This work was supported by grants from the Novartis Foundation for Medical-Biological Research and from the Research Pool of the University of Fribourg (to MW). We thank Li Zhao, Zhan Xu, and Solange Kharoubi Hess for technical support, as well as Radu Aricescu and Yvonne Jones (Oxford University, UK) for providing the pHLsec plasmid, and Thomas Sch&#252;rpf (Harvard Medical School) for helpful discussions.

Sentezleme plasmidi pHLsec-Gzm 1. Üretim <ol><li> Insan NK hücrelerinden manufacturer` izlenerek uygun bir RNA izolasyon yöntemi ile ve bir birinci tür cDNA sentez kiti kullanılarak ters transkribe (26 ya da beş, insan Gzms ifade NK hücre hattı NK-92 gibi hazırlanmıştır birincil hücreler) ve toplam RNA&#39;nın hazırlanması s önerileri. 23 (Radu Aricescu Yvonne Jones, Oxford Üniversitesi, İngiltere tür bir hediye) &#39;de tarif edildiği gibi Gzm cDNA Agel ve Kpnl sitesi (Şekil 1) kullanılarak pHLsec PCR ve klon kullanılarak yükseltin. Not: Tablo 1 &#39;de gösterilen aşağıdaki primerler kullanın. </li><li> Dizileme ile doğru ekler onaylayın. DH5α hücrelerinde ifade plasmidlerini genişletin ve bir endotoksin içermeyen plazmid izolasyon kiti kullanılarak arındırmak ve üreticinin talimatlarına uyun. </li><li> Unti -20 ° C &#39;de 2 mg / ml ve saklamak bir konsantrasyonda endotoksin içermeyen, steril su içinde yeniden süspanse edilen saflaştırılmış plasmidler,l kullanımı. </li></ol> HEK293T hücrelerinde Gzms 2. İfade <ol><li> Reaktiflerin hazırlanması <ol><li> Standart kültür ortamı hazırlayın. Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) içeren, yüksek glikoz (25 mM), Glutamax (4 mM), sodyum piruvat (1 mM) (standart fetal buzağı serumu (FCS), penisilin (100 birim / ml), streptomisin ve% 10 ilave 100 ug / ml). </li><li> Transfeksiyon ortamı hazırlayın. Penisilin-Streptomisin olmayan kültür ortamına 25 ug / ml miktarında klorokuin katılımının (-20 ° C&#39;de saklanan PBS 1,000x hisse senetleri, gelen transfeksiyon gününde taze olarak ilave) ekleyin. </li><li> Serumsuz kültür ortamı hazırlayın: serumsuz ortam için HEK293 hücreleri glutamin (4 mM), penisilin (100 birim / ml), streptomisin (100 ug / ml) ve 2,5 mg / L amfoterisin B add </li><li> Kullanmadan önce, bir 0.45 um filtre ile Tablo 2 ve filtre açıklanan çözümler hazırlayın: </li></ol></li><li> HEK293T hücreleri genişletme <ol><li> 20 ml kült HEK293T hücreleri büyütün150 x 25 mm doku kültürü yemekleri kullanarak ure orta. </li><li> % 80 confluency Split hücreleri (1 split oranı: 4, genellikle her 3. gün). Hücreler gevşek mekanik olarak titizlikle yukarı ve aşağı pipetleme tripsinleme olmadan ayrılabilir, ekleyin. </li><li> Levha hücreleri, transfeksiyondan önceki gece transfeksiyonu (tohum ekme yoğunluğu ~ 2 x 10 5 hücre / ml) günde% 60-70 konfluense elde edildi. Bir zamanki hazırlık boyutu 20-25 kültür kaplarına oluşmaktadır. </li></ol></li><li> Kalsiyum-fosfat transfeksiyonu <ol><li> Transfeksiyondan önce 1 saat, 20 ml transfeksiyon ortamı, standart kültür ortamı değiştirin. Bu 1 saat inkübasyon aşamasının sonuna doğru, 10.95 mi GKD 2 0 ve 50 ml tüpler içinde 2M CaCl2 1.55 ml (1 tüp / 5 yemekler) ile plazmid DNA, 400 ug karıştırın. </li><li> 1 transfeksiyondan önce, en az 2, DNA-kalsiyum çözeltisinin 12.5 ml 12.5 mi 2x HBS ekleyin tüpler ters çevirme ile karıştırın ve oda sıcaklığında 30 saniye boyunca inkübe edilir. </li><li> Th ekleE karışımı doğrudan hücreleri (tabak başına 5 mi), damla damla ortama 2.3.2 hazırlandı. Biraz turuncu renk orta dönüm tüm alana eşit serpin. </li><li> Bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde 7-11 saat (37 ° C,% 5 nemlendirilmiş hava içinde CO2) için kültür kaplarına inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ince bir çökelti görülebilir. Önceden ısıtılmış PBS ile dikkatle yıkayın, transfeksiyon Ortamı çıkarın ve 2.1.3 hazırlanmış 20 mi serumsuz kültür ortamı ilave edin. Bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde 72 saat süreyle inkübe edilir. </li><li> SDS-PAGE üzerinde hücre yüzer bir numunesi (~ 20 ul) çalışan ve bir granzim bant görselleştirmek için Coomassie Brillant Blue ile soylara ile transfeksiyonu ve ekspresyonudur etkinliğini analiz edin. </li></ol></li><li> Nikel IMAC ile kültür süpernatanından Gzms saflaştırılması <ol><li> Kuluçkadan sonra, 250 ml tüpler içine hücre kültürü süpernatanları süzün ve santrifüj ile temiz. İlk bir spin yürütmek (400 xg, 10 dak, 4 °Müstakil hücrelerden orta silinir C). Kalan hücre debrisini uzaklaştırmak için 4 ° C sıcaklıkta 4000 x g&#39;de, 30 dakika taze 250 ml tüpler ve spin süpernatant aktarın. </li><li> 5 M NaCl 5 mi, temizlenmiş süpernatan, 250 ml başına 0.25 M N&#39;nin 4 6,25 2 M Tris-Base (pH 8) içinde çözdürülür ve 1 ml ilave edilir. 500 ml Vakum filtre ünitesi (0.45 mm) kullanılarak süpernatant süzün. </li><li> Uygun bir FPLC sistemi kullanılarak His-bağlama tamponu A (10 kolon hacim, CV) bir nikel-IMAC sütunu dengelenmesi. </li><li> 4 ° C de, 0.5 ml / dk&#39;lık bir akış oranında dengelenen kolona süpernatant uygulanır. </li><li> Süpernatan tatbik edilmesinden sonra UV emilimi temel (genellikle 10 CV) ulaşana kadar, His-bağlama tamponu ile kolondan yıkanır. </li><li> Elute Gzms 0.5 ml bir akış hızında doğrusal bir 20 ml&#39;lik gradyanı (0-250 mM imidazol) ile 2 ml / dakika-fraksiyonlar toplanırken. SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile elüsyon fraksiyonları analiz edin. </li></ol></li><li> Enterokinaz (EK)işleme ve katyon değişim kromatografisi ile son temizlik <ol><li> ≤10 MWCO bir dializ tüpü içinde kısımlar içeren havuz Gzm. Ön-EK kontrol olarak -20 ° C&#39;de küçük bir örnek saklayın. </li><li> Diyaliz tüpü içinde doğrudan toplanmış fraksiyonuna 0.02 birim / ilk süpernatan 50 ml EK ekleyin ve O / N EK-tampon maddesi içinde oda sıcaklığında (en az 16 saat) (4 L, bir kez değiştirme tamponu) diyaliz. </li><li> Ertesi gün, EK, SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile ön-EK kontrol ile karşılaştırıldığında Gzms tedavi analiz eder. </li><li> N-terminal işlem tamamlandığında, bir (4 L) tampon S diyaliz tamponu değiştirmek ve oda sıcaklığında bir 4 saat diyaliz. Filtre diyalizat (0.45 mikron). </li><li> 4 ° C de, 0.5 ml / dk&#39;lık bir akış oranında sütunun üzerinde örnek kuvveti S tampon maddesi A ile S-sütunu dengelenmesi. </li><li> UV absorbans taban (10 CV) ulaşılana kadar numunesi yüklemesinden sonra, S tampon A ile bir sütun yıkayın. 30 mi lineer gradyan (150 ila 1000 mM NaCI) ile Gzms yıkayın. GzmA E~ 750 mM NaCl&#39;de ~ 700 mM NaCI ve GzmM de ~ 650 mM NaCI, GzmB de dolgu maddeleri. </li><li> SDS-PAGE ve kolorimetrik analizler (aşağıya bakınız) ile elüsyon fraksiyonları analiz edin. Gzms ve konsantre içeren havuz kısımlar (yaklaşık 30 kat, 100 uM bir konsantrasyona kadar), eğirme filtresi (15 mi, 10 MWCO). -80 ° C &#39;de konsantre edilir Gzm preparatlar ve mağaza kısım. </li></ol></li></ol> 3. Test Gzm etkinliği <ol><li> Reaktiflerin hazırlanması <ol><li> 50 mM Tris-Base, pH 7: kolorimetrik deney tamponu hazırlayın. <ol><li> GzmA ölçülmesi için, 0.2 mM ve 5,5&#39;-ditiyo-bis (2-nitrobenzoik asit) &#39;in bir nihai konsantrasyona kadar deney tamponu Na-CBZ-L-lisin tiyobenzil ester (S-Bzl) (BLT) ekleyin 