Supported by grants from the National Institute of Health grants CA133085, CA182518 and CA185909 (to KL) and VA Merit Review Award BX001962 (to KL).

Todos los procedimientos siguen las pautas y protocolos aprobados por la Universidad de Georgia Regents Uso de Animales y el Comité de Cuidado. 1. Establecimiento de un tumor ortotópico de cáncer de mama <ol><li> Un día antes del experimento, la cultura de aproximadamente 2 x 10 6 células tumorales 4T1-Luc en una placa de cultivo de 10 cm en 10 ml de medio RPMI que contiene 10% de FBS. Incubar la placa de cultivo en un incubador de CO2 a 37 ° C y 5% de CO2. </li><li> En el día de la inyección de células tumorales, eliminar medio de cultivo de la placa de cultivo con vacío, añadir 5 ml de fosfato estéril (PBS), pH 7,4 a la placa de cultivo, y agitar suavemente el plato para lavar la superficie de cultivo, eliminar el PBS por el vacío. </li><li> Añadir 2 ml de tripsina-EDTA (0,05% de tripsina y EDTA 0,53 mM) a la placa de cultivo, se incuba en el incubador de CO2 a 37 ° C durante aproximadamente 5 min. Consultar las células en un microscopio invertido para asegurarse de que todas las células se separan de la parte inferior de la placa de cultivo. &lt;/ Li&gt; <li> Se inactiva la tripsina mediante la adición de 8 ml de medio que contiene suero, las células de transferencia a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar las células a aproximadamente 450 xg durante 3 min a TA. </li><li> Eliminar el sobrenadante por las células de vacío y volver a suspender en 10 ml de PBS. centrifugar las células a aproximadamente 450 xg durante 3 min. Eliminar el sobrenadante por vacío, y volver a suspender las células en 10 ml de PBS. </li><li> Pipeta de 10 l de la suspensión celular en un hemocitómetro bajo la cubierta de vidrio. Contar las células para determinar la concentración de células. Resuspender las células en PBS a una densidad de 2 x 10 5 células / ml de HBSS. Transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril y mantener las células en hielo hasta su uso. </li><li> Utilice hembra BALB / c ratones de 6 a 8 semanas para inyección de células tumorales. <ol><li> Afeitarse el vello cerca que rodea el pezón # 3 usando un cortador de pelo electrónico. La inyección de células 4T1 en la almohadilla de grasa mamaria glándula 3 genera de forma reproducible la metástasis de pulmón. Limpiar la zona afeitada utilizando el bastoncillo de algodón humedecido en un 70% etanol. Resuspender las células invirtiendo el tubo de microcentrífuga de 2 - 3 veces. Suavemente aspirado de 50 l de suspensión de células en un CC ½ 27 G 1/2 jeringa de tuberculina. </li><li> Inyectar las células tumorales en la almohadilla de grasa mamaria bajo el # 3 de la glándula mamaria de un ratón BALB / c. Coloque el ratón en una jaula limpia y volver a la jaula para instalación de alojamiento de los animales. Espere aproximadamente 21 - 30 días para el desarrollo del tumor. El crecimiento del tumor se debe supervisar de forma regular de acuerdo con las políticas de la institución para estudios de tumores. </li></ol></li></ol> 2. vivo Ratón La bioluminiscencia de imágenes del crecimiento tumoral <ol><li> ratones imagen cada 3 días después de la inyección de los ratones de transferencia del tumor a la facilidad de formación de imágenes. Inyectar 100 luciferina l (30 mg / ml en PBS) por vía intraperitoneal (ip) a ratones antes de la imagen. Después de aproximadamente 10 min, anestesiar los ratones en una cámara de inducción con 2% O flujo de isoflurano / 2. Utilice las pinzas para tocar la pierna del ratón. No hay respuesta al tacto confirma that el ratón es totalmente inconsciente. <ol><li> Coloque los ratones en la cámara de formación de imágenes con continua isoflurano 2% y O 2 a un caudal de 2 L / min. Coloque el ratón de tal manera que el área de interés (es decir, la almohadilla mamaria de la inyección inicial del tumor) se enfrenta a la cámara del sistema de imagen. Asegúrese de que la nariz y la boca del ratón se fijan firmemente dentro del tubo de anestesia. Los animales deben ser anestesiados por las normas veterinarias en la institución. </li></ol></li><li> Adquirir imágenes de bioluminiscencia con una variedad de diferentes tiempos de exposición. Por ejemplo, ajustar la exposición a 30, campo de visión (FOV) de 25, altura del objeto a 1,5 cm, y obtener imágenes fotográficas luminiscentes con bajo poder de rayos X. Establecer las unidades de medida de &quot;luminosidad&quot;. <ol><li> Utilice una gama de color lineal automática con un máximo de aproximadamente 10 unidades de 2,4 x 7 resplandor. Después de la adquisición de las imágenes iniciales, ajustar la configuración y obtener una imagen optimizada (Figuras 3 y 4). </li></ol></li><li> Devolver los ratones para limpiar las jaulas y garanticen los ratones a recuperar la consciencia con la deambulación antes de devolver los animales a las instalaciones de la vivienda. </li><li> Analizar los datos con el software de imagen de estar asociado con el instrumento de imagen. El uso de un programa de imágenes, trazar una línea cerrada alrededor de la región de interés (ROI). Utilice el software de imagen para determinar la intensidad de la radiación de la ROI. Registrar las intensidades relativas de cada ROI para cada ratón. NOTA: radiancia intensidades más altas indican mayores niveles de células luminiscentes, y por lo tanto un mayor crecimiento tumoral. </li><li> examinar visualmente el ratón cada 3 días para los efectos adversos. NOTA: Los ratones se pesaron una vez por semana. Una pérdida de peso de peso corporal 15% se considera efecto adverso y los ratones portadores de tumores se practicó la eutanasia como se describe en el paso también se sometieron a eutanasia 5. Los ratones con tumores ulcerados. </li></ol> 3. extirpación quirúrgica de tumores primarios NOTE: tijeras, pinzas de autoclave y los clips de la herida y la herida de aplicación de grapas (Figura 1). <ol><li> Realizar la cirugía en una campana estéril para mantener una condición estéril para reducir el riesgo de infección. Un día antes de la cirugía, se afeita el área que rodea los tumores de los ratones portadores de tumores con un cortador de pelo eléctrico. </li><li> Aproximadamente de 2 - 4 horas antes de la cirugía, a alimentar a los ratones tabletas masticables formuladas carprofeno para los ratones a una dosis de 5 mg / kg peso corporal. </li><li> Poner los ratones en una cámara que contiene 2% de isoflurano en oxígeno de aproximadamente el 30 seg. Continuamente anestesiar el ratón utilizando un aparato de anestesia durante todo el período quirúrgico. </li><li> Utilice un palillo de algodón estéril para aplicar el ungüento veterinario para los ojos del ratón para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. Utilice las pinzas para tocar la pierna del ratón. No hay respuesta al tacto confirma que el ratón es totalmente inconsciente. </li><li> Desinfectar el área de la piel alrededor del sitio del tumor con tres alternatoallitas de un exfoliante jabón desinfectante. Limpie el área quirúrgica con un 70% de alcohol limpie. </li><li> Utilice un bisturí esterilizado (Figura 1) para cortar una pequeña incisión cerca del tumor. </li><li> Inserte la punta de un par de tijeras esterilizadas a la incisión para cortar la piel alrededor del tumor para exponer el nódulo tumoral (Figura 2A). Mantenga el tumor con pinzas estériles y utilizar las tijeras para separar el tumor de la piel (figura 2B). Guardar la muestra de tumor por congelación en un congelador a -80ºC o mediante la fijación en solución de formalina al 10% para uso futuro. </li><li> Cerrar el sitio quirúrgico con 9 mm clips de la herida utilizando el aplicador de auto-clip (Figura 1). Devolver el ratón a una jaula limpia con ropa de cama en autoclave. Los animales deben ser controlados por las directrices institucionales. NOTA: El ratón usualmente recupera la conciencia suficiente y comienza a moverse en la jaula de aproximadamente el 10 - 30 minutos después de la cirugía. </li><li> Administrar carprofeno alos ratones de nuevo 24 horas después de la cirugía. El carprofeno es para la analgesia post-cirugía y la prescripción de la analgesia post-cirugía debe ser verificada mediante la consulta directa con el personal veterinario de la institución. Retire los clips de la herida después de la herida se cura (por lo general dentro de los 5 - 7 días después de la cirugía). Retire los clips de la herida utilizando el removedor de auto-clip. </li></ol> 4. vivo Ratón La bioluminiscencia de imágenes de la metástasis tumoral <ol><li> ratones imagen cada 3 días después de la cirugía tal como se describe en el paso 2. </li></ol> 5. Validación de metástasis pulmonares con tinta china La inflación de los pulmones portadores del tumor NOTA: Para validar los resultados de las imágenes en vivo de tumores luciferasa, realice la India la inflación de la tinta de los pulmones del ratón portador de un tumor para cuantificar los nódulos tumorales. Células 4T1 también metástasis a otros órganos y tejidos (Figura 5) y por lo tanto, el examen histológico de estos órganos para validar la metástasis del tumor debe realizarse si es necesario. Este uso del protocolo LUNg metástasis como un ejemplo. <ol><li> Mantener los ratones en sus jaulas existentes para la eutanasia. Cuando alojados con otros animales, reubicar los ratones no ser sacrificados a una jaula diferente. </li><li> Retire la tapa del filtro y vuelva a colocar la jaula con la parte superior del filtro de CO2. Encienda el cilindro comprimido CO 2 de gas (100%) que está conectado a la parte superior del filtro CO 2. Ajuste el caudal a 2 l / min y mantener CO 2 durante al menos 10 minutos. Si los ratones siguen respirando al final de 10 minutos, dejar el CO 2 de hasta por lo menos 1 minuto después de los ratones dejan de respirar. Desactivar el control de cilindros de CO2 y el medidor de flujo. Esperar 3 minutos más y retirar la tapa del filtro. </li><li> Coloque el ratón sacrificado en su parte posterior en una placa de poliestireno. Fijar las piernas para garantizar el acceso sin obstáculos a la tráquea. Rociar los ratones con 70% de etanol. </li><li> Con un par de tijeras, corte a lo largo de la línea media de la mitad del abdomen del ratón a través de la caja torácica y arriba hacia la salivariar glándulas. Observar la tráquea. El uso de fórceps para retirar tejidos que rodean la tráquea para exponer la tráquea. </li><li> Enhebrar una punta de la pipeta por debajo de la tráquea. Sujetando la punta con una mano, levante suavemente la tráquea hacia arriba y lejos del cuerpo. </li><li> Girar la plataforma que sostiene el ratón 180 °. Utilice un CC ½ 27 G 1/2 jeringa de tuberculina para inyectar tinta de la India (10% tinta china y 0,1% hidróxido de amonio) a los pulmones a través de la tráquea. Completamente inflar los pulmones con tinta hasta que se sintió una fuerte resistencia. </li><li> Use un par de tijeras para cortar la tráquea. El uso de fórceps para sostener el ratón e insertar otro juego de pinzas debajo de los pulmones y tirar de los lóbulos del pulmón de ratón. Enjuague el breve pulmones en un vaso que contiene agua. </li><li> En una campana de humos química, la transferencia de los pulmones a un vial de centelleo de vidrio que contiene 3 ml de solución de Fekete (50% de etanol, 6% de formaldehído y ácido acético glacial 3%). Se tapa el vial para evitar que la solución se evapore. NOTA: Los tejidos se pueden almacenar en la solución de Fekete indefinidamente. </li><li> Después de unos minutos, observar nódulos tumorales como puntos blancos en los pulmones negros (Figura 5). El nódulo tumoral blanco es visible por los ojos. La transferencia de los pulmones a un plato en una campana de humos y contar el número de manchas blancas. Cada mancha blanca representa un solo nódulo tumoral metastásico. </li></ol>

