Este protocolo proporciona una forma rápida de evaluar los efectos de la caída del gen WC5, que es la causa más común de epilepsia focal. La principal ventaja de esta técnica es que podemos utilizarla para evaluar la epilepsia, como fenotipo utilizando características tanto conductuales como fisiológicas en diversas etapas del desarrollo. Un día antes de la microinyección, configure los tanques de apareamiento del pez cebra.
En la mañana de la inyección, retire los divisores para permitir el desove. Use un tamiz fino para transferir los huevos a placas de Petri de 100 milímetros, llenas de agua embrionaria. Usando una pipeta Pasteur de plástico, elija de 60 a 80 huevos y coloque los huevos en una placa de Petri recubierta de silicona para la inyección.
movemos la mayor parte del agua, dejando lo justo para cubrir los huevos a mitad de camino. Coloque una aguja de vidrio verticalmente en un tubo de solución inyectable. Permita que la solución coloreada llene el tubo por acción capilar durante un período de varios minutos.
Cuando la solución de inyección esté visible en la punta de la aguja, monte la aguja en el mango de inyección del microinyectores y encienda el compresor de aire. Ajuste el ajuste de presión para generar un volumen de inyección de dos nanolitros. Y para colocar los huevos bajo un microscopio binocular de disección, con un aumento de cuatro veces.
Inserte la punta de la aguja a través del corion y la yema de embriones de una sola etapa para inyectar la solución directamente dentro de cada célula. Luego transfiera los embriones inyectados a una placa de Petri de 100 milímetros etiquetada de agua embrionaria y coloque la placa en una incubadora de 28 grados centígrados. 28 horas después de la fertilización, coloque una rejilla de malla de plástico de 1.2 por 1.2 milímetros en la parte inferior del plato de prueba.
Use una pipeta Pasteur de plástico para colocar de 10 a 12 embriones dentro de sus coriones en la malla de plástico. Llene el plato con suficiente agua embrionaria para mantener el embrión sumergido, pero no flotando, moviendo cuidadosamente los embriones con una punta de plástico en posición en la rejilla según sea necesario. Luego, usando una cámara de video conectada a un microscopio de disección, registre la actividad espontánea de enrollamiento durante 10 a 20 minutos.
Para analizar el movimiento espontáneo total, utilice el módulo de cuantificación de actividad en un sistema de laboratorio de Zebra para cargar el video grabado y diseñar las arenas de seguimiento alrededor de cada embrión según corresponda. Establezca los umbrales de congelación y ráfaga en 10 y 50 respectivamente. Y cuando el análisis de video automatizado, que cuantifica la actividad total dentro de cada una de las arenas definidas.
Luego recupere el conjunto de datos como una hoja de cálculo para realizar el análisis, utilizando el software de análisis de datos apropiado. 46 horas después de la fertilización, use pinzas finas para descoronar los embriones y llene un plato de prueba de 130 milímetros con agua de embriones. Al menos 15 minutos antes del descanso, caliente el plato de prueba en una incubadora de 28 grados centígrados.
Para realizar una prueba de respuesta de escape evocada al tacto, use una pipeta Pasteur de plástico para colocar un embrión en el centro del plato de prueba, debajo de la cámara. Comience la grabación, utilizando una velocidad de adquisición de 30 fotogramas por segundo. Usando una punta de plástico fino, toque ligeramente la cola del embrión con un movimiento de movimiento.
Detener el registro, cuando la larva ha terminado su movimiento. Luego, transfiera el embrión a un nuevo plato de retención lleno de agua fresca para embriones y repita la prueba con tantos embriones como sea necesario para cada condición experimental. Para preparar el pez cebra para el análisis electrofisiológico, coloque uno, cuatro a seis días después de la fertilización del pez en una placa de Petri con fondo de vidrio.
Retire cualquier exceso de medio marinero adicional para asegurarse de que el pescado estará lo más cerca posible del fondo del plato. Use una pipeta pasteur de plástico para agregar suficientes agros líquidos calientes para cubrir la larva. Mientras que los agros se endurecen, use forrórceps finos para orientar el lado ventral del pez hacia abajo en el centro del plato.
Luego agregue dos mililitros de solución de grabación, que contiene 10 bromuro de pancuronio micromolar al plato para bloquear la transmisión neuromuscular. A continuación, llene un micropipete con una solución de grabación y use un amplificador de abrazadera de parche en la configuración de abrazadera de voltaje, para medir la resistencia del electrodo en el baño y confirmar su valor correcto. Usando un objetivo 20x, coloque la cabeza de la larva en el campo de visión central y baje el micropipeto para alcanzar la posición de grabación dentro del tectum óptico.
cambie el amplificador de abrazadera de parche a la configuración de abrazadera actual y fije la corriente de retención a cero miliamperios. Utilizando un filtro de paso bajo de un kilohercio, y una tasa de adquisición de un kilohercio, y una ganancia digital de 10, registre la actividad espontánea de los peces durante 60 minutos para determinar los niveles de actividad basales. Al final del registro de referencia, a 143 microlitros de una solución de pentilentetrazol de 300 milimolares por litro al baño, para una concentración final de 20 milimolares por litro.
Registre la actividad neuronal del animal en solución de pentilentetrazol durante otros 120 minutos. Durante el período basal del registro, de cuatro a seis días después de la fertilización, los modelos epilépticos de peces cebra demuestran una mayor ocurrencia de eventos espontáneos, mientras que los peces de control de desajuste muestran muy pocas fluctuaciones. Después de la aplicación de pentilentetrazol, tanto el control de desajustes como los modelos epilépticos de peces cebra exhiben un mayor número de eventos de polarización profunda.
Durante el primer período después de la aplicación de pentilentetrazol, se observa una tasa de 0,8 eventos por minuto tanto en el control de desajustes como en los animales derribados, para los cuales la mayoría de los eventos son de alta amplitud. Durante este último período de respuesta. La tasa de eventos de despolarización aumenta a alrededor de un evento por minuto.
Y la mayoría de los eventos son de baja amplitud. Al realizar el derribo, es muy importante establecer la dosis correcta de morfolinos utilizando una curva de dosis-respuesta y realizar controles para evitar las toxicidades inespecíficas. Este impulso permite varios estudios posteriores, incluida la prueba de los efectos de los modificadores genéticos o químicos.
Y el comportamiento del pez cebra y la actividad de las actividades neuronales para comprender los efectos en el desarrollo de las cinco mutaciones de DC.
