This work was supported by grants from the Novartis Foundation for Medical-Biological Research and from the Research Pool of the University of Fribourg (to MW). We thank Li Zhao, Zhan Xu, and Solange Kharoubi Hess for technical support, as well as Radu Aricescu and Yvonne Jones (Oxford University, UK) for providing the pHLsec plasmid, and Thomas Sch&#252;rpf (Harvard Medical School) for helpful discussions.

1. Production du plasmide d&#39;expression pHLsec-GZM <ol><li> Préparation de l&#39;ARN total à partir de cellules NK humaines (cellules primaires préparées comme dans 26 ou la lignée de cellules NK NK-92 exprimant les cinq Gzms humaines) en utilisant un procédé d&#39;isolement d&#39;ARN appropriée et transcription inverse en utilisant un premier brin kit ADNc de synthétiser la suite de la manufacturer` s recommandations. Amplifier GZM ADNc par PCR et clone dans pHLsec comme décrit dans 23 (don genre de Radu Aricescu et Yvonne Jones, Université d&#39;Oxford, Royaume-Uni) en utilisant les sites Agel et Kpnl (Figure 1). REMARQUE: Utilisez les amorces suivantes indiquées dans le tableau 1. </li><li> Confirmez inserts correctes par séquençage. Développez les plasmides d&#39;expression dans des cellules DH5a et purifier en utilisant un kit d&#39;isolement de plasmide libre endotoxine et suivez les instructions du fabricant. </li><li> Reprendre les plasmides purifiés dans de l&#39;eau stérile sans endotoxine à une concentration de 2 mg / ml et conserver à -20 ° C until utilisation. </li></ol> 2. Expression de Gzms dans des cellules HEK293T <ol><li> Préparation des réactifs <ol><li> Préparer le milieu de culture standard. Pour milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant taux élevé de glucose (25 mM), Glutamax (4 mM), du pyruvate de sodium (1 mM) ajouter 10% de sérum standard de veau foetal (FCS), la pénicilline (100 unités / ml), la streptomycine ( 100 ug / ml). </li><li> Préparer milieu de transfection. Pour milieu de culture sans pénicilline-streptomycine ajouter 25 pg / ml chloroquine (ajouter fraîchement sur le jour de la transfection de 1,000x stocks dans PBS, stockés à -20 ° C). </li><li> Préparer un milieu de culture exempt de sérum: A un milieu sans sérum pour cellules HEK293 ajouter de la glutamine (4 mM), de la pénicilline (100 unités / ml), streptomycine (100 ug / ml), et 2,5 mg / L de l&#39;amphotéricine B. </li><li> Préparer les solutions décrites dans le tableau 2 et le filtre avec un filtre de 0,45 um avant utilisation: </li></ol></li><li> Expansion des cellules HEK293T <ol><li> Cultiver les cellules HEK293T dans 20 ml culteSupport d&#39;ure utilisant 150 x 25 mm boîtes de culture de tissu. </li><li> Cellules Split à 80% de confluence (split-ratio de 1: 4, généralement tous les 3 ème jour). Cellules attachent vaguement, ils peuvent être détachés mécaniquement sans traitement à la trypsine par pipetage rigoureusement haut et en bas. </li><li> cellules de la plaque avant la transfection nuit pour donner 60 à 70% de confluence au jour de la transfection (densité d&#39;ensemencement ~ 2 x 10 5 cellules / ml). Une taille de la préparation habituelle consiste de 20 à 25 boîtes de culture. </li></ol></li><li> La transfection au phosphate de calcium <ol><li> 1 h avant la transfection, remplacer le milieu de culture standard à 20 ml de milieu de transfection. Près de la fin de cette étape d&#39;incubation de 1 heure, mélanger 400 ug d&#39;ADN plasmidique avec 10,95 ml ddH 2 0 et 1,55 ml de 2M CaCl2 en tubes de 50 ml (1 tube / 5 plats). </li><li> 1 à 2 min avant la transfection, ajouter 12,5 ml 2x HBS à 12,5 ml de la solution ADN-Calcium, mélanger par inversion des tubes et incuber pendant 30 secondes à la température ambiante. </li><li> Ajouter èmee mélange préparé en 2.3.2 directement aux cellules (5 ml par boîte), goutte à goutte dans le milieu. Saupoudrer uniformément sur toute la surface, en tournant le support à une couleur légèrement orangée. </li><li> Incuber les boîtes de culture de 7 à 11 h dans un incubateur de culture de tissu (37 ° C, 5% de CO2 dans de l&#39;air humidifié). Après l&#39;incubation, une amende précipité est visible. Retirez le milieu de transfection, rincer soigneusement préchauffé PBS et ajouter 20 ml de milieu de culture sans sérum préparé à 2.1.3. Incuber pendant 72 heures dans un incubateur de culture de tissu. </li><li> Analyser l&#39;efficacité de transfection et l&#39;expression par l&#39;exécution d&#39;un échantillon (~ 20 ul) du surnageant de cellule sur SDS-PAGE