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T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene:+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease.">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Mol Cell Biol. 12, 954-961 (1992).</li><li>Almholt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+metastasis+of+transgenic+mammary+cancer+in+urokinase-deficient+mice.">Reduced metastasis of transgenic mammary cancer in urokinase-deficient mice.</a> Int J Cancer. 113, 525-532 (2005).</li><li>Gallego, M. I., Bierie, B., Hennighausen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+expression+of+HGF/SF+in+mouse+mammary+epithelium+leads+to+metastatic+adenosquamous+carcinomas+through+the+activation+of+multiple+signal+transduction+pathways.">Targeted expression of HGF/SF in mouse mammary epithelium leads to metastatic adenosquamous carcinomas through the activation of multiple signal transduction pathways.</a> Oncogene. 22, 8498-8508 (2003).</li><li>Lin, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutation+of+p53+leads+to+estrogen+receptor+alpha-positive+and+-negative+mouse+mammary+tumors+with+high+frequency+of+metastasis.">Somatic mutation of p53 leads to estrogen receptor alpha-positive and -negative mouse mammary tumors with high frequency of metastasis.</a> Cancer Res. 64, 3525-3532 (2004).</li><li>Ridgeway, A. G., McMenamin, J., Leder, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P53+levels+determine+outcome+during+beta-catenin+tumor+initiation+and+metastasis+in+the+mammary+gland+and+male+germ+cells.">P53 levels determine outcome during beta-catenin tumor initiation and metastasis in the mammary gland and male germ cells.</a> Oncogene. 25, 3518-3527 (2006).</li><li>Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+metastasis+and+CTL+adoptive+transfer+immunotherapy+mouse+model.">Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model.</a> J Vis Exp. , (2010).</li></ol>

