Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud subvenciones EY0081 y 5T32UY07145 y por la Fundación Ojos Caballeros Templarios. Jason Rihel es miembro de Bristol-Squibb de las Ciencias de la Vida Fundación para la Investigación.

Este protocolo describe los pasos para llevar a cabo la respuesta de Visual-Motor de larvas de pez cebra a los incrementos y decrementos de la luz en su propio laboratorio. Pez cebra son un modelo ideal para estudios de comportamiento. Son fáciles de mantener, tienen gran tamaño del embrague, y se desarrollan rápidamente. Por ejemplo, los ojos de las larvas de pez cebra son sensibles a la luz el día 3 de desarrollo y de momento en el que muestran una respuesta de sobresalto. Parte 1: Revestimiento de cada pez en una placa de 96 pocillos <ol><li> Crecen las larvas PESO bajo un ciclo luz / oscuridad a 28 ° C hasta por lo menos 4 días después de la fertilización (dpf). Nuestra típica luz: oscuridad ciclo es de 14 horas de las luces en partir de las 9:00 AM, y 10 horas de las luces apagadas, a partir de las 11:00 PM. Para obtener los mejores resultados de comportamiento, evitar el hacinamiento, que suelen mantener no más de 50 larvas en una sola placa de Petri. </li><li> Después de 4 dpf, el pez cebra está listo para ser transferido a una placa de 96 pocillos. Para dar más espacio a las larvas de natación, que suelen utilizar una placa de 96 pocillos con un amplio y tamaño de 650 l, sin embargo, el estándar de 96 placas de funcionar bien. Usando una pipeta de plástico, con cuidado de transferencia de una larva por cada pozo. </li><li> Después de transferir los peces en los pozos, llene cada pozo con peces de agua suficiente como para que la superficie del agua está casi al ras de la parte superior de los pozos. Ya sea el sobrellenado o llenado insuficiente del bien pueden causar problemas ópticos para la grabación de la cámara. Además, tenga cuidado de no introducir burbujas en los pocillos. </li></ol> Parte 2: Estudio de los aparatos de grabación Para esta parte del protocolo, por favor refiérase a la película para identificar los componentes y para familiarizarse con nuestra puesta en marcha de los aparatos de grabación. <ol><li> Dentro de la cámara de grabación es un lugar bien definido en la posición de la placa de 96 pocillos. </li><li> La cámara se coloca en la espalda y se centra en la placa usando los espejos de la caja. El ángulo de los espejos puede ajustarse girando los tornillos que sujetan los espejos en su lugar. </li><li> La cámara de grabación se ilumina desde la parte inferior por LEDs infrarrojos. Esto permite a la cámara para ver a los peces, incluso en la oscuridad. Las larvas no pueden detectar la luz infrarroja, por lo que esta constante iluminación de infrarrojos no afecta a la experiencia. LED blancos también iluminar la cámara de registro desde abajo. Que se controlan por separado de las luces de IR. Iluminación de la cámara con luz blanca desde arriba o desde los lados es ciertamente posible, sin embargo, en esos casos, se debe tener cuidado para evitar una fuerte mira la superficie del agua que pueden interferir con la cámara. </li><li> Para los experimentos que duran más de un par de horas, llenar la cámara con suavemente con agua corriente para ayudar a mantener una temperatura constante durante el tiempo experimental. Una forma de lograr un flujo constante de agua para bombear agua de un depósito por una pequeña bomba de acuario que se calienta a 28 ° con un calentador de acuario submarino típico. </li><li> Para minimizar la vibración se apartan de la habitación, la unidad de grabación de todo debe sentarse sobre una mesa balance pesado. </li></ol> Parte 3: Alineación de la placa de 96 pozos con la red informática de la vídeo-seguimiento Software <ol><li> Coloque la placa de 96 pocillos que contienen el pescado en la cámara de grabación. </li><li> Cuando se utiliza un baño de agua, lentamente, se coloca la placa en el agua, lo que el nivel del agua la oportunidad de adaptarse sin derramar en el plato. Por otra parte, cerrar el flujo de agua, añadir el plato, y luego reanudar el flujo. Además, asegúrese de usar un resorte o una banda elástica para sujetar la placa de 96 pozos en el lugar. </li><li> En el software de VideoTrack punto de vista, comprobar que todas las larvas de su experimento son visibles en la pantalla del ordenador. Uso de los controles del software, alinear la red del software de vídeo-seguimiento de los pozos de la placa de tal manera que cada pez se encuentra dentro de una plaza de la parrilla. El equipo de seguimiento será el cálculo de los movimientos por separado para cada una de estas cajas, por lo que si desalinear la red de computadora algunos de los movimientos de los peces se pueden perder. O peor aún: dos peces adyacentes ocupan la misma área y ser contado como un pez. Este paso es muy importante para todas sus grabaciones. </li><li> Después de la alineación, el programa de tiempo para cuando las luces se encienden y se apagan. Por lo general permite 3 horas de adaptación a la luz o la oscuridad en el cuadro, tanto para obtener un nivel de actividad de referencia, sino también para dar las larvas de una oportunidad para calmarse después de la pipeta y la manipulación. Después de la línea de base, que luego alterna con 30 minutos de las luces en seguida a los 30 minutos de las luces apagadas, y repetir varias veces. </li><li> A continuación, cierre la puerta de la cámara de grabación y comenzar la grabación. </li><li> En la práctica, registrar la actividad de cada uno de los peces por segundo, pero el software de punto de vista, de hecho, los registros de la trama por trama de datos (se refieren a la películapara una demostración