et coloration avec du bleu brillant de Coomassie pour visualiser une bande de granzyme. </li></ol></li><li> Purification de Gzms de surnageant de culture par Nickel-IMAC <ol><li> Après l&#39;incubation, décanter le surnageant de culture de cellules dans 250 ml tubes et claire par centrifugation. Effectuer une première rotation (400 xg, 10 min, 4 °C) qui va effacer le milieu à partir des cellules individuelles. Transférer le surnageant dans fraîches 250 ml tubes et tournent à 4000 g, 30 min à 4 ° C pour éliminer les débris de cellules restant. </li><li> Ajouter 5 ml de NaCl 5 M, 6,25 ml de 2 M de Tris-Base (pH 8) et 1 ml de 0,25 M NiSO 4 par 250 ml de surnageant clarifié. Filtrer le surnageant à l&#39;aide d&#39;une unité de filtration sous vide de 500 ml (0,45 mm). </li><li> Equilibrer une colonne nickel-IMAC avec Sa liaison tampon A (10 volumes de colonne, CV) en utilisant un système FPLC approprié. </li><li> Appliquer le surnageant clarifié à la colonne équilibrée à un débit de 0,5 ml / min à 4 ° C. </li><li> Après le surnageant a été appliqué, colonne de lavage avec Sa liaison tampon jusqu&#39;à ce que l&#39;absorbance UV de référence est atteint (généralement 10 CV). </li><li> Gzms éluées avec un gradient de 20 ml-linéaire (0 à 250 mM imidazole) à un débit de 0,5 ml / min tout en recueillant des fractions de 2 ml. Analyser les fractions d&#39;élution par SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie. </li></ol></li><li> Enterokinase (EK)le traitement et le nettoyage final par Chromatographie d&#39;échange de cations <ol><li> Piscine GZM fractions contenant dans un tube de dialyse MWCO avec ≤10. Stocker un petit échantillon à -20 ° C que le contrôle pré-EK. </li><li> Ajouter EK à 0,02 unité / ml de 50 surnageant initial directement à la fraction groupée dans le tube de dialyse et dialyse O / N (au moins 16 heures) à la température ambiante dans EK-tampon (4 L, le changement tampon une fois). </li><li> Le lendemain, analyser EK Gzms traitée par rapport à la pré-EK contrôle par SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie. </li><li> Lorsque le traitement N-terminal est terminée, modifier un tampon de dialyse à tampon A S (4 L) et on dialyse pendant 4 heures à température ambiante. Filtre dialysat (0,45 um). </li><li> Équilibrer une colonne S-S avec du tampon de l&#39;échantillon A. charger sur la colonne avec à un débit de 0,5 ml / min à 4 ° C. </li><li> Après chargement de l&#39;échantillon, laver la colonne avec le tampon de S A jusqu&#39;à ce que la ligne de base UV absorbance est atteint (environ 10 CV). Éluer les Gzms avec un gradient linéaire de 30 ml (150 à 1 000 mM de NaCl). GZMA eluths à ~ 650 mM de NaCl, GZMB à ~ 700 mM de NaCl et GzmM à ~ 750 mM de NaCl. </li><li> Analyser élution fractions par SDS-PAGE et essais colorimétriques (voir ci-dessous). Piscine fractions contenant Gzms et concentré (environ 30 fois, à une concentration d&#39;environ 100 pM) dans les filtres de rotation (15 ml, 10 MWCO). Aliquoter les préparatifs GZM concentrés et conserver à -80 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Test de l&#39;activité GZM <ol><li> Préparation des réactifs <ol><li> Préparer le tampon de dosage colorimétrique: 50 mM de Tris-Base, pH 7. <ol><li> Pour la mesure de GZMA, ajouter Na-CBZ-L-Lysine thiobenzyle ester (S-Bzl) (BLT) pour le tampon d&#39;essai à une concentration finale de 0,2 mM et 5,5&#39;-dithio-bis (acide 2-nitrobenzoïque) (DTNB) à une concentration de 0,22 mM. Pour GZMB, inclure 0,2 mM Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) et 0,22 mM DTNB. Pour GzmM, y compris 0,2 mM de Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (pNA) (AAPL). Les peptides synthétiques sont ajoutés à partir de solutions d&#39;achat d&#39;actions appropriées (dans le DMSO, stored à -20 ° C) dans la mémoire tampon fraîchement avant l&#39;essai. </li></ol></li><li> Préparer le tampon de dosage de clivage: 100 mM de NaCl, 50 mM de Tris-Base, pH 7,5 </li></ol></li><li> Dosages colorimétriques <ol><li> Distribuez de petits échantillons GZM (&lt;5 pi) de fractions d&#39;élution ou des stocks concentrés dans les plaques à 96 puits à fond plat. Inclure un contrôle positif (GZM préparations testées ou brut lysats de cellules NK) et un contrôle négatif (tampon seulement). </li><li> Ajouter 100 ul de tampon de dosage à chaque puits (à l&#39;aide d&#39;une pipette multi-canaux). Incuber pendant 10 min à 37 ° C. Mesurer la DO à 405 nm dans un lecteur de microplaques. </li></ol></li><li> Dosage