Mice were purchased from the Jackson Laboratory and housed in the Georgia Regents University animal facility. Experiments and care/welfare were in agreement with federal regulations and an approved protocol by the Georgia Regents University IACUC committee. The authors have nothing to disclose.

Se han desarrollado muchos tipos de modelos de ratones transgénicos de la metástasis del cáncer de mama. 1 Estos ratones transgénicos tienen alta incidencia de tumor que van desde 60 a 100%. Sin embargo, la incidencia de metástasis de estos ratones transgénicos es mucho menor que la incidencia de tumores (14-100%). Las células tumorales metastatizan a LN y los pulmones en la mayoría de estos modelos de ratones transgénicos de la metástasis del cáncer de mama. La latencia metástasis varía de un mo...

Según la Sociedad Americana del Cáncer, el cáncer de mama es la forma más frecuentemente diagnosticado de cáncer en mujeres en los Estados Unidos. La detección temprana en combinación con terapias dirigidas se han desarrollado recientemente ha reducido significativamente la mortalidad de cáncer de mama en las dos últimas décadas. Sin embargo, el cáncer de mama sigue siendo la segunda causa principal de muerte por cáncer en mujeres en los Estados Unidos 1. La mayoría de las muertes de pacientes con cáncer de mama se deben a metástasis de células tumorales. Desafortunadamente, la mayoría de cáncer de mama es invasivo y frecuentemente metástasis en el ganglio linfático y, posteriormente, a órganos distantes, incluyendo el hueso, pulmón, hígado y cerebro. 1,2 no hay actualmente ningún tratamiento eficaz para el cáncer de mama metastásico. Por lo tanto, el desarrollo de agentes quimioterapéuticos y inmunoterapéuticos para suprimir el cáncer de mama metastásico es de gran importancia. cáncer de mama Varios modelos de metástasis espontánea de ratón han been desarrollado para estudiar los mecanismos moleculares que subyacen a la progresión de las células tumorales de mama y metástasis y para ser utilizados como modelos para el desarrollo de agentes terapéuticos. 1,3-5 Sin embargo, la mayoría de estos modelos de ratón son modelos de tumores genéticos que, mientras excelentes modelos para mecanicista estudios, no son adecuados para el ensayo de agentes terapéuticos desde la metástasis toma meses para desarrollar en estos modelos genéticos, requiriendo por lo tanto la administración costosa a largo plazo de los agentes anti-cáncer. progresión tumoral 6,7 Monitoring en ratones vivos también es técnicamente difícil. Por el contrario, un modelo de metástasis de cáncer de mama trasplantado tiene las ventajas de la progresión del tumor a corto plazo y fácil de seguimiento de la progresión tumoral en ratones vivos. El modelo de ratón de metástasis espontánea 4T1 ortotópico de cáncer de mama es un modelo de tumor trasplantado tales. 8 En este modelo, las células de tumor de mama se trasplantan en la almohadilla de grasa mamaria de establecer nódulos tumorales primarios. El tumor primarioa continuación, se pueden extirpar quirúrgicamente como en pacientes con cáncer de mama humano. 4T1 células tumorales son altamente invasivos. 8,9, 3,10 Casi todos los portadores de tumores desarrollan metástasis en ratones 30 días después del trasplante del tumor en la almohadilla de grasa mamaria. Sin embargo, los tumores 4T1 crecer agresivamente en los sitios primarios y los tamaños de los tumores a menudo exceden los límites que se permiten en la mayoría de los animales protocolos. En esta etapa, las metástasis son a menudo micrometástasis. Por lo tanto, es esencial para eliminar los tumores primarios para permitir el progreso metástasis para el ensayo de agentes terapéuticos. Aquí, se presenta el establecimiento de un procedimiento simple y sin embargo sensible de trasplante de tumor primario, la extirpación quirúrgica del tumor primario y la bioluminiscencia cuantificación basada en imágenes del crecimiento tumoral y la progresión 4T1 in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="973">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Ami-X Imaging System&#160;</td>
			<td style="width:437px;">Spectral Instruments Imaging Inc. Tucson, AZ</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">IsoTec SurgiVet</td>
			<td style="width:437px;">Anesthesia Service &#38; Equipment , Inc., Atlanta, GA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AutoClip Physicians Kit</td>
			<td style="width:437px;">Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD</td>
			<td style="width:119px;">427638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">9 MM AutoClip Applier&#160;</td>
			<td style="width:437px;">Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD</td>
			<td style="width:119px;">427630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">9 MM AutoClip Remover</td>
			<td style="width:437px;">Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD</td>
			<td style="width:119px;">427637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">9 MM AutoClip Wound Clip</td>
			<td style="width:437px;">Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD</td>
			<td style="width:119px;">427631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Sharp-Pointed Dissecting Scissors</td>
			<td style="width:437px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">8940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting Fine-Pointed Forceps</td>
			<td style="width:437px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1/2 CC 27G1/2 tuberculin syringe&#160;</td>
			<td style="width:437px;">Becton Dickinson and Co. NJ&#160;</td>
			<td style="width:119px;">305620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:437px;">Mediatech Inc</td>
			<td style="width:119px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">PBS</td>
			<td style="width:437px;">Mediatech Inc</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:437px;">Ultrapure-usa.com</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:437px;">Mediatech Inc</td>
			<td style="width:119px;">25-040-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis

La metástasis es la causa principal de mortalidad de los pacientes de cáncer de mama. El mecanismo que subyace a la metástasis de células de cáncer, incluyendo la metástasis del cáncer de mama, es en gran parte desconocida y es un foco en la investigación del cáncer. Se han establecido varios modelos de cáncer de mama espontáneos metástasis del ratón. Aquí, se presenta un procedimiento simplificado para establecer tumor primario del cáncer de mama y trasplantado ortotópico resultante metástasis espontánea que imitan la metástasis del cáncer de mama humano. En combinación con la formación de imágenes del tumor en vivo bioluminiscencia, este modelo de ratón permite el crecimiento del tumor y la cinética de progresión a controlar y cuantificados. En este modelo, se inyectó una dosis baja (1 x 10 4 células) de las células de cáncer de mama 4T1-Luc en / c de mama de ratón BALB almohadilla de grasa usando una jeringa de tuberculina. Los ratones fueron inyectados con luciferina y la imagen en varios puntos de tiempo utilizando un sistema de imagen bioluminiscente. Cuando los tumores primarios crecieron hasta el límite de tamaño como en el protocolo aprobado por el IACUC (aproximately 30 días), los ratones fueron anestesiados bajo flujo constante de 2% de isoflurano y oxígeno. El área del tumor fue esterilizada con 70% de etanol. La piel del ratón alrededor del tumor se extirpó para exponer el tumor que se retiró con un par de tijeras estériles. La eliminación del tumor primario se extiende la supervivencia de los ratones portadores de tumor 4T-1 durante un mes. Los ratones fueron entonces repetidamente con imagen formada por tumor metastásico propagación a órganos distantes. Los agentes terapéuticos pueden ser administrados para suprimir la metástasis tumoral en este punto. Este modelo es simple y, sin embargo sensible para cuantificar el crecimiento de células de cáncer de mama en el sitio primario y la cinética de la progresión a órganos distantes, y por lo tanto es un excelente modelo para estudiar el crecimiento del cáncer de mama y la progresión, y para el ensayo de agentes anti-metástasis terapéuticos y inmunoterapéuticos in vivo .

Establecimiento de mama Cáncer de ratón modelo ortotópico 4T1 es una línea celular de carcinoma de mama agresivo. La inyección de tan poco como 1 x 10 4 células en la almohadilla de grasa mamaria puede conducir a la creación de un solo nódulo tumoral en el sitio de la inyección (Figura 2A). Por lo tanto, el tumor imita carcinoma de mama primario humano. Casi el 100% ratones desarrollan el tumor ortotópico. El tamaño del tumor...

