Este método permite la determinación del metabolismo natural de las células asesinas. Un parámetro clave en la activación midiendo el consumo de oxígeno y los cambios de pH en el medio extracelular. La ventaja del analizador de flujo extracelular es que está totalmente automatizado y es capaz de probar hasta 92 muestras en tiempo real con bajas cantidades de células.
Permitiendo así pantallas de alto rendimiento. Un método válido para determinar la glucólisis y la respiración en las células de la inocuidad es muy importante en la clínica. Dado que hay muchas enfermedades incluyendo la obesidad y el cáncer donde el metabolismo celular se deteriora.
Comience por pipetear 20 mililitros de medio de separación de linfocitos en un tubo cónico de 50 mililitros. Mientras mantiene el tubo en un ángulo de 30 grados, pipetee suavemente 20 mililitros de sangre sobre el medio. Creación de una interfaz visible y bien definida entre los dos fluidos.
Centrifugar los tubos durante 25 minutos a 1000 veces G.Then cuidadosamente tomar los tubos fuera de la centrífuga y colocarlos en un bastidor. Compruebe la presencia de una capa visible de células en la interfaz entre LSM y plasma. Aspirar suavemente la capa de celda mononuclear con una pipeta de plástico de 10 mililitros y colóquela en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros.
Lave las células mononucleares dos veces con 45 mililitros de PBS. Y centrifugarlos a 800 veces G durante cinco minutos. Para aislar las células o engaves asesinos naturales, cuente los mares de PVM y resuspútelos en el búfer de separación NK en un tiempo de 10 a las octavas células por mililitro.
A continuación, transfiera 10 mililitros de la suspensión celular a un nuevo tubo de 50 mililitros. Añadir 500 microlitros de mezcla de anticuerpos de aislamiento de células NK. Y 10 microlitros de anti CD tres mezcla de anticuerpos de aislamiento positivo a los PBMC.
Y incubarlos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Cuentas magnéticas de vórtice y añadir un mililitro a los PBMC y anticuerpos. Luego incubar el MIGS durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación ocasional.
Agregue 35 mililitros de tampón de aislamiento NK y coloque el tubo en el imán durante 15 minutos. Recoja cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de plástico de 50 mililitros sin tocar los lados o la parte inferior del tubo. Cuente las células y centrifúquelas a 800 veces G durante cinco minutos.
Para estimular las células NK con pasillo soluble 15, resuspender 750,000 células en 100 microlitros de IMDM que contienen 10%HS en un pozo de una placa de 96 pozos. Diluir el pasillo humano de 15 a un microgramo por mililitro en el IMDM y el 10%HS. Y añadir 100 microlitros del pasillo humano diluido 15 a las células.
Repare una muestra de control con células no estimuladas y coloque ambas muestras en la incubadora a 37 grados centígrados. Estimular las células durante 48 horas y luego realizar el ensayo de flujo extracelular. El día antes del experimento, encienda el analizador y deje que se caliente hasta 37 grados centígrados.
Abra el paquete del cartucho de censura y separe el cartucho de la placa de utilidad. A continuación, añada 200 microlitros de la solución calibrante a cada pozo de la placa de utilidad. Y vuelva a colocar el cartucho central para asegurarse de que los sensores estén completamente sumergidos.
Para obtener resultados óptimos, incuba el cartucho durante la noche a 37 grados centígrados en una incubadora libre de dióxido de carbono. Que debidamente humidificado. Para preparar una hoja recubierta adhesiva, pipetee 25 microlitros de la solución adhesiva celular a cada pozo de la placa.
E incubado a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación, retire la solución y lave la placa dos veces con 200 microlitros de agua estéril por pozo. Mantenga la placa abierta durante 15 minutos dentro de la capucha de cultivo celular para permitir que los pozos se sequen.
Centrifugar las células NK previamente aisladas añaden 200 veces G durante cinco minutos. Luego retire los sobrenadantes y lave las células en el medio de prueba de esfuerzo mitocondrial calentado o en el medio de prueba de esfuerzo de glucólisis. Pele las células de nuevo y resusppend a la concentración celular preferida en el mismo medio.
Coloca 180 microlitros de suspensión celular por pozo en la placa de ensayo. Utilice pozos A uno, A 12 H uno y H 12 como pozos de control para la corrección de fondo. Añadiendo 180 microlitros del medio de ensayo a estos Pozos Incubar la placa durante 30 minutos a 37 grados Celsius en una incubadora libre de dióxido de carbono.
Centrifugar la placa a 200 veces G durante cinco minutos. Luego observe las células bajo el microscopio para comprobar que forman una capa de mano en la parte inferior del pozo. Incubar las células durante otros 25 minutos.
Soluciones de trabajo cálidas a 37 grados centígrados. Y reajuste su pH a 7.4 si es necesario. Cargue los compuestos previamente preparados para una prueba de esfuerzo mitocondrial o para una prueba de esfuerzo de glucólisis en las placas A, B y C del cartucho de censura hidratado Vuelva a colocar el cartucho de censura cargado en la incubadora mientras configura el programa.
Para configurar el protocolo de ensayo de flujo extracelular, abra el software y utilice Definiciones de grupo para definir las condiciones de pretratamiento. Utilice la pestaña Mapa de placas para indicar los grupos de pozos que tienen condiciones similares Indicar también la corrección de fondo y los pozos vacíos. A continuación, establezca el programa en la pestaña de protocolos.
Inicie el programa y coloque el cartucho del sensor y la placa de utilidad en la bandeja. Después del paso de calibración, sustituya la placa calibrante de la placa de ensayo por las celdas conectadas. Una vez completada la ejecución, recupere los datos y analícelos.
Con el fin de evaluar la pureza y viabilidad de las células NK. Los pequeños alec Watts de los mares PVM y la población aislada de células NK fueron manchados y analizados por citometría de flujo. La pureza de la población de células NK se estableció por doble permanencia contra CD tres y CD 56 o NKP 46.
Aquí se muestra una gran tasa de consumo de oxígeno mitocondrial para las células NK humanas. Como era de esperar, los números de celda I mostraban valores de OCR más altos. Los números celulares también se correlacionan linealmente con la cantidad de ADN o proteína en el pozo.
Por otro lado, los números de celda más altos no eran óptimos. Porque tras la adición de DNP, la concentración de oxígeno en el pozo se agotó totalmente en cada ciclo. Lo que impidió el cálculo preciso del OCR.
En las células NK humanas, 100 micromolar DNP fue encontrado para ser la dosis óptima. Aquí se muestra un experimento típico de prueba de esfuerzo mitocondrial con 750.000 células NK por pozo. En esta prueba la oligomicina conduce a una disminución dramática en el consumo de oxígeno.
Y un aumento en ECAR. Lo que representa un cambio a la glucólisis y un esfuerzo para mantener los niveles celulares de ATP. La activación de las células NK por el pasillo 15 causó un aumento tanto en el consumo de oxígeno mitocondrial como en la acidificación extracelular.
La respiración basal máxima y la respiración vinculada a ATP aumentaron, pero no la fuga de protones o la respiración no mitocondrial. Además, la tasa de OCR/ECA disminuyó Indicando un cambio a un metabolismo glucolítico después de la estimulación IL 15. Al realizar este protocolo, es muy importante obtener una población celular pura y saludable para determinar el número de célula óptimo y valorar la concentración de nocabadores.