Décolleté <ol><li> Pour les essais de clivage à l&#39;aide de substrats purifiés, co-incuber un substrat protéique (native ou recombinante, de 100 à 400 nM; quelques exemples de substrats de GZM efficaces sont présentés dans la section de résultat et à la note à la fin de cette section) avec des dilutions en série d&#39;un GZM (à partir de 400 nM) dans du tampon analytique pour différents moments.Analyse par SDS-PAGE et coloration à l&#39;argent ou au bleu de Coomassie; ou par Western blot en utilisant des anticorps spécifiques. </li><li> Pour les essais de clivage à l&#39;aide de lysats de cellules, de suspendre 10 6 cellules HeLa (ou toute lignée cellulaire de tumeur disponible) dans 1 ml de tampon de dosage et lyse par congélation dans un / bain de glace sèche de l&#39;éthanol et décongélation à 37 ° C trois fois. Éliminer les débris cellulaires par centrifugation (15 000 xg pendant 10 min à 4 ° C). </li><li> Co-incuber le lysat clarifié avec Gzms à diverses concentrations et heures ci-dessus. Le clivage est détecté par immunotransfert en utilisant des anticorps appropriés. NOTE: Quelques exemples de substrats de bonne foi pour laquelle les anticorps commerciaux sont disponibles: Offre (BH3-interaction agoniste domaine de mort) et de la caspase 3 clivée par GZMB 27,28; plusieurs ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes (hnRNPA1, A2 et U) clivées par GZMA 29; cytomégalovirus phosphoprotéine 71 par GzmM 30. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Chowdhury, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+by+a+thousand+cuts:+granzyme+pathways+of+programmed+cell+death.">Death by a thousand cuts: granzyme pathways of programmed cell death.</a> Annu Rev Immunol. 26, 389-420 (2008).</li><li>Thiery, J., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin:+a+key+pore-forming+protein+for+immune+control+of+viruses+and+cancer.">Perforin: a key pore-forming protein for immune control of viruses and cancer.</a> Subcell Biochem. 80, 197-220 (2014).</li><li>Krensky, A. M., Clayberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+clinical+relevance+of+granulysin.">Biology and clinical relevance of granulysin.</a> Tissue Antigens. 73, 193-198 (2009).</li><li>Bovenschen, N., Kummer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orphan+granzymes+find+a+home.">Orphan granzymes find a home.</a> Immunol Rev. 235, 117-127 (2010).</li><li>Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granzyme+A+activates+another+way+to+die.">Granzyme A activates another way to die.</a> Immunol Rev. 235, 93-104 (2010).</li><li>Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quarter+century+of+granzymes.">A quarter century of granzymes.</a> Cell death and differentiation. 19, 28-35 (2012).</li><li>Hiebert, P. R., Granville, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granzyme+B+in+injury,+inflammation,+and+repair.">Granzyme B in injury, inflammation, and repair.</a> Trends Mol Med. 18, 732-741 (2012).</li><li>Afonina, I. S., Cullen, S. P., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+and+non-cytotoxic+roles+of+the+CTL/NK+protease+granzyme.">Cytotoxic and non-cytotoxic roles of the CTL/NK protease granzyme.</a> B. Immunol Rev. 235, 105-116 (2010).</li><li>Walch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+cells+kill+intracellular+bacteria+through+granulysin-mediated+delivery+of+granzymes.">Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes.</a> Cell. 157, 1309-1323 (2014).</li><li>Lee, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells+act+as+an+extravascular+cytotoxic+barrier+for+joint-invading+Lyme+Borrelia.">Invariant natural killer T cells act as an extravascular cytotoxic barrier for joint-invading Lyme Borrelia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).</li><li>Kapelski, S., de Almeida, M., Fischer, R., Barth, S., Fendel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimalarial+activity+of+granzyme+B+and+its+targeted+delivery+by+a+granzyme+B-scFv+fusion+protein.">Antimalarial activity of granzyme B and its targeted delivery by a granzyme B-scFv fusion protein.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2014).</li><li>Thiery, J., Walch, M., Jensen, D. K., Martinvalet, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cytotoxic+T+cell+and+NK+granules+and+purification+of+their+effector+proteins.">Isolation of cytotoxic T cell and NK granules and purification of their effector proteins.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit3 37), (2010).</li><li>Shi, L., Yang, X., Froelich, C. J., Greenberg, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+use+of+granzyme+B.">Purification and use of granzyme B.</a> Methods Enzymol. 322, 125-143 (2000).</li><li>Masson, D., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+of+serine+esterases+in+lytic+granules+of+cytolytic+T+lymphocytes.">A family of serine esterases in lytic granules of cytolytic T lymphocytes.</a> Cell. 49, 679-685 (1987).</li><li>Lorentsen, R. H., Fynbo, C. H., Thogersen, H. C., Etzerodt, M., Holtet, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+refolding,+and+purification+of+recombinant+human+granzyme+B.">Expression, refolding, and purification of recombinant human granzyme B.</a> Protein Expr Purif. 39, 18-26 (2005).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+recombinant+human+granzyme+B+from+Pichia+pastoris.">Expression and purification of recombinant human granzyme B from Pichia pastoris.</a> Biochem Biophys Res Commun. 261, 251-255 (1999).</li><li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+enzymatically+active+recombinant+granzyme+B+in+a+baculovirus+system.">Expression and purification of enzymatically active recombinant granzyme B in a baculovirus system.</a> Biochem Biophys Res Commun. 243, 384-389 (1998).</li><li>Stahnke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granzyme+B-H22(scFv),+a+human+immunotoxin+targeting+CD64+in+acute+myeloid+leukemia+of+monocytic+subtypes.">Granzyme B-H22(scFv), a human immunotoxin targeting CD64 in acute myeloid leukemia of monocytic subtypes.</a> Mol Cancer Ther. 7, 2924-2932 (2008).</li><li>Gehrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+expression+and+purification+system+for+the+production+of+enzymatic+and+biologically+active+human+granzyme.">A novel expression and purification system for the production of enzymatic and biologically active human granzyme.</a> B. J Immunol Methods. 371, 8-17 (2011).</li><li>Metkar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+cell+granule-mediated+apoptosis:+perforin+delivers+granzyme+B-serglycin+complexes+into+target+cells+without+plasma+membrane+pore+formation.">Cytotoxic cell granule-mediated apoptosis: perforin delivers granzyme B-serglycin complexes into target cells without plasma membrane pore formation.</a> Immunity. 16, 417-428 (2002).</li><li>Motyka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mannose+6-phosphate/insulin-like+growth+factor+II+receptor+is+a+death+receptor+for+granzyme+B+during+cytotoxic+T+cell-induced+apoptosis.">Mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor is a death receptor for granzyme B during cytotoxic T cell-induced apoptosis.</a> Cell. 103, 491-500 (2000).</li><li>Pinkoski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+and+trafficking+of+granzyme+B+in+target+cells+during+granzyme+B-perforin-mediated+apoptosis.">Entry and trafficking of granzyme B in target cells during granzyme B-perforin-mediated apoptosis.</a> Blood. 92, 1044-1054 (1998).</li><li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells.">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).</li><li>Fukuchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+assays+of+nine+heterogeneous+promoters+in+neural+and+other+cultured+cells.">Activity assays of nine heterogeneous promoters in neural and other cultured cells.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30 A, 300-305 (1994).</li><li>Tran, T. V., Ellis, K. A., Kam, C. M., Hudig, D., Powers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dipeptidyl+peptidase+I:+importance+of+progranzyme+activation+sequences,+other+dipeptide+sequences,+and+the+N-terminal+amino+group+of+synthetic+substrates+for+enzyme+activity.">Dipeptidyl peptidase I: importance of progranzyme activation sequences, other dipeptide sequences, and the N-terminal amino group of synthetic substrates for enzyme activity.</a> Arch Biochem Biophys. 403, 160-170 (2002).</li><li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion,+purification,+and+functional+assessment+of+human+peripheral+blood+NK+cells.">Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li><li>Barry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granzyme+B+short-circuits+the+need+for+caspase+8+activity+during+granule-mediated+cytotoxic+T-lymphocyte+killing+by+directly+cleaving+Bid.">Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid.</a> Mol Cell Biol. 20, 3781-3794 (2000).