de la recogida de datos). Establecer el valor umbral para el cambio de los píxeles mínimo por cuadro dependerá un poco de su cámara en particular y la configuración de la luz. Para nuestra configuración, por lo general utilizan un umbral de 4 píxeles, es decir, si menos de 4 píxeles están cambiando, se considera de fondo. Si hay más de 4 píxeles se están moviendo, indica que el pescado esté en movimiento. Empíricamente determinado que este corte detecta casi todos los movimientos de natación de larvas y vuelta. </li><li> A pesar de que las cajas de registro de aislar las larvas bastante bien, apagar la luz de la habitación y tener cuidado para minimizar las interrupciones con el ruido mecánico, tales como abrir y cerrar las puertas de la sala, con una fiesta de baile, o hacer sus rutinas de ejercicio. </li></ol> Parte 4: Análisis de los datos <ol><li> Después de que el experimento se ha completado, la transferencia de los datos recogidos en una hoja de Excel o en su suite de análisis favorita. </li><li> La adjunta hoja de Excel es un ejemplo de lo que los datos pueden ser: que contiene el tiempo en segundos desde el inicio del experimento y la actividad de cada larva por segundo para todos los peces durante todo el experimento (ver datos adicionales Ejemplo de archivo de la sección Archivos de esta página). </li><li> La figura 1 muestra un ejemplo de la actividad de una sola larva. La figura 2 es una huella representativa del promedio de 40 larvas de pez cebra WT. El promedio de ON y OFF respuestas son importantes y consistentes. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_9/923_Figure-02.png" alt="Figura 1" width="569" height="398" /> Figura 1: Actividad de un solo pez La actividad de un solo pez PESO menos 5 fdd en respuesta a la alternancia de períodos de 30 minutos-luz de encendido y apagado.. Las respuestas sobre se indican con flechas de color negro y las respuestas OFF con flechas rojas. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_11/923_Figure-03.png" alt="Figura 2" width="577" height="387" /> Figura 2: La actividad promedio de 40 peces La actividad media de 40 peces PESO menos 5 fdd en respuesta a la alternancia de períodos de 30 minutos-luz de encendido y apagado.. El promedio de ON (flechas en negro) y OFF (flechas rojas) las respuestas son importantes y consistentes. </li></ol> 5. Resultados representante La Figura 3 es un plan esquemático del esquema experimental utilizado en todos nuestros experimentos. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_12/923_Figure-04.png" alt="Figura 3" width="530" height="479" /> Figura 3. El diseño experimental de la respuesta visual del motor (VMR) prueba. Un pez) individuales se colocan en una placa de 96 pozos en una cámara de grabación. La actividad de cada pez se mide por segundo. B) los peces se les da un período de adaptación a la oscuridad o la luz para su liquidación y para obtener un nivel de actividad de base. Períodos de 30 minutos las luces y las luces se introducen de manera consecutiva para un total de 3 horas. Este diagrama es una adaptación de Prober et al., 2006. ¿Qué significan los gráficos de la respuesta visual-motor parece? Se midió la respuesta de encendido y apagado de los peces WT a incrementos y decrementos de la luz. Para confirmar que estas respuestas se depende de la función del ojo, se midió la actividad de los mutantes chk, que no desarrollan ningún ojos. La Figura 4 muestra la actividad media obtenida de animales WT, así como los mutantes chk. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_13/923_Figure-05.png" alt="Figura 4" width="489" height="212" /> Figura 4: pescado PESO tienen claro ON y OFF respuestas que están mediadas por la mirada lateral El comportamiento locomotor de las larvas de pez cebra a 5 fdd en respuesta a los 30 minutos de la luz y 30 minutos de apagado la luz se registra por segundo.. Cada trazo representa un promedio de 480 respuestas de 120 individuales WT (azul traza) o chk larvas mutantes (naranja traza) registró más de tres experimentos. Los mutantes chk no aumenten considerablemente su actividad a la luz ya sea incrementos o decrementos y tienen un nivel basal bajo de actividad. Esta figura es una adaptación de Emran et al., 2007. Visual-Motor Las respuestas de los peces mutantes NRC. El mutante NRC se pensaba que era completamente ciega basada en la prueba okr. En el mutante NRC, los terminales de los fotorreceptores no se forman adecuadamente y la vía visual El se ve gravemente comprometida 1. Grabaciones de células ganglionares de la retina de los peces mutantes reveló que exhiben predominantemente fuera de tipo respuestas de las células ganglionares, algunos anormales ON-OFF, pero no puro en las respuestas de tipo 2. Mediante la prueba de VMR se demostró que el mutante NRC ha normal OFF-respuesta y un retrasado y lento en la respuesta (síe Figura 5). Por lo tanto, el mutante NRC no es completamente ciego como se pensaba anteriormente 2. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_14/923_Figure-06.png" alt="Figura 5" width="591" height="244" /> Figura 5: mutats NRc aumentar su actividad en respuesta a cambios en la intensidad de la luz Las respuestas de comportamiento a la luz de encendido y apagado de WT y larvas NRC mutante de 5 fdd.. Cada trazo representa un promedio de 480 respuestas de 120 de peces individuales de cada genotipo. El comportamiento locomotor promedio de mutantes NRC (trazas de color rosa) se reduce ligeramente en comparación con los peces WT (azul) se mantiene vigorosa, pero siguiendo la luz OFF de estímulo. Tenga en cuenta el tiempo de subida lenta en la respuesta de la NRC mutante a la luz en comparación con la luz en la respuesta de los peces WT.