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An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis

Un modelo de tumor primario de cáncer de mama ortotópico y la extirpación quirúrgica del tumor primario para extender la vida del ratón para generar metástasis espontánea se describen. El crecimiento del tumor y la progresión se supervisan y se cuantificaron por imágenes de fluorescencia de la luciferasa.

Un modelo de ratón ortotópico de cáncer de mama metástasis espontánea

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

30.5K vistas.  Augusta University.  Un modelo de tumor primario de cáncer de mama ortotópico y la extirpación quirúrgica del tumor primario para extender la vida del ratón para generar metástasis espontánea se describen. El crecimiento del tumor y la progresión se supervisan y se cuantificaron por imágenes de fluorescencia de la luciferasa. 

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An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Un modelo ortotópico de cáncer de vejiga murino

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Investigación

Medicina

Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

During metastasis cancer cells disseminate from the primary tumor, invade into surrounding tissues, and spread to distant organs. Metastasis is a complex process that can involve many tissue types, span variable time periods, and often occur deep within organs, making it difficult to investigate and quantify. In addition, the efficacy of the metastatic process is influenced by multiple steps in the metastatic cascade making it difficult to evaluate the contribution of a single aspect of tumor cell behavior. As a consequence, metastasis assays are frequently performed in experimental animals to provide a necessarily realistic context in which to study metastasis. Unfortunately, these models are further complicated by their complex physiology. The chick embryo is a unique in vivo model that overcomes many limitations to studying metastasis, due to the accessibility of the chorioallantoic membrane (CAM), a well-vascularized extra-embryonic tissue located underneath the eggshell that is receptive to the xenografting of tumor cells (figure 1). Moreover, since the chick embryo is naturally immunodeficient, the CAM readily supports the engraftment of both normal and tumor tissues. Most importantly, the avian CAM successfully supports most cancer cell characteristics including growth, invasion, angiogenesis, and remodeling of the microenvironment. This makes the model exceptionally useful for the investigation of the pathways that lead to cancer metastasis and to predict the response of metastatic cancer to new potential therapeutics. The detection of disseminated cells by species-specific Alu PCR makes it possible to quantitatively assess metastasis in organs that are colonized by as few as 25 cells. Using the Human Epidermoid Carcinoma cell line (HEp3) we use this model to analyze spontaneous metastasis of cancer cells to distant organs, including the chick liver and lung. Furthermore, using the Alu-PCR protocol we demonstrate the sensitivity and reproducibility of the assay as a tool to analyze and quantitate intravasation, arrest, extravasation, and colonization as individual elements of metastasis.

Using quantitative PCR, we demonstrate how the well-established chick CAM model can be used to quantitatively analyze the metastasis of human tumor cells to distant organs.

Análisis cuantitativo de la metástasis del cáncer utilizando un modelo de embrión aviar

During metastasis cancer cells disseminate from the primary tumor, invade into surrounding tissues, and spread to distant organs. Metastasis is a complex ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotón imágenes de invasión de células tumorales en un modelo de ratón ortotópico de carcinoma oral de células escamosas

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

Imágenes in vivo de tumores bioluminiscencia Dinámica hipoxia de la metástasis cerebral cáncer de mama en un modelo de ratón

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the understanding of the mechanics of tumor invasion, and direct intracerebral inoculation of tumor provides the opportunity of observing the invasive process in a physiologically appropriate environment2. As far as human brain tumors are concerned, the orthotopic models currently available are established either by stereotaxic injection of cell suspensions or implantation of a solid piece of tumor through a complicated craniotomy procedure3. In our technique we harvest cells from tissue culture to create a cell suspension used to implant directly into the brain. The duration of the surgery is approximately 30 minutes, and as the mouse needs to be in a constant surgical plane, an injectable anesthetic is used. The mouse is placed in a stereotaxic jig made by Stoetling (figure 1). After the surgical area is cleaned and prepared, an incision is made; and the bregma is located to determine the location of the craniotomy. The location of the craniotomy is 2 mm to the right and 1 mm rostral to the bregma. The depth is 3 mm from the surface of the skull, and cells are injected at a rate of 2 &mu;l every 2 minutes. The skin is sutured with 5-0 PDS, and the mouse is allowed to wake up on a heating pad. From our experience, depending on the cell line, treatment can take place from 7-10 days after surgery. Drug delivery is dependent on the drug composition. For radiation treatment the mice are anesthetized, and put into a custom made jig. Lead covers the mouse's body and exposes only the brain of the mouse. The study of tumorigenesis and the evaluation of new therapies for GBM require accurate and reproducible brain tumor animal models. Thus we use this orthotopic brain model to study the interaction of the microenvironment of the brain and the tumor, to test the effectiveness of different therapeutic agents with and without radiation.

The purpose of this article is to describe the use of an orthotopic glioblastoma model for chemoradiation studies. This article will go though cell processing, implanting, and radiotherapy of the mouse using an intracranial model.

Combinación de radioterapia en un modelo ortotópico de tumor cerebral del ratón

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the ...

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer cells into immunodeficient mice. Subcutaneous xenograft models have been valuable for preclinical screening and evaluation of new therapeutic treatments. There are a number of advantages to using a subcutaneous model; 1) rapid, 2) reproducible, and 3) tumor establishment, growth, and response to therapeutic agents may be monitored by visual inspection. However, substantial evidence has shed light on the short-comings of subcutaneous xenograft models1-3. For instance, medicinal treatments demonstrating curative properties in subcutaneous xenograft models often have no notable impact on the human disease. The microenvironment of the site of xenographic transplantation or injection lies at the heart of this dissimilarity.
Orthotopic tumor xenograft models provide a more biologically relevant context in which to study the disease. The advantages of implanting diseased cells or tissue into their anatomical origin equivalent within a host animal includes a suitable site for tumor-host interactions, development of disease-related metastases and the ability to examine site-specific influence on investigational therapeutic remedies. Therefore, orthotopic xenograft models harbor far more clinical value because they closely reproduce human disease. For these reasons, a number of groups have taken advantage of an orthotopic thyroid cancer model as a research tool4-7.
Here, we describe an approach that establishes an orthotopic model for the study of anaplastic thyroid carcinoma (ATC), which is highly invasive, resists treatment, and is virtually fatal in all diagnosed patients. Cultured ATC cells are prepared as a dissociated cellular suspension in a solution containing a basement membrane matrix. A small volume is slowly injected into the right thyroid gland. Overall appearance and health of the mice are monitored to ensure minimal post-operative complications and to gauge pathological penetrance of the cancer. Mice are sacrificed at 4 weeks, and tissue is collected for histological analysis. Animals may be taken at later time-points to examine more advance progression of the disease. Production of this orthotopic mouse model establishes a platform that accomplishes two objectives: 1) further our understanding of ATC pathology, and 2) screen current and future therapeutic agents for efficacy in combating ATC.

Generation of an orthotopic mouse model of anaplastic thyroid carcinoma is described here. This technique employs surgical placement of human anaplastic thyroid cancer cells into the thyroid of immunodeficient mice, thus creating a more clinically relevant setting to study disease progression as well as screen innovative therapeutic interventions.

Un modelo de ratón ortotópico de carcinoma de tiroides anaplásico

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

Un modelo ortotópico de cáncer de vejiga de Estudios de liberación de genes

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%. New therapeutic options are critically needed and depend on improved understanding of pancreatic cancer biology. To better understand the interaction of cancer cells with the pancreatic microenvironment, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression. Luciferase-tagged pancreatic cancer cells are resuspended in Matrigel and delivered into the pancreatic tail during laparotomy. Matrigel solidifies at body temperature to prevent leakage of cancer cells during injection. Primary tumor growth and metastasis to distant organs are monitored following injection of the luciferase substrate luciferin, using in vivo imaging of bioluminescence emission from the cancer cells. In vivo imaging also may be used to track primary tumor recurrence after resection. This orthotopic model is suited to both syngeneic and xenograft models and may be used in pre-clinical trials to investigate the impact of novel anti-cancer therapeutics on the growth of the primary pancreatic tumor and metastasis.

Improved understanding of pancreatic cancer biology is critically needed to enable the development of better therapeutic options to treat pancreatic cancer. To address this need, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression using in vivo bioluminescence imaging.

Modelo ortotópico bioluminiscente de la progresión del cáncer de páncreas

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Un modelo murino de cáncer de próstata humano Metástasis ortotópico

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Inicio de la metástasis de carcinoma de mama mediante la Focalización del epitelio ductal con adenovirus Cre: Un modelo de ratón transgénico de Novela del Cáncer de Mama

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...