</li><li>Darmon, A. J., Nicholson, D. W., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+apoptotic+protease+CPP32+by+cytotoxic+T-cell-derived+granzyme+B.+.">Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme B. .</a> Nature. 377, 446-448 (1995).</li><li>Rajani, D. K., Walch, M., Martinvalet, D., Thomas, M. P., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+RNA+processing+during+immune-mediated+programmed+cell+death.">Alterations in RNA processing during immune-mediated programmed cell death.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8688-8693 (2012).</li><li>Domselaar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncytotoxic+inhibition+of+cytomegalovirus+replication+through+NK+cell+protease+granzyme+M-mediated+cleavage+of+viral+phosphoprotein+71.">Noncytotoxic inhibition of cytomegalovirus replication through NK cell protease granzyme M-mediated cleavage of viral phosphoprotein 71.</a> J Immunol. 185, 7605-7613 (2010).</li><li>Thiery, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin+activates+clathrin-+and+dynamin-dependent+endocytosis,+which+is+required+for+plasma+membrane+repair+and+delivery+of+granzyme+B+for+granzyme-mediated+apoptosis.">Perforin activates clathrin- and dynamin-dependent endocytosis, which is required for plasma membrane repair and delivery of granzyme B for granzyme-mediated apoptosis.</a> Blood. 115, 1582-1593 (2010).</li><li>Thiery, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin+pores+in+the+endosomal+membrane+trigger+the+release+of+endocytosed+granzyme+B+into+the+cytosol+of+target+cells.">Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells.</a> Nat Immunol. 12, 770-777 (2011).</li><li>Thomas, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+protease+binding+to+nucleic+acids+promotes+nuclear+localization+and+cleavage+of+nucleic+acid+binding+proteins.">Leukocyte protease binding to nucleic acids promotes nuclear localization and cleavage of nucleic acid binding proteins.</a> J Immunol. 192, 5390-5397 (2014).</li><li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granzyme+B-induced+mitochondrial+ROS+are+required+for+apoptosis.">Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis.</a> Cell death and differentiation. , (2014).</li><li>Kummer, J. A., Kamp, A. M., Citarella, F., Horrevoets, A. J., Hack, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+human+recombinant+granzyme+A+zymogen+and+its+activation+by+the+cysteine+proteinase+cathepsin+C.">Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C.</a> The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).</li><li>Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+colorimetric+assay+that+specifically+measures+Granzyme+B+proteolytic+activity:+hydrolysis+of+Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl.">A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419 (2014).</li><li>Huang, M. T., Gorman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intervening+sequences+increase+efficiency+of+RNA+3'+processing+and+accumulation+of+cytoplasmic+RNA.">Intervening sequences increase efficiency of RNA 3' processing and accumulation of cytoplasmic RNA.</a> Nucleic Acids Res. 18, 937-947 (1990).</li><li>Luthman, H., Magnusson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+polyoma+DNA+transfection+of+chloroquine+treated+cells.">High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308 (1983).</li><li>Magee, A. I., Grant, D. A., Hermon-Taylor, J., Offord, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+one-stage+method+for+assay+of+enterokinase+activity+by+release+of+radiolabelled+activation+peptides+from+alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen+and+the+effect+of+calcium+ions+on+the+enzyme+activity.">Specific one-stage method for assay of enterokinase activity by release of radiolabelled activation peptides from alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen and the effect of calcium ions on the enzyme activity.</a> Biochem J. 197, 239-244 (1981).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Le rôle classique et d&#39;études approfondies et de GZMA GZMB est l&#39;induction de l&#39;apoptose dans des cellules de mammifères après leur livraison cytosolique de la protéine formant des pores PFN 1. Récemment, le spectre des Gzms cytotoxique a été élargi de façon significative à partir de cellules de mammifères à 9,10 bactéries, ainsi qu&#39;à 11 certains parasites. En outre, les fonctions, extracellulaires non-classiques de GZMA et GZMB ainsi que la signification b...

Les Gzms sont une famille de serine proteases homologues fortement localisées dans les lysosomes spécialisées des CTL et les cellules NK 1. Les granules cytotoxiques de ces cellules tueuses contiennent également des protéines de la membrane perturbateurs PFN et GNLY qui sont libérés simultanément avec les Gzms lors de la reconnaissance d&#39;une cellule cible destiné à l&#39;élimination 2,3. Il existe cinq Gzms chez l&#39;homme (GZMA, B, H, K et M), et 10 chez des souris (Gzms GZMA - G, K, M et N). GZMA et GZMB sont les plus abondants et largement étudiés chez l&#39;homme et la souris 1. Cependant, des études plus récentes ont commencé à enquêter sur les voies de mort cellulaire ainsi que les effets biologiques supplémentaires induits par les autres, soi-disant Gzms orphelins de la santé et de la maladie 4. La fonction la plus connue des Gzms, en particulier de GZMA et GZMB, est l&#39;induction de la mort cellulaire programmée dans des cellules de mammifère lorsqu&#39;elle est remise dans les cellules cibles par PFN 5,6. Pourtant, Des études plus récentes ont également démontré des effets extracellulaires des Gzms avec un impact profond sur la réglementation et l&#39;inflammation immunitaire, indépendamment de livraison cytosolique par PFN 7,8. Le spectre de cellules qui sont tuées efficacement cytosolique après l&#39;entrée des Gzms a également été récemment élargie à partir de cellules de mammifères à des bactéries et même 9,10 11 certains parasites. Ces découvertes récentes ont ouvert un nouveau champ pour les chercheurs GZM. Par conséquent, un, à haut rendement système d&#39;expression mammalien rentable solution va considérablement faciliter la voie à ces études futures. Gzms natives humaines, de souris et de rat ont été purifiés avec succès à partir de la fraction de granulés de CTL et NK lignées cellulaires 14/12. Cependant, dans les mains, le rendement de ces techniques de purification est dans la gamme de culture inférieure à 0,1 mg / L de cellules (observation non publiée et 12). En outre, la résolution chromatographique d&#39;un seul GZM sans contamination par other Gzms et / ou des protéines qui sont également présentes dans les granules contestent (données non publiées et 12,14). Gzms recombinants ont été produites dans des bactéries, des levures 15 16, des cellules d&#39;insectes 17 et même dans des cellules de mammifères telles que HEK 293 18,19. Seuls les systèmes d&#39;expression de mammifères portent le potentiel de produire des enzymes recombinantes avec des modifications post-traductionnelles identiques à la protéine native cytotoxique. Modifications post-traductionnelles ont été impliqués avec l&#39;absorption spécifique par endocytose et la localisation intracellulaire de la protease dans les cellules cibles de 20 à 22. Par conséquent, en utilisant pHLsec 23 (un cadeau genre de Radu Aricescu et Yvonne Jones, Université d&#39;Oxford, Royaume-Uni) comme l&#39;épine dorsale de plasmide pour l&#39;expression GZM, nous avons établi un système simple, rapide et économique efficace pour la production de protéines à haut rendement dans des cellules HEK293T. pHLsec combine un activateur de CMV avec un promoteur de poulet Β-actine; Ensemble, ces éléments démonstrationsted la plus forte activité de promoteur dans diverses lignées cellulaires 24. En outre, le plasmide contient un Β-globine de lapin intron, des signaux de sécrétion et de Kozak optimisée, une 6xHis-tag-Lys et un signal poly-A. Les inserts peuvent être clonées idéalement entre le signal de sécrétion et la-6xHis-tag Lys (Figure 1) assurer une expression optimale et l&#39;efficacité de la sécrétion de protéines dépourvues appropriées domaines N-terminaux. Pour l&#39;expression des Gzms, nous avons remplacé la séquence signal de sécrétion endogène avec le signal de sécrétion fournie par le vecteur suivie par une entérokinase (EK) place (DDDDK) afin que le traitement EK activé le Gzms sécrétées (Gzms actifs commencer par la N-terminal séquence d&#39;acides aminés IIGG 25). De plus en faveur de cette méthode, les cellules HEK293T se développent rapidement en basse à prix moyen, comme milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), et sont bien adaptés pour la méthode de transfection au phosphate de calcium rentable.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-026</td>
			<td>Total RNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14571C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enterokinase from bovine intestine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4906</td>
			<td>recombinant, &#8805;20&#160;units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap Excel 5ml-column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-3712-06&#160;</td>
			<td>Nickel IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap SP HP 5 ml-column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1152-01&#160;</td>
			<td>S column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-&#945;-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3647</td>
			<td>GzmA substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2193608 _10mg</td>
			<td>GzmB substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL)</td>
			<td>Bachem</td>
			<td></td>
			<td>GzmM substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,5&#8242;-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8130</td>
			<td>Ellman`s reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high yield and cost-efficient expression system of human granzymes in mammalian cells

