation. Therefore, we used a cost-efficient calcium precipitation method for transient transfection of HEK293T cells with human Gzms cloned into the expression plasmid pHLsec. Gzm purification from the culture supernatant was achieved by immobilized nickel affinity chromatography using the C-terminal polyhistidine tag provided by the vector. The insertion of an enterokinase site at the N-terminus of the protein allowed the generation of active protease that was finally purified by cation exchange chromatography. The system was tested by producing high levels of cytotoxic human Gzm A, B and M and should be capable to produce virtually every enzyme in the human body in high yields.

En la siguiente sección vamos a presentar una documentación completa de un preparado GzmA para iluminar el método. También nos purificamos éxito GzmB y GzmM, produciendo resultados similares en cuanto a la eficiencia y la actividad de la purificación. Sin embargo, a partir de las preparaciones posteriores sólo mostraremos algunas piezas seleccionadas de datos. Preparaciones GzmB a partir de células 293T siguiendo el protocolo actual se utilizaron en varios estudios publicados, destacando su actividad en diversos...

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A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells

We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease.

Un alto rendimiento y sistema de expresión de costo-eficiente de granzimas humanos en células de mamífero

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their ...

a-high-yield-cost-efficient-expression-system-human-granzymes

Research

JoVE Journal

Biology

9.6K vistas.  Boston Children’s Hospital and Harvard Medical School. We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease. 