0.22 mM bir konsantrasyona kadar (DTNB). GzmB için, 0.2 mM Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) ve 0.22 mM DTNB bulunmaktadır. GzmM için, 0.2 mM Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilid (pNA) (AAPL) içerir. Sentetik peptidler DMSO içinde (uygun ana çözeltilerden ilave edilmiştir, stored taze tahlil önce tampon -20 ° C). </li></ol></li><li> Klivaj deneyi tamponu hazırlayın: 100 mM NaCI, 50 mM Tris-baz, pH 7.5 </li></ol></li><li> Kolorimetrik analizler <ol><li> 96-gözlü düz dipli plakalarda elüsyon fraksiyonları küçük Gzm örnekleri (&lt;5 ul) veya konsantre stok dağıtın. Bir pozitif kontrol (test edilen Gzm müstahzarlar ya da ham olarak NK hücre lizatları) ve bir negatif kontrol (sadece tampon) içerir. </li><li> (Bir çok kanallı pipet kullanarak) her bir oyuğa, deney tamponu içinde 100 ul ekle. 37 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edin. Mikroplaka okuyucu içinde 405 nm&#39;de OD&#39;yi ölçün. </li></ol></li><li> Klivaj deneyi <ol><li> Seri seyreltme ile; - saflaştırılmış maddeleri kullanarak bölünme tahlilleri için, (verimli Gzm yüzeylerde birkaç örnek bu bölümün sonundaki sonuç bölümünde ve notta sunulmuştur 400 nM doğal veya rekombinant, 100) bir protein substrat ko-inkübe Bir GZM çeşitli kez deney tamponu (400 nM&#39;de başlayarak).SDS-PAGE ve Coomassie ya da gümüş lekeleme ile analiz; ya da Batı spesifik antikorlar kullanılarak kurutma. </li><li> Hücre lizatları kullanılarak klivaj deneyleri için, 37 ° C olmak üzere üç kez, bir etanol / kuru buz banyosunda ve eritme dondurma ile deney tamponu ve parçalanmasıyla, 1 ml, 10 6 HeLa hücreleri (ya da herhangi bir uygun tümör hücre hattı) askıya. (4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 15,000 x g) santrifüj uygulanarak hücre kalıntıları uzaklaştırılmıştır. </li><li> Yukarıdaki gibi çeşitli konsantrasyonlarda ve zaman zaman Gzms ile temizlenir lizat Co-kuluçkaya yatmaktadır. Yarılma uygun antikorlar kullanılarak imünolekeleme ile tespit edilir. Not: iyi niyetli alt tabakalar bir kaç örnekleri ticari antikorlar mevcuttur: Teklif (BH3 etkileşen etki ölüm agonisti) ve GzmB 27,28 parçalanabilen kaspaz 3; GzmA 29 ile parçalanabilen çok heterojen bir çekirdek ribonükleoprotein (hnRNPA1, A2 ve U); GzmM 30 ile sitomegalovirüs phosphoprotein 71. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Chowdhury, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+by+a+thousand+cuts:+granzyme+pathways+of+programmed+cell+death.">Death by a thousand cuts: granzyme pathways of programmed cell death.</a> Annu Rev Immunol. 26, 389-420 (2008).</li><li>Thiery, J., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin:+a+key+pore-forming+protein+for+immune+control+of+viruses+and+cancer.">Perforin: a key pore-forming protein for immune control of viruses and cancer.</a> Subcell Biochem. 80, 197-220 (2014).</li><li>Krensky, A. M., Clayberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+clinical+relevance+of+granulysin.">Biology and clinical relevance of granulysin.</a> Tissue Antigens. 73, 193-198 (2009).</li><li>Bovenschen, N., Kummer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orphan+granzymes+find+a+home.">Orphan granzymes find a home.</a> Immunol Rev. 235, 117-127 (2010).</li><li>Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granzyme+A+activates+another+way+to+die.">Granzyme A activates another way to die.</a> Immunol Rev. 235, 93-104 (2010).</li><li>Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quarter+century+of+granzymes.">A quarter century of granzymes.</a> Cell death and differentiation. 