The syngeneic rat mesothelioma II-45 cell line was a kind gift from A/Prof. Emanuela Felley-Bosco, Zurich University.

Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones del Código Australiano de Prácticas para el Cuidado y Uso de animales con fines científicos. El protocolo de este estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales y el Hospital Royal North Shore de Ética. Mujer ratas Fischer 344 (F344, 150-200 g) se mantuvieron en el Centro de Kearns, Kolling Instituto en condiciones estándar (12 horas de luz / oscuridad ciclos y el libre acceso a los alimentos y el agua). Nota: Un diagrama de flujo para todos los procedimientos experimentales se presenta en la Figura 1. 1. Preparación de las células para la implantación <ol><li> Cultura del mesotelioma rata II-45 línea celular (también conocido como IL-45; obtenidas por introducción peritoneal del amianto crocidolita) en medio RPMI 1640 (RPMI) suplementado con suero bovino al 10% fetal (FBS) y crecer en condiciones estándar (37 ° C incubador humidificado con 5% de CO 2). Maintaen por pases y sub-cultivo aproximadamente a las 01:50 dos veces por semana en un matraz de 75 cm2. </li><li> Preparar reactivos para cultivo celular y alícuotas caliente a 37 ° C. Reactivos requeridos incluyen medios RPMI sin suero (SFM), RPMI con 10% FBS, solución salina tamponada con fosfato (PBS) y 0,5% de tripsina-EDTA. </li><li> Células de cultivo para la implantación de aproximadamente el 70-80% de confluencia. Esto asegura que están en la fase de crecimiento lineal. </li><li> Células Cosecha descartando los medios de comunicación, de lavar una vez con 5 ml de PBS estéril y después añadiendo 3 ml de 0,5% de tripsina-EDTA. </li><li> Matraces Volver a la incubadora durante aproximadamente 5 min hasta que todas las células se vuelven no adherente. </li><li> Una vez que las células son no adherente, añadir 3 ml de RPMI con 10% de FBS para inactivar la tripsina. Recoger y centrifugar las células a 300 xg durante 3 min. </li><li> Lavar el sedimento celular en 10 ml de SFM y se centrifuga de nuevo a 300 xg durante 3 min. </li><li> Pellet de células de lavado de nuevo con 10 ml de SFM y centrifugar como anteriormente. </li><li> Resuspender las células en 10 ml de SFM y realizar un recuento de células usando un hemocitómetro o instrumentación similar. </li><li> Diluir las células de manera que 100 l contiene la cantidad de células para ser implantado. Nota: El crecimiento del tumor se ha demostrado en una dosis tan baja como 100 células en 100 l pero una dosis estándar es de 500.000 células en 100 l. </li><li> Preparar suficientes células en medios para el número de ratas para ser implantado (es decir, 100 l / rata), además de al menos 0,5 ml extra para compensar las pérdidas de imprimación y el volumen muerto de la aguja. </li><li> Preparar suficiente SFM (sin células) para ser implantado en ratas de control (es decir, 100 l / rata), además de al menos 0,5 ml adicional. Nota: Las células y SFM están ya listos para su implantación. Deben mantenerse a 37 ° C y se implantaron dentro de 2 horas de la cosecha para mantener la viabilidad. </li></ol> 2. In vivo implantación de células<ol><li> Coloque la rata F344 (&gt; 13 semanas de edad) en la cámara de inducción y anestesiar utilizando 1,4% inhalación isoflurano (o el método en uso en la instalación). Una vez que la rata parece ser movida dormidos desde la cámara a un cono de la nariz (con 1,4% de isoflurano fluye), colocarla en su espalda con el pecho hacia arriba (vista ventral). Esto permite que los órganos internos se asienten fuera de la cavidad torácica. Compruebe reflejos de acuerdo con los protocolos institucionales para asegurar la rata está totalmente anestesiado. </li><li> Afeitarse el área derecha costalis regio (pecho) para quitar la piel. </li><li> Limpie la zona afeitada con un 80% v / v de etanol. </li><li> Identificar el lugar de la inyección: en el lado derecho, busque la segunda glándula partir craneal. El sitio de inyección es de 0,5 cm proximal a este, entre la tercera y la cuarta costilla desde el extremo caudal de la caja torácica. (Figura 2A). </li><li> Mezclar suavemente las células II-45 para volver a suspender. Lentamente dibujar la suspensión celular (o SFM para el control de ratas) en un 1 ml y# 160; jeringa sin aguja. Si una aguja se adjunta para la elaboración de células existe el potencial para que las células crecen a lo largo de la línea de inyección de la aguja. Adjunte una 23G x 1¼ aguja. Primer de la aguja y eliminar cualquier burbuja de aire. </li><li> Una vez que la jeringa y la aguja se cebaron, coloque a 20 mm de largo y 5 mm de diámetro espaciador sobre el eje de la aguja. Esto se utiliza para evitar que la aguja penetre demasiado profundamente en la cavidad pleural durante la inyección. Aproximadamente 5 mm-12 mm de aguja expuesta