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their cytotoxic granule content to eliminate the target cells and the intracellular pathogen. Death of the host cells and intracellular pathogens is triggered by the granule serine proteases, granzymes (Gzms), delivered into the host cell cytosol by the pore forming protein perforin (PFN) and into bacterial pathogens by the prokaryotic membrane disrupting protein granulysin (GNLY). To investigate the molecular mechanisms of target cell death mediated by the Gzms in experimental in-vitro settings, protein expression and purification systems that produce high amounts of active enzymes are necessary. Mammalian secreted protein expression systems imply the potential to produce correctly folded, fully functional protein that bears posttranslational modification, such as glycosylation. Therefore, we used a cost-efficient calcium precipitation method for transient transfection of HEK293T cells with human Gzms cloned into the expression plasmid pHLsec. Gzm purification from the culture supernatant was achieved by immobilized nickel affinity chromatography using the C-terminal polyhistidine tag provided by the vector. The insertion of an enterokinase site at the N-terminus of the protein allowed the generation of active protease that was finally purified by cation exchange chromatography. The system was tested by producing high levels of cytotoxic human Gzm A, B and M and should be capable to produce virtually every enzyme in the human body in high yields.

Dans la section suivante, nous allons présenter une documentation complète d&#39;une préparation GZMA pour éclairer la méthode. Nous avons également purifié succès GZMB et GzmM, produisant des résultats similaires en ce qui concerne l&#39;efficacité et l&#39;activité purification. Cependant, à partir de ces préparations plus tard nous ne montrer quelques morceaux choisis de données. Préparations GZMB à partir de cellules 293T en suivant le protocole actuel ont été utilisés dans plusieurs études publi...

Watch this Scientific Journal Video about A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells at JoVE.com

A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells

We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease.

Un rendement élevé et Expression System coût-efficace de granzymes humain dans des cellules de mammifères

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their ...

a-high-yield-cost-efficient-expression-system-human-granzymes

Research

JoVE Journal

Biology

9.6K vues.  Boston Children’s Hospital and Harvard Medical School. We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease. 