19, 28-35 (2012).</li><li>Hiebert, P. R., Granville, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granzyme+B+in+injury,+inflammation,+and+repair.">Granzyme B in injury, inflammation, and repair.</a> Trends Mol Med. 18, 732-741 (2012).</li><li>Afonina, I. S., Cullen, S. P., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+and+non-cytotoxic+roles+of+the+CTL/NK+protease+granzyme.">Cytotoxic and non-cytotoxic roles of the CTL/NK protease granzyme.</a> B. Immunol Rev. 235, 105-116 (2010).</li><li>Walch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+cells+kill+intracellular+bacteria+through+granulysin-mediated+delivery+of+granzymes.">Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes.</a> Cell. 157, 1309-1323 (2014).</li><li>Lee, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells+act+as+an+extravascular+cytotoxic+barrier+for+joint-invading+Lyme+Borrelia.">Invariant natural killer T cells act as an extravascular cytotoxic barrier for joint-invading Lyme Borrelia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).</li><li>Kapelski, S., de Almeida, M., Fischer, R., Barth, S., Fendel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimalarial+activity+of+granzyme+B+and+its+targeted+delivery+by+a+granzyme+B-scFv+fusion+protein.">Antimalarial activity of granzyme B and its targeted delivery by a granzyme B-scFv fusion protein.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2014).</li><li>Thiery, J., Walch, M., Jensen, D. K., Martinvalet, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cytotoxic+T+cell+and+NK+granules+and+purification+of+their+effector+proteins.">Isolation of cytotoxic T cell and NK granules and purification of their effector proteins.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit3 37), (2010).</li><li>Shi, L., Yang, X., Froelich, C. J., Greenberg, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+use+of+granzyme+B.">Purification and use of granzyme B.</a> Methods Enzymol. 322, 125-143 (2000).</li><li>Masson, D., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+of+serine+esterases+in+lytic+granules+of+cytolytic+T+lymphocytes.">A family of serine esterases in lytic granules of cytolytic T lymphocytes.</a> Cell. 49, 679-685 (1987).</li><li>Lorentsen, R. H., Fynbo, C. H., Thogersen, H. C., Etzerodt, M., Holtet, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+refolding,+and+purification+of+recombinant+human+granzyme+B.">Expression, refolding, and purification of recombinant human granzyme B.</a> Protein Expr Purif. 39, 18-26 (2005).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+recombinant+human+granzyme+B+from+Pichia+pastoris.">Expression and purification of recombinant human granzyme B from Pichia pastoris.</a> Biochem Biophys Res Commun. 261, 251-255 (1999).</li><li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+enzymatically+active+recombinant+granzyme+B+in+a+baculovirus+system.">Expression and purification of enzymatically active recombinant granzyme B in a baculovirus system.</a> Biochem Biophys Res Commun. 243, 384-389 (1998).</li><li>Stahnke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granzyme+B-H22(scFv),+a+human+immunotoxin+targeting+CD64+in+acute+myeloid+leukemia+of+monocytic+subtypes.">Granzyme B-H22(scFv), a human immunotoxin targeting CD64 in acute myeloid leukemia of monocytic subtypes.</a> Mol Cancer Ther. 7, 2924-2932 (2008).</li><li>Gehrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+expression+and+purification+system+for+the+production+of+enzymatic+and+biologically+active+human+granzyme.">A novel expression and purification system for the production of enzymatic and biologically active human granzyme.</a> B. J Immunol Methods. 371, 8-17 (2011).</li><li>Metkar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+cell+granule-mediated+apoptosis:+perforin+delivers+granzyme+B-serglycin+complexes+into+target+cells+without+plasma+membrane+pore+formation.">Cytotoxic cell granule-mediated apoptosis: perforin delivers granzyme B-serglycin complexes into target cells without plasma membrane pore formation.</a> Immunity. 16, 417-428 (2002).</li><li>Motyka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mannose+6-phosphate/insulin-like+growth+factor+II+receptor+is+a+death+receptor+for+granzyme+B+during+cytotoxic+T+cell-induced+apoptosis.">Mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor is a death receptor for granzyme B during cytotoxic T cell-induced apoptosis.</a> Cell. 103, 491-500 (2000).</li><li>Pinkoski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+and+trafficking+of+granzyme+B+in+target+cells+during+granzyme+B-perforin-mediated+apoptosis.">Entry and trafficking of granzyme B in target cells during granzyme B-perforin-mediated apoptosis.</a> Blood. 92, 1044-1054 (1998).</li><li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells.">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).</li><li>Fukuchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+assays+of+nine+heterogeneous+promoters+in+neural+and+other+cultured+cells.">Activity assays of nine heterogeneous promoters in neural and other cultured cells.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30 A, 300-305 (1994).</li><li>Tran, T. V., Ellis, K. A., Kam, C. M., Hudig, D., Powers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dipeptidyl+peptidase+I:+importance+of+progranzyme+activation+sequences,+other+dipeptide+sequences,+and+the+N-terminal+amino+group+of+synthetic+substrates+for+enzyme+activity.">Dipeptidyl peptidase I: importance of progranzyme activation sequences, other dipeptide sequences, and the N-terminal amino group of synthetic substrates for enzyme activity.</a> Arch Biochem Biophys. 403, 160-170 (2002).</li><li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion,+purification,+and+functional+assessment+of+human+peripheral+blood+NK+cells.">Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li><li>Barry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granzyme+B+short-circuits+the+need+for+caspase+8+activity+during+granule-mediated+cytotoxic+T-lymphocyte+killing+by+directly+cleaving+Bid.">Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid.</a> Mol Cell Biol. 20, 3781-3794 (2000).</li><li>Darmon, A. J., Nicholson, D. W., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+apoptotic+protease+CPP32+by+cytotoxic+T-cell-derived+granzyme+B.+.">Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme B. .</a> Nature. 377, 446-448 (1995).</li><li>Rajani, D. K., Walch, M., Martinvalet, D., Thomas, M. P., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+RNA+processing+during+immune-mediated+programmed+cell+death.">Alterations in RNA processing during immune-mediated programmed cell death.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8688-8693 (2012).</li><li>Domselaar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncytotoxic+inhibition+of+cytomegalovirus+replication+through+NK+cell+protease+granzyme+M-mediated+cleavage+of+viral+phosphoprotein+71.">Noncytotoxic inhibition of cytomegalovirus replication through NK cell protease granzyme M-mediated cleavage of viral phosphoprotein 71.</a> J Immunol. 185, 7605-7613 (2010).</li><li>Thiery, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin+activates+clathrin-+and+dynamin-dependent+endocytosis,+which+is+required+for+plasma+membrane+repair+and+delivery+of+granzyme+B+for+granzyme-mediated+apoptosis.">Perforin activates clathrin- and dynamin-dependent endocytosis, which is required for plasma membrane repair and delivery of granzyme B for granzyme-mediated apoptosis.</a> Blood. 115, 1582-1593 (2010).</li><li>Thiery, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin+pores+in+the+endosomal+membrane+trigger+the+release+of+endocytosed+granzyme+B+into+the+cytosol+of+target+cells.">Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells.</a> Nat Immunol. 12, 770-777 (2011).</li><li>Thomas, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+protease+binding+to+nucleic+acids+promotes+nuclear+localization+and+cleavage+of+nucleic+acid+binding+proteins.">Leukocyte protease binding to nucleic acids promotes nuclear localization and cleavage of nucleic acid binding proteins.</a> J Immunol. 192, 5390-5397 (2014).</li><li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granzyme+B-induced+mitochondrial+ROS+are+required+for+apoptosis.">Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis.</a> Cell death and differentiation. , (2014).</li><li>Kummer, J. A., Kamp, A. M., Citarella, F., Horrevoets, A. J., Hack, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+human+recombinant+granzyme+A+zymogen+and+its+activation+by+the+cysteine+proteinase+cathepsin+C.">Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C.</a> The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).</li><li>Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+colorimetric+assay+that+specifically+measures+Granzyme+B+proteolytic+activity:+hydrolysis+of+Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl.">A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419 (2014).</li><li>Huang, M. T., Gorman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intervening+sequences+increase+efficiency+of+RNA+3'+processing+and+accumulation+of+cytoplasmic+RNA.">Intervening sequences increase efficiency of RNA 3' processing and accumulation of cytoplasmic RNA.</a> Nucleic Acids Res. 18, 937-947 (1990).</li><li>Luthman, H., Magnusson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+polyoma+DNA+transfection+of+chloroquine+treated+cells.">High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308 (1983).</li><li>Magee, A. I., Grant, D. A., Hermon-Taylor, J., Offord, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+one-stage+method+for+assay+of+enterokinase+activity+by+release+of+radiolabelled+activation+peptides+from+alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen+and+the+effect+of+calcium+ions+on+the+enzyme+activity.">Specific one-stage method for assay of enterokinase activity by release of radiolabelled activation peptides from alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen and the effect of calcium ions on the enzyme activity.</a> Biochem J. 197, 239-244 (1981).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

GzmA ve GzmB klasik ve yaygın olarak çalışılan bir rol gözenek oluşturucu protein PFN 1 kendi sitosolik doğumdan sonra memeli hücrelerinde apoptosisin olduğu. Son zamanlarda, Gzms sitotoksik spektrumu bakteri 9,10, ve de bazı parazitler 11 için memeli hücrelerinden önemli ölçüde genişletildi. Ayrıca, GzmA ve GzmB olmayan klasik, hücre dışı fonksiyonları yanı sıra çeşitli yetim Gzms biyolojik önemi hala karanlıktır. Bu protokol tarafından sağlanan nedenle,...

Gzms özel CTL lizozomlar ve NK hücrelerinin 1 lokalize yüksek ölçüde homolog serin proteaz ailesidir. Bu katil hücreler ve sitotoksik zerreler, aynı zamanda ortadan kaldırılması 2,3 için olan bir hedef hücrenin tanınması üzerine Gzms ile eşzamanlı olarak serbest bırakılır membran kesintiye proteinleri PFN ve GNLY içerir. (- G, K, M ve N GzmA), insanlarda (GzmA, B, H, K ve M,), beş Gzms ve farelerde 10 Gzms vardır. GzmA ve GzmB en bol ve yaygın insan ve farelerde 1 çalışılmıştır bulunmaktadır. Ancak, daha yeni çalışmalar hücre ölümü yollar yanı sıra sağlık ve hastalık 4 diğer, sözde yetim Gzms aracılık ettiği ek biyolojik etkilerini araştırmak başladı. PFN 5,6 hedef hücrelere verilebilir olduğunda Gzms en iyi bilinen işlevi, GzmA ve GzmB, özellikle de memeli hücrelerinde programlanmış hücre ölümü meydana gelmesidir. AncakDaha yeni çalışmalar da PFN 7,8 bağımsız Sitozolik teslimat, bağışıklık düzenleme ve inflamasyon üzerinde derin etkisi olan Gzms dışı etkilerini göstermiştir. Gzms sitozolik girmesinden sonra verimli öldürüldüğü hücrelerin spektrumu yakın zamanda bakterilerin 9,10 ve hatta bazı parazitler 11 memeli hücrelerinden genişletilmiştir. Bu yeni keşifler Gzm araştırmacılar için yepyeni bir alan açtı. Bu nedenle, maliyet-etkin, yüksek verim memeli sentezleme sistemi önemli ölçüde o gelecek çalışmalar için yol kolaylaştıracaktır. Ana insan, fare ve sıçan Gzms başarılı bir CTL ve NK hücre hatları 12-14 granül fraksiyonundan saflaştırılmıştır. Bununla birlikte, elimizdeki tür saflaştırma tekniklerinin verimi daha az, 0.1 mg / L hücre kültürü (yayınlanmamış gözlem ve 12) aralığındadır. Bundan başka, tasarımlarıyla ile kirlenme olmadan, tek bir GZM kromatografik çözünürlüğür Gzms ve / veya granül halinde de mevcut proteinler (yayınlanmamış veriler ve 12,14) meydan okuyor. Rekombinant Gzms hatta HEK 293 18,19 gibi memeli hücrelerinde bakteriler 15, maya 16, böcek hücreleri 17 ve üretildi. Sadece, memeli ekspresyon sistemleri nativ sitotoksik protein aynı translasyon sonrası modifikasyonlar ile, rekombinan enzimler meydana potansiyeli taşımaktadır. Posttranslasyonel değişiklikler endositoz belirli alımı ve hedef hücrelerin 20-22 içinde proteaz hücre içi lokalizasyonu ile suçlanmıştır. Bu nedenle, pHLsec 23 kullanılarak Gzm ifade plazmid omurgası olarak (Radu Aricescu ve Yvonne Jones, Oxford, UK Üniversitesi bir tür hediye), biz yüksek verim protein üretimi için basit, zaman ve maliyet-etkin bir sistem kurdu HEK293T hücreleri. pHLsec tavuk Β-aktin promoteri ile bir CMV artırıcı birleştirir; Birlikte, bu elemanlar gösterilerted çeşitli hücre hatlarında 24 güçlü promotör aktivitesi. Buna ek olarak, plazmid, bir tavşan Β-globin intronu, optimize edilmiş bir Kozak ve sekresyon sinyalleri, bir Lys-6xHis-tag ve bir poli-A sinyali içerir. Uçlar sekresyon sinyali ve uygun N-terminal etki alanları yoksun proteinler için uygun bir ifade ve sekresyon etkinliğin sağlanması Lys-6xHis etiketi (Şekil 1) arasında uygun bir klonlanabilir. Gzms ekspresyonu sağlamak için, böylece EK tedavisi salgılanan Gzms (aktif Gzms N-terminali ile başlayan aktive bir enterokinaz (EK) Alanı (DDDDK) ve ardından vektör tarafından sağlanan salgılama sinyal ile endojen salgılama sinyal dizisi yerine amino asit sekansı IIGG 25). Buna ek olarak, bu yöntem için lehine HEK293T hücreleri, Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) gibi düşük fiyatlı bir ortam içinde hızlı bir şekilde büyümesi ve maliyet-etkin bir kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi için de uygundur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-026</td>
			<td>Total RNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14571C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enterokinase from bovine intestine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4906</td>
