Al etiquetar genéticamente las células individuales con proteínas fluorescentes y seguir esas células a lo largo del tiempo, el ratón confeti ha permitido a los investigadores revelar nuevas perspectivas sobre muchos procesos biológicos. Nuestro protocolo minimiza el tiempo de retraso entre la recolección de tejidos y la toma de imágenes, se puede aplicar a cualquier tejido mineralizado o no mineralizado y preserva la fluorescencia durante varios años. Este método es muy útil para todas las áreas de la medicina regenerativa y la biología del desarrollo, ya que se puede aplicar a diferentes poblaciones celulares para estudiar su destino y su cinética siempre y cuando haya una línea adecuada de Cre disponible.
Nuestras instrucciones paso a paso demostrarán el paso más difícil para distinguir la diferencia de señales fluorescentes emitidas por diferentes proteínas fluorescentes. Comience preparando el tejido del ratón para la toma de imágenes. Para tejidos blandos y tibias mineralizadas y fémures de ratones de hasta 45 días de edad, fijar el tejido en PBS de formaldehído preenfriado e incubarlo a 4 grados Celsius durante seis horas mientras rueda suavemente sobre un rotador.
Para tejidos mineralizados como tibias y fémorra de ratones mayores de 45 días, prepare un litro de solución EDTA al 10%con el pH ajustado a 8,05 con hidróxido de sodio y el formaldehído al 3,7% utilizando esta solución. Fijar el tejido manteniéndolo en 3.7%formaldehído PBS durante la noche a 4 grados Celsius. Al día siguiente, colóquelo en la solución EDTA de formaldehído preenfriada e incubarlo a 4 grados centígrados mientras gira durante 48 horas, asegurándose de reemplazar la solución tres veces durante la incubación.
A continuación, coloque el tejido en una sacarosa 30% preenfriada, asegurándose de llenar el recipiente hasta el borde, y gírelo suavemente durante la noche a cuatro grados centígrados. Por la mañana, utilice fórceps para extraer el tejido de la solución de sacarosa y enjuáguelo en cinco mililitros de compuesto de temperatura de corte óptima, o OCT, durante unos segundos. Llene una crioxironda preetiquetado con OCT y coloque el tejido en la parte inferior, trabajando rápidamente para evitar que la muestra esté sentada a temperatura ambiente durante demasiado tiempo.
Incruste la muestra colocando el molde sobre hielo seco y esperando a que el OCT se solidifique. Si las muestras no se utilizan inmediatamente, se pueden almacenar a menos 20 grados centígrados. Retire el bloque del molde.
Aplique PTU entre la parte superior del bloque y el mandril y enfríe en el criostato durante al menos cinco minutos o hasta que el PTU se solidifique por completo. Coloque el soporte de la muestra y el soporte de la cuchilla a menos 20 grados centígrados, luego coloque la muestra en el soporte del portabrocas y la cuchilla en el soporte de la cuchilla, y permita que se equilibren durante varios minutos. Para el análisis de placas de crecimiento posnatal, prepare secciones de 30 a 160 micrómetros.
Utilice el criostato para recortar el bloque y cortar las secciones de tejido a un grosor adecuado y recogerlos en diapositivas. Luego seque al aire los portaobjetos a temperatura ambiente hasta que estén completamente secos y guárdelos a menos 20 grados centígrados durante un máximo de 36 meses. Cuando esté listo para usar la diapositiva, retírela del congelador y lléella a temperatura ambiente en un portaobjetos.
Para retirar el OCT, aplique suavemente PBS sobre la corredera con la pipeta Pasteur. Para secciones de 160 micrómetros de espesor, incubar el portaobjetos durante 15 minutos, retirar el líquido y aplicar PBS fresco durante cinco minutos más. Monte los portaobjetos en una solución de 75%tiodietanol a temperatura ambiente con resbalones de cubierta de 60 milímetros de largo.
En primer lugar, seleccione el canal RFP haciendo clic en él en la pestaña de canales, lo que hace que los detalles del canal se muestren en la pestaña de la ruta de luz. A continuación, haga clic en la casilla de verificación situada junto a T-PMT. Coloque la diapositiva en el portaobjetos y coloque el tejido de interés directamente entre la trayectoria de la luz y la lente objetivo.
Para localizar el tejido, anule la selección de los cuadros YFP y CFP bajo el encabezado de pistas de la pestaña de canales. Seleccione el canal T-PMT en el encabezado de pistas, luego haga clic en live en la pestaña de adquisición y aumente la ganancia para el canal T-PMT para visualizar la selección de tejido en la pantalla. Ajuste la posición de la diapositiva para localizar la región de interés y el enfoque utilizando la perilla del microscopio adecuada.
A continuación, haga clic en detener en la pestaña de adquisición para desactivar la exposición láser. Defina los parámetros de imagen de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y ajuste el tamaño del agujero si es necesario. Compruebe la configuración para asegurarse de que las señales grabadas no se superponen, luego seleccione los tres canales en la pestaña de canales y pulse el botón de ajuste.
Desplácese entre los canales de visualización de la imagen resultante haciendo clic en los cuadros resaltados azules situados encima de cada canal en la pestaña dimensiones y compruebe manualmente si hay superposición entre los canales de la pantalla. Si las señales se superponen, reajuste los parámetros hasta que se puedan distinguir entre sí. Este protocolo se utilizó para etiquetar condrocitos en el cartílago epifisario y visualizar su expansión clonal con la edad.
La sección central se determinó visualizando el ligamento cruzado y semicon clones en la placa de crecimiento tibial proximal. Células individuales que fueron Col2 positivas y se etiquetaron con proteínas fluorescentes de confeti tras la administración de tamoxifeno, se sometieron a expansión clonal y posteriormente permanecieron en la placa de crecimiento. La señal fluorescente se puede visualizar después de un almacenamiento a largo plazo.
Algunas secciones se almacenaron durante más de tres años antes de la preparación y la toma de imágenes. La reconstrucción tridimensional se llevó a cabo automáticamente con el software de análisis de imágenes y se exportó como un vídeo. Una sección rota durante el paso de criosectación contiene un área con un nivel tan alto de recombinación que evitaría el análisis clonal, demostrando uno de los problemas comunes encontrados con este protocolo.
Dependiendo de su pregunta de investigación, el uso de una línea Cre que etiquete específicamente sus celdas de interés podría ser muy importante. Por lo tanto, recomendamos comprobar la fluorescencia en esas células poco después de la recombinación. El uso de líneas Inducibles de Cre es esencial porque la recombinación continua de ADN en líneas Cre no inducibles puede alterar el perfil fluorescente de las células solutadas, excluyendo así el análisis clonal.
Este protocolo se puede combinar con perturbaciones funcionales como cepas manipuladas genéticamente, tratamientos farmacológicos, intervenciones quirúrgicas, así como tinción de inmunofluorescencia de secciones preparadas.