<ol>
	<li>Allwardt, A. B., Lall, B. A., Brockerhoff, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+is+arrested+in+retinal+photoreceptors+of+the+zebrafish+nrc+mutant.">Synapse formation is arrested in retinal photoreceptors of the zebrafish nrc mutant.</a> J Neurosci. 21, 2330-2330 (2001).</li><li>Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OFF+ganglion+cells+cannot+drive+the+optokinetic+reflex+in+zebrafish.">OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 19126-19126 (2007).</li><li>Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypocretin/orexin+overexpression+induces+an+insomnia-like+phenotype+in+zebrafish.">Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish.</a> J Neurosci. 26, 13400-13400 (2006).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , (2000).</li></ol>

Los procedimientos experimentales se muestra en la película son representativos de los peces WT. Sin embargo, estos experimentos se puede hacer de forma análoga en los peces mutantes, así (véase la sección representativa de resultados). Sugerimos a los peces placa WT y peces mutantes en el mismo plato en un esquema de tablero de ajedrez para el control óptimo. Cuando se utilizan peces mutantes en el mismo plato como el pescado PESO asegurarse de que usted anote qué tipo de peces se colocaron en cada pozo. Aquí está una suge...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microplate devices</td>
<td>Tool</td>
<td>Whatman</td>
<td>7701-1651</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer pipetes</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>202205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fish water</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>refer to reference #4</td>
</tr>
<tr>
<td>Recording chambers (Zebrabox)</td>
<td>Tool</td>
<td>Viewpoint Lifesciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Videotrack Software</td>
<td>Tool</td>
<td>Viewpoint Lifesciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a behavioral assay to measure responsiveness of zebrafish to changes in light intensities 