es suficiente para la penetración a través de las costillas sin dañar cualquier órgano. </li><li> Lentamente inserte la aguja entre las costillas, retroceder en la jeringa para asegurar un vaso sanguíneo no ha sido perforado (sin sangre debe aparecer en la jeringa) y luego inyectar 100 células mu l o SFM. (Figura 2B). </li><li> Retire la aguja y rodar suavemente la rata de lado a lado para difundir las células en la cavidad torácica. </li><li> Coloque la rata en una jaula y compruebe si hay recuperación. The rata debe estar despierto dentro de 1 min y empezar a moverse. </li><li> Repita el procedimiento para cada rata utilizando una aguja nueva. La reutilización de la misma aguja resultará en el crecimiento celular a lo largo de la línea de inyección de la aguja. </li><li> Supervisar el bienestar de los animales diariamente. </li><li> La eutanasia a los animales en los criterios de valoración ética definidos como gobernado por el comité de ética animal institucional. Los criterios de valoración éticos para las ratas en estos experimentos eran la pérdida de peso de más de 10% o dificultad para respirar. </li></ol> 3. cola vena extracción de sangre <ol><li> Si la sangre se debe desechar inmediatamente la implantación de células post, mantener la rata anestesiada. Si el muestreo de sangre en otro punto del tiempo, anestesiar la rata utilizando 1,4% de inhalación de isoflurano. Compruebe reflejos de acuerdo con los protocolos institucionales para asegurar la rata está totalmente anestesiado. </li><li> Coloque la rata sobre su lado y localizar una vena lateral de la cola. </li><li> Esterilizar la cola con etanol al 80% y la etiqueta de un 0,5 ml de EDTA ctubo ollection. </li><li> Para recoger la sangre, siempre comienzan en el extremo caudal de la cola (aproximadamente un tercio del camino a lo largo). Esto permite que nuevos intentos más cerca del extremo craneal de la cola en caso de que el primer intento no tiene éxito. Nunca volver a muestrear caudal ya que esto puede causar un coágulo de sangre. </li><li> Coloque una 23G x 1¼ aguja paralela a la vena lateral y deslícela en la vena con un ángulo pequeño por lo que penetra aproximadamente 10 mm (Figura 3A). </li><li> Nota: Si la vena se ha perforado con éxito la sangre será visible en el extremo de fijación de la aguja (Figura 3B). </li><li> Una gota de sangre se forma en la cola en el sitio de la punción de la aguja. Recoge esta sangre con una pipeta y transferencia a los marcados 0,5 ml (o menor) tubo de recogida de EDTA. Para el ensayo de células inmunes 25 l es suficiente. Aplicar una gasa con la presión para perforar sitio hasta que deje de sangrar. </li><li> Flick el tubo de sangre para mezclar la sangre y EDTA a PRcoagulación evento. Mantener el tiempo entre la recogida de sangre y la mezcla con el EDTA lo más corto posible para evitar la coagulación. </li><li> Cuando la recogida de sangre a partir de múltiples ratas almacenar muestras de sangre con EDTA en un bastidor a TA hasta el análisis. Sangre Proceso dentro de 2 horas de la recolección. </li></ol> 4. Preparación de muestras para Inmune Profiling celular utilizando el método basado en la gota Nota: Este método se basa en la plataforma de un solo uso de tubos de conteo absolutos disponibles comercialmente que tienen un número conocido de los granos para cada muestra. Estos tubos contienen gránulos liofilizados que se disuelven durante la preparación de la muestra, la liberación de las cuentas. Las perlas se marcaron fluorescentemente y por gating en la población de perlas, los recuentos absolutos se pueden calcular. <ol><li> Asegúrese de que la muestra de sangre entera EDTA se mezcla bien colocándolo en un mezclador rotatorio lento durante varios minutos. Etiquetar un tubo de recuento absoluto para cada muestra. Un sedimento que contenía las perlas debe ser visible debajo tél portador del talón de metal en la parte inferior del tubo. </li><li> Transferir 25 l de EDTA sangre entera en un tubo de recuento absoluto etiquetado. El sedimento de perlas se disolverá después de la adición de la sangre. </li><li> A cada tubo se añaden 20 l de anti-rata cóctel / B / Killer celular (NK) natural T, 10 l de anti-rata CD8a PE, 10 l de anti-rata CD4 (dominio 1) FITC y 10 l de anti-rata CD45 PE / Cy7 (Figura 4A). Los fluoróforos se definen en la Tabla 1. </li><li> Centrifugar brevemente el tubo (300 xg) para asegurar que los anticuerpos y las células están en la parte inferior del tubo y no pegados a la pared del tubo. Vortex para mezclar e incubar durante 15 min a TA. </li><li> Para lisar las células rojas de la sangre añaden 400 l de Tris 10 mM, 0,15 M tampón de cloruro de amonio (pH 7,5) y agitar para mezclar. La lisis se completa cuando la muestra aparece translúcida y no turbia (figuras 4B y C). La falta de lisar la muestra completamente conducirá a aumentard fondo y falsamente elevados recuentos al analizar por citometría de flujo. </li></ol> 5. citometría de flujo de Procesamiento de Muestras Nota: Realice un color 4 citómetro de flujo. <ol><li> Abra el software en modo de adquisición y una nueva plantilla con 8 parcelas como se muestra en la Figura 5. </li><li> Ajustar la configuración de instrumentos de los que se enumeran en la Tabla 1 y configurar la puerta R1 (FITC [FL-1] frente APC [FL-4]), Figura 5ai) para contar las perlas fluorescentes. Las otras puertas no son tan importantes en esta etapa de adquisición, pero serán requeridos para el análisis. Los contar bolas absolutos utilizados en este protocolo contienen tintes fluorescentes y pueden detectarse en cualquier canal, aunque son más débiles en el canal azul. </li><li> Utilizando una muestra de sangre de control preparado, vórtice y luego cargar en el citómetro y correr a una velocidad baja (12 l / min) en el modo de configuración de modo puertas de adquisición de datos se pueden ajustar. </li><li> Establezca la adquisición derecolectar 10.000 eventos en la puerta del grano R1. </li><li> Configurar una carpeta para grabar los datos y establecer el número de expediente y archivo de ejemplo de etiqueta en el menú de adquisición. </li><li> Cargue la muestra a analizar en el citómetro y establecer el caudal medio (35 l / min). Ejecutar cada muestra a la misma velocidad de flujo. Puede necesitar la velocidad de flujo a ser variada para bajo (12 l / min) o alta (60 l / min), pero es generalmente medio apropiado. A este ritmo que se necesita aproximadamente el 90 a 120 seg para adquirir 10.000 eventos de cuentas para cada muestra. </li><li> Una vez que la muestra se carga mirar los gráficos de dispersión para hacer eventos estén apareciendo en la puerta del grano R1. Inicialmente puede haber cierta inestabilidad en la presión de la muestra causando la deriva en los gráficos de dispersión. Espere a que esta se estabilice. </li><li> Una vez estabilizado, haga clic en adquirir y permitir la muestra se ejecute. Una vez que el citómetro ha finalizado la adquisición de 10.000 eventos de cuentas en R1 el citómetro dejará de adquirir y guardar todos los datos. </li><li> Retire la muestra y descartar fluir tuser. El citómetro está ahora listo para la siguiente muestra. Ejecutar todas las muestras y luego proceder a modo de análisis. </li></ol> 6. Análisis de la célula inmune Nota: las estrategias de apertura de puerta y álgebra de Boole se utilizan para definir cada población celular. Álgebra de Boole es un método de análisis de la lógica basada que permite múltiples operaciones en una sola definición. El software de análisis de flujo el citómetro (por ejemplo, BD CELLQuest) permite el uso del álgebra booleana. Las ecuaciones se utilizan para tener en cuenta de forma activa para la reactividad negativa significativa que ayuda en la definición de la célula para identificar más específicamente cada población celular. &quot;Regiones&quot; se utilizan para definir una &#39;puerta&#39;. Regiones definen un espacio de dimensión 2, mientras que las puertas pueden estar compuestas de numerosas regiones conectadas por los operadores algebraicas (+, *, -, definida en la Tabla 2). <ol><li> Cambiar el software a modo de análisis. Una plantilla de análisis debe ser generado para que coincida <strong&gt; Figura 5 con las parcelas y las puertas que se muestran. </li><li> Analizar cada archivo individual (es decir, cada muestra individual) por separado. Configure puertas R1 a través de R9 y luego configurar los algoritmos para cada tipo de células como se define en la Tabla 2 (también se muestra en la Figura 5). </li><li> Utilice el contador de estadísticas de células para calcular las poblaciones de células individuales definidos por puertas y algoritmos (Tabla 2 y Figura 5). Los algoritmos se ajustará automáticamente el número de células en el contador de estadísticas de células. </li><li> Calcular subconjuntos de células usando la siguiente ecuación: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/53019/53019eq1.jpg" /> Nota: El número de eventos celulares contados (por ejemplo, eventos de células T CD4) se enumeran utilizando la ecuación anterior para dar el número de células por microlitro de sangre. Los ejemplos se muestran en la Figura 5. </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Este documento detalla un método para la generación de un modelo ortotópico singénico de rata de mesotelioma pleural y un método simple para el seguimiento de la progresión de la enfermedad a través de muestreo de sangre longitudinal. El modelo II-45 fue desarrollado mediante la exposición de ratas Fischer 344 a fibras de amianto 13. Aunque esta exposición representa la verdadera dinámica de las interacciones del sistema huésped-asbesto inmunológico para la patogénesi...

El mesotelioma maligno (MM) es una neoplasia agresiva que surge de las células transformadas en la membrana (mesotelio) que recubre el pulmón y la cavidad abdominal, el corazón y los órganos reproductivos internos, y es el tumor primario más frecuente de la cavidad pulmonar o la pleura 1,2 . La exposición a las fibras de amianto representa el 80% del total de MM, y si bien la prohibición de uso del amianto se introdujeron hace décadas en la mayoría de los países occidentales, su uso generalizado en la comunidad ha dejado un legado mortal. La Organización Mundial de la Salud ha estimado que 107.000 personas en el mundo mueren cada año por enfermedades relacionadas con el amianto, con tasas de mortalidad siguen aumentando. Una nueva ola de incidencia no ocupacional también está emergiendo y hay poca comprensión de cuándo, y en qué nivel esta llegará a su máximo 3. La mayoría de las personas con MM son diagnosticados tarde cuando la quimioterapia sistémica representa una de las únicas opciones viables 4. Las mayoría de effective la quimioterapia y la corriente &#39;estándar de atención&#39; (pemetrexed junto con cisplatino 5) fue identificado hace más de 10 años. Sin embargo el fracaso de este tratamiento es inevitable y no hay opciones de segunda línea probadas, dejando los pacientes con un pronóstico sombrío y la supervivencia media de sólo 12 meses 2. Por lo tanto, existe una necesidad no satisfecha urgente de tratamientos más eficaces. A pesar del examen de una serie de nuevos tratamientos en ensayos clínicos no se ha traducido en cambios en la práctica. Esto es debido en parte a la baja (5%) transferencia de resultados pre-clínicos, generalmente realizado en modelos de xenoinjerto de ratón, al ajuste de la clínica 6-8. Tales modelos no recapitulan fielmente los complejos aspectos de la microambiente tumoral se producen en lugares no fisiológicas, con frecuencia en la ausencia de un funcionamiento del sistema inmunológico 9. Modelos ortotópico singeneicos crean un ambiente del tumor significativamente más realista que el commonly utilizado modelos de xenoinjerto subcutáneos como se producen los tumores en el lugar fisiológica correcta con un 10,11 intacta sistema inmunológico. El mayor tamaño de la rata aumenta su uso como modelo de la enfermedad de roedores, especialmente en los estudios de la droga donde la sangre dibuja serie se requieren para evaluar la respuesta al tratamiento y la toxicidad 12. Además, en modelos en los que el seguimiento de la progresión de la enfermedad es difícil debido a la ubicación de los tumores (como en la cavidad pleural), la capacidad de monitorear progresión de la enfermedad utilizando factores que se encuentran en la circulación es extremadamente atractivo. Se describe la generación de un modelo ortotópico singénico de mesotelioma pleural usando ratas inmuno-competentes. Además, también se describe un método fácil y relativamente no invasivo para el seguimiento de progresión de la enfermedad pleural mediante la medición de las células inmunes circulantes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EDTA Collection tube (0.5ml)</td>
			<td>Greiner Bio One GmbH</td>
			<td>450480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat T/B/NK Cell cocktail</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>558509</td>
			<td>anti-Rat CD3&#160; APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RAT CD8a PE&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>200608</td>
			<td>(IgG1vClone G28)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rat CD4 FITC (Domain 1)&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>203406</td>
			<td>(IgG1 Clone OX-38)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rat CD45 PE/Cy7&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202214</td>
			<td>(IgG1 Clone OX-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruCount&#8482; Tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>340334</td>
			<td>Box of 50 absolute counting tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>foetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Scientifix</td>
			<td>FBS500-S (lot# 010101-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Medicago AB</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23Gx1&#188; Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fischer 344 Rat</td>
			<td>Animal Resources Centre, Perth Australia</td>
			<td>F344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I.S.O (Isoflurane USP)</td>
			<td>Veterinary Companys Australia (VCA)&#160;</td>
			<td>B7058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>II-45 Rat Mesothelioma line</td>
			<td>Zurich University</td>
			<td></td>
			<td>Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur&#8482; 4 colour</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>342975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS-HCL</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthetic Machine (The stinger)</td>
			<td>Advanced Anaesthesia specialists</td>
			<td>#00449</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

orthotopic implantation and peripheral immune cell monitoring in the ii-45 syngeneic rat mesothelioma model

El enorme aumento del interés en los tratamientos de base inmunológica para el cáncer, tales como vacunas e inhibidores de punto de control inmunológico, y un mayor entendimiento del papel del microentorno del tumor en la respuesta al tratamiento, en conjunto apuntan a la necesidad de modelos ortotópico inmuno-competentes para las pruebas preclínicas de estas nuevas terapias. En este trabajo se muestra cómo establecer un modelo de rata inmune competente ortotópico de mesotelioma maligno pleural. Progresión de la enfermedad de Monitoreo en modelos ortotópico es confundida por la ubicación interna de los tumores. Para supervisar longitudinalmente progresión de la enfermedad y su efecto sobre células inmunes circulantes en este y otros modelos de rata de cáncer, el flujo de un solo tubo ensayo de citometría de que requiere sólo 25 l de sangre completa se describe. Esto proporciona la cuantificación exacta de los siete parámetros inmunológicos: linfocitos totales, monocitos y neutrófilos, así como los subconjuntos de células T CD4 y CD8, células B y células asesinas naturales. Diferentes subsets de estos parámetros son útiles en diferentes circunstancias y modelos, con el neutrófilo a la proporción de linfocitos que tiene la mayor utilidad para el seguimiento de progresión de la enfermedad en el modelo de mesotelioma. Analizando los niveles circulantes de células inmunes que utilizan este método solo tubo también puede ayudar en el seguimiento de la respuesta a los tratamientos de base inmunológica y la comprensión de los mecanismos subyacentes que conducen al éxito o fracaso de un tratamiento.

El método utilizado en este documento para la generación de un modelo ortotópico del mesotelioma pleural utilizando células II-45 dio como resultado en los animales sucumben a mesotelioma en un plazo de tiempo reproducible y rápido, sin ratas morir debido al método de implantación. La titulación del número de células implantadas determinó que 1x 10 3 células fue el número mínimo requerido para un modelo completamente penetrante (100% engraftment). El distinto número de células implantadas en l...

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Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model | Medicine | Video

Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model

Se presenta la generación de un modelo de rata ortotópico de mesotelioma maligno pleural mediante la implantación de II-45 células de mesotelioma en la cavidad pleural de ratas inmunocompetentes. Un método de citometría de flujo para analizar siete subconjuntos de células inmunes en estos animales de una muestra de sangre 25 l también se describe.

Ortotópico Implantación y Seguimiento de la célula inmune periférica en el modelo II-45 Singénico Rata Mesotelioma

The enormous upsurge of interest in immune-based treatments for cancer such as vaccines and immune checkpoint inhibitors, and increased understanding of ...

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9.1K vistas.  Royal North Shore Hospital, University of Sydney.  Se presenta la generación de un modelo de rata ortotópico de mesotelioma maligno pleural mediante la implantación de II-45 células de mesotelioma en la cavidad pleural de ratas inmunocompetentes. Un método de citometría de flujo para analizar siete subconjuntos de células inmunes en estos animales de una muestra de sangre 25 l también se describe. 

Video: Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model

Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant vasculopathy (TVP).
The commonly used animal model for cardiovascular chronic rejection studies is the heterotopic heart transplant model performed in laboratory rodents. This model is used widely in experiments since Ono and Lindsey (3) published their technique. To analyze the findings in the blood vessels, the heart has to be sectioned and all vessels have to be measured.
Another method to investigate chronic rejection in cardiovascular questionings is the aortic transplant model (1, 2). In the orthotopic aortic transplant model, the aorta can easily be histologically evaluated (2). The PVG-to-ACI model is especially useful for CAV studies, since acute vascular rejection is not a major confounding factor and Cyclosporin A (CsA) treatment does not prevent the development of CAV, similar to what we find in the clinical setting (4). A7-day period of CsA is required in this model to prevent acute rejection and to achieve long-term survival with the development of TVP.
This model can also be used to investigate acute cellular rejection and media necrosis in xenogeneic models (5).

This video demonstrates the orthotopic aortic transplant model as a simple model to study the development of transplant vasculopathy (TVP) in rats.

Trasplante ortotópico aórtica: un modelo de rata para estudiar el desarrollo de la enfermedad vascular crónica

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Investigación

Medicina

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to inhibit tumor growth must be performed in a suitable animal model. The type of animal model that is best for this purpose is a topic of intense discussion. Some evidence indicates that preclinical trials examining drug effects on tumors arising in transgenic mice are more predictive of clinical outcome1and so candidate therapeutic agents are often tested in these models. Unfortunately, transgenic models are not available for many tumor types. Further, transgenic models often have other limitations such as concerns as to how well the mouse tumor models its human counterpart, incomplete penetrance of the tumor phenotype and an inability to predict when tumors will develop.
Consequently, many investigators use xenograft models (human tumor cells grafted into immunodeficient mice) for preclinical trials if appropriate transgenic tumor models are not available. Even if transgenic models are available, they are often partnered with xenograft models as the latter facilitate rapid determination of therapeutic ranges. Further, this partnership allows a comparison of the effectiveness of the agent in transgenic tumors and genuine human tumor cells. Historically, xenografting has often been performed by injecting tumor cells subcutaneously (ectopic xenografts). This technique is rapid and reproducible, relatively inexpensive and allows continuous quantitation of tumor growth during the therapeutic period2. However, the subcutaneous space is not the normal microenvironment for most neoplasms and so results obtained with ectopic xenografting can be misleading due to factors such as an absence of organ-specific expression of host tissue and tumor genes. It has thus been strongly recommended that ectopic grafting studies be replaced or complemented by studies in which human tumor cells are grafted into their tissue of origin (orthotopic xenografting)2. Unfortunately, implementation of this recommendation is often thwarted by the fact that orthotopic xenografting methodologies have not yet been developed for many tumor types.
Malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs) are highly aggressive sarcomas that occur sporadically or in association with neurofibromatosis type 13and most commonly arise in the sciatic nerve4. Here we describe a technically straightforward method in which firefly luciferase-tagged human MPNST cells are orthopically xenografted into the sciatic nerve of immunodeficient mice. Our approach to assessing the success of the grafting procedure in individual animals and subsequent non-biased randomization into study groups is also discussed.

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

A method for reliably grafting luciferase-tagged human malignant peripheral nerve sheath tumor cells into the sciatic nerve of immunodeficient mice is described. The use of bioluminescence imaging to demonstrate proper establishment of tumor grafts and criteria for random segregation of animals into study groups are also discussed.

Xenotrasplante ortotópico de los Derechos Humanos-luciferasa Tagged células malignas del tumor vaina de nervio periférico para In vivo Pruebas de candidatos a agentes terapéuticos

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to ...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Establecimiento y propagación de los tumores del retinoblastoma humanos en ratones con deficiencia inmune

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotón imágenes de invasión de células tumorales en un modelo de ratón ortotópico de carcinoma oral de células escamosas

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

The Polyvinyl Alcohol Sponge Model Implantation

Wound healing is a complicated, multistep process involving many cell types, growth factors and compounds1-3. Because of this complexity, wound healing studies are most comprehensive when carried out in vivo. There are many in vivo models available to study acute wound healing, including incisional, excisional, dead space, and burns. Dead space models are artificial, porous implants which are used to study tissue formation and the effects of substances on the wound. Some of the commonly used dead space models include polyvinyl alcohol (PVA) sponges, steel wire mesh cylinders, expanded polytetrafluoroethylene (ePTFE) material, and the Cellstick1,2.
Each dead space model has its own limitations based on its material's composition and implantation methods. The steel wire mesh cylinder model has a lag phase of infiltration after implantation and requires a long amount of time before granulation tissue formation begins1. Later stages of wound healing are best analyzed using the ePTFE model1,4. The Cellstick is a cellulose sponge inside a silicon tube model which is typically used for studying human surgery wounds and wound fluid2. The PVA sponge is limited to acute studies because with time it begins to provoke a foreign body response which causes a giant cell reaction in the animal5. Unlike other materials, PVA sponges are easy to insert and remove, made of inert and non-biodegradable materials and yet are soft enough to be sectioned for histological analysis2,5.
In wound healing the PVA sponge is very useful for analyzing granulation tissue formation, collagen deposition, wound fluid composition, and the effects of substances on the healing process1,2,5. In addition to its use in studying a wide array of attributes of wound healing, the PVA sponge has also been used in many other types of studies. It has been utilized to investigate tumor angiogenesis, drug delivery and stem cell survival and engraftment1,2,6,7. With its great alterability, prior extensive use, and reproducible results, the PVA sponge is an ideal model for many studies1,2.
Here, we will describe the preparation, implantation and retrieval of PVA sponge disks (Figure 1) in a mouse model of wound healing.

A useful tool to analyze the effects of drugs, growth factors, and/or manipulated cells in an animal model of wound repair is described. This technique utilizes the properties of a polyvinyl alcohol (PVA) sponge to deliver and contain the desired treatment and also provide a platform to be excised and analyzed.

El alcohol polivinílico esponja modelo de implantación

Wound healing is a complicated, multistep process involving many cell types, growth factors and compounds1-3. Because of this complexity, wound healing ...

Surgical Procedures for a Rat Model of Partial Orthotopic Liver Transplantation with Hepatic Arterial Reconstruction

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as studies on graft preservation and ischemia-reperfusion injury 1,2, immunological responses 3,4, hemodynamics 5,6, and small-for-size syndrome 7. The rat OLT is among the most difficult animal models in experimental surgery and demands advanced microsurgical skills that take a long time to learn. Consequently, the use of this model has been limited. Since the reliability and reproducibility of results are key components of the experiments in which such complex animal models are used, it is essential for surgeons who are involved in rat OLT to be trained in well-standardized and sophisticated procedures for this model.
While various techniques and modifications of OLT in rats have been reported 8 since the first model was described by Lee et al. 9 in 1973, the elimination of the hepatic arterial reconstruction 10 and the introduction of the cuff anastomosis technique by Kamada et al. 11 were a major advancement in this model, because they simplified the reconstruction procedures to a great degree. In the model by Kamada et al., the hepatic rearterialization was also eliminated. Since rats could survive without hepatic arterial flow after liver transplantation, there was considerable controversy over the value of hepatic arterialization. However, the physiological superiority of the arterialized model has been increasingly acknowledged, especially in terms of preserving the bile duct system 8,12 and the liver integrity 8,13,14.
In this article, we present detailed surgical procedures for a rat model of OLT with hepatic arterial reconstruction using a 50% partial graft after ex vivo liver resection. The reconstruction procedures for each vessel and the bile duct are performed by the following methods: a 7-0 polypropylene continuous suture for the supra- and infrahepatic vena cava; a cuff technique for the portal vein; and a stent technique for the hepatic artery and the bile duct.

Orthotopic liver transplantation in rats is an indispensable experimental model for biomedical research. Here we present our surgical procedures for orthotopic rat liver transplantation with hepatic arterial reconstruction using a 50% partial graft.

Procedimientos Quirúrgicos para un modelo de rata de trasplante hepático ortotópico parcial con reconstrucción arterial hepática

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as ...

Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal models of acute ischemic stroke allows to confirm successful arterial occlusion and exclude subarachnoid hemorrhage. Cerebral perfusion monitoring can also be used to study intracranial collateral circulation, which is emerging as a powerful determinant of stroke outcome and a possible therapeutic target. Despite a recognized role of Laser Doppler perfusion monitoring as part of the current guidelines for experimental cerebral ischemia, a number of technical difficulties exist that limit its widespread use. One of the major issues is obtaining a secure and prolonged attachment of a deep-penetration Laser Doppler probe to the animal skull. In this video, we show our optimized system for cerebral perfusion monitoring during transient middle cerebral artery occlusion by intraluminal filament in the rat. We developed in-house a simple method to obtain a custom made holder for twin-fibre (deep-penetration) Laser Doppler probes, which allow multi-site monitoring if needed. A continuous and prolonged monitoring of cerebral perfusion could easily be obtained over the intact skull.

Cerebral perfusion monitoring has been demonstrated to improve accuracy in ischemic stroke models. Technical difficulties often limit the use of this essential tool for cerebrovascular research. In this video, an optimized system is shown to obtain a single or multi-site hemodynamic monitoring during intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats.

Sistema optimizado para la monitorización de la perfusión cerebral en el modelo de rata de Carrera intraluminal oclusión arteria cerebral media

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The metastatic spread of cancer is the major cause of cancer-related deaths. We provide an in-depth description of our survival surgery methodology for establishing a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model system for studying the mechanisms of metastasis in solid organ tumors.

Un &quot;paciente-Like&quot; ortotópico Singénico modelo de ratón de carcinoma hepatocelular Metástasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medición de la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón con cable miografía

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Reduced Complications after Arterial Reconnection in a Rat Model of Orthotopic Liver Transplantation

The rat orthotopic liver transplantation (OLT) model is a powerful tool to study acute and chronic rejection. However, it is not a complete representation of human liver transplantation due to the absence of arterial reconnection. Described here is a modified transplantation procedure that includes the incorporation of hepatic artery (HA) reconnection, leading to a marked improvement in transplant outcomes. With a mean anhepatic time of 12 min and 14 s, HA reconnection results in improved perfusion of the transplanted liver and an increase in long-term recipient survival from 37.5% to 88.2%. This protocol includes the use of 3D-printed cuffs and holders to connect the portal vein and infrahepatic inferior vena cava. It can be implemented for studying multiple aspects of liver transplantation, from immune response and infection to technical aspects of the procedure. By incorporating a simple and practical method for arterial reconnection using a microvascular technique, this modified rat OLT protocol closely mimics aspects of human liver transplantation and will serve as a valuable and clinically relevant research model.

The goal of this study is to modify the rat orthotopic liver transplant model to better represent human liver transplantation and improve recipient survival. The presented method reestablishes hepatic arterial inflow by connecting the donor liver&#39;s common hepatic artery to the recipient liver&#39;s proper hepatic artery.

Reducción de las complicaciones después de la reconexión arterial en un modelo de rata de trasplante hepático ortotópico

The rat orthotopic liver transplantation (OLT) model is a powerful tool to study acute and chronic rejection. However, it is not a complete representation ...