			<td>recombinant, &#8805;20&#160;units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap Excel 5ml-column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-3712-06&#160;</td>
			<td>Nickel IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap SP HP 5 ml-column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1152-01&#160;</td>
			<td>S column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-&#945;-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3647</td>
			<td>GzmA substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2193608 _10mg</td>
			<td>GzmB substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL)</td>
			<td>Bachem</td>
			<td></td>
			<td>GzmM substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,5&#8242;-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8130</td>
			<td>Ellman`s reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high yield and cost-efficient expression system of human granzymes in mammalian cells

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their cytotoxic granule content to eliminate the target cells and the intracellular pathogen. Death of the host cells and intracellular pathogens is triggered by the granule serine proteases, granzymes (Gzms), delivered into the host cell cytosol by the pore forming protein perforin (PFN) and into bacterial pathogens by the prokaryotic membrane disrupting protein granulysin (GNLY). To investigate the molecular mechanisms of target cell death mediated by the Gzms in experimental in-vitro settings, protein expression and purification systems that produce high amounts of active enzymes are necessary. Mammalian secreted protein expression systems imply the potential to produce correctly folded, fully functional protein that bears posttranslational modification, such as glycosylation. Therefore, we used a cost-efficient calcium precipitation method for transient transfection of HEK293T cells with human Gzms cloned into the expression plasmid pHLsec. Gzm purification from the culture supernatant was achieved by immobilized nickel affinity chromatography using the C-terminal polyhistidine tag provided by the vector. The insertion of an enterokinase site at the N-terminus of the protein allowed the generation of active protease that was finally purified by cation exchange chromatography. The system was tested by producing high levels of cytotoxic human Gzm A, B and M and should be capable to produce virtually every enzyme in the human body in high yields.

Aşağıdaki bölümde yöntemi aydınlatmak için bir GzmA hazırlık tam bir dokümantasyon sunacak. Ayrıca başarılı saflaştırma etkinliği ve aktivitesi ile ilgili olarak benzer sonuçlar üreten GzmB ve GzmM saflaştırılmıştır. Ancak, bu daha sonraki hazırlıkları sadece verilerin birkaç seçilmiş parçaları gösterecektir. Mevcut protokolü takip eden 293T hücrelerinden elde GzmB preparatları çeşitli biyolojik deney sistemlerinde 9,29,31-34 etkinliklerini vurgulayarak Yayınlanmış b...

Watch this Scientific Journal Video about A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells at JoVE.com

A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells

We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease.

Memeli hücrelerinde İnsan Granzymes bir Yüksek Verimli ve Maliyet-etkin İfade Sistemi

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their ...

a-high-yield-cost-efficient-expression-system-human-granzymes

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Görüntüleme.  Boston Children’s Hospital and Harvard Medical School. We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease. 