El reflejo de optocinético (okr) es un reflejo básico visual exhibida por la mayoría de los vertebrados y juega un papel importante en la estabilización de los ojos con respecto a la escena visual. Sin embargo, el okr requiere que el animal detecta franjas en movimiento y es posible que los peces que no presentan un okr no puede ser completamente ciego. Un pez cebra mutante, la c no optocinético respuesta (NRC) no tiene okr bajo cualquier condición de iluminación a prueba y se informó a ser completamente ciego. Anteriormente, hemos demostrado que fuera de actividad de las células ganglionares se pueden grabar en estos mutantes. Para determinar si los peces mutantes sin okr como el mutante NRC puede detectar incrementos y decrementos de luz simples, hemos desarrollado el análisis visual del comportamiento motor (VMR). En este ensayo, larvas de pez cebra solo se colocan en cada pocillo de una placa de 96 pocillos que permite el control simultáneo de las larvas utilizando un sistema automatizado de vídeo-seguimiento del sistema. Las respuestas del aparato locomotor de cada larva a 30 minutos de luz ON y 30 minutos de luz fueron grabados y cuantificados. PESO peces tienen un breve repunte de la actividad motora en las luces, conocida como la respuesta de sobresalto, seguido por el retorno a la menor a la actividad de referencia, llamado el congelamiento. PESO pescado también aumentar bruscamente su actividad locomotora inmediatamente después de luces apagadas y sólo gradualmente (durante varios minutos) volver a la actividad basal del aparato locomotor. Los mutantes NRC responden de manera similar a la luz OFF como el pescado WT, pero presentan una ligera reducción en su actividad promedio en comparación con los peces WT. La actividad motora en respuesta a la luz el NRC en los mutantes se ha retrasado y lento. Hay un tiempo lento aumento de la respuesta de la NRC mutante a la luz en comparación con la luz PESO EN respuesta. Los resultados indican que los peces NRC no son completamente ciegos. Debido a que los teleósteos pueden detectar la luz a través de la retina no-tejidos, que confirmó que las respuestas inmediatas del comportamiento de los cambios de intensidad de luz requieren los ojos intactos con la chokh (chk) mutantes que carecen por completo de los ojos desde las primeras etapas de desarrollo. En nuestro ensayo VMR, los mutantes chk no presentan respuesta de sobresalto a la luz ya sea encendido o apagado, que muestran que los ojos laterales mediar en este comportamiento. El ensayo se describe aquí VMR complementa el ensayo okr bien establecida, que no pone a prueba la capacidad de las larvas de pez cebra para responder a los cambios en la intensidad de la luz. Además, la automatización del ensayo VMR se presta a la selección de alto rendimiento de los defectos de intensidad de la luz impulsado por las respuestas visuales.

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A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

Hemos desarrollado la respuesta de Visual-Motor para cuantificar la potencia del motor de larvas de pez cebra en respuesta a incrementos de la luz y disminuye. También se examinaron el pez cebra mutantes de visión, incluyendo la no respuesta optocinético (NRC) de los mutantes, lo que se pensaba que eran completamente ciegos cuando se probó por otro ensayo de la visión, el reflejo de optocinético.

Un ensayo de conducta para medir la capacidad de respuesta de pez cebra a cambios en la intensidad de luz

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

16.2K vistas.  Harvard. Hemos desarrollado la respuesta de Visual-Motor para cuantificar la potencia del motor de larvas de pez cebra en respuesta a incrementos de la luz y disminuye. También se examinaron el pez cebra mutantes de visión, incluyendo la no respuesta optocinético (NRC) de los mutantes, lo que se pensaba que eran completamente ciegos cuando se probó por otro ensayo de la visión, el reflejo de optocinético.

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Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microinyecciones intravenosa de larvas de pez cebra para el Estudio de la lesión renal aguda

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Investigación

Biología

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

La ablación con láser de la pronefros pez cebra para el Estudio de la regeneración epitelial renal

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Inmunofluorescencia y FISH Combinado de ADN en 3D conservados núcleos en interfase para estudiar los cambios en la organización nuclear 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Análisis de la apoptosis en embriones de pez cebra en Todo el montaje de inmunofluorescencia para detectar la caspasa 3 activada

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In vitro metilación de ensayo para estudiar la proteína arginina metilación

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Cuantitativa inmunofluorescencia Ensayo para medir la variación en los niveles de proteína en centrosomas

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Método para la Evaluación de los efectos de un rango de longitudes de onda e intensidades de / Terapia de luz del infrarrojo cercano Red sobre el estrés oxidativo<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The Drosophila&#160;melanogaster Malpighian (renal) tubule offers an unparalleled opportunity to study the molecular mechanisms of epithelial ion transport, due to the powerful genetics of this organism and the accessibility of its renal tubules to physiological study. Here, we describe the use of the Ramsay assay to measure fluid secretion rates from isolated fly renal tubules, with the use of ion-specific electrodes to measure sodium and potassium concentrations in the secreted fluid. This assay allows study of transepithelial fluid and ion fluxes of ~20 tubules at a time, without the need to transfer the secreted fluid to a separate apparatus to measure ion concentrations. Genetically distinct tubules can be analyzed to assess the role of specific genes in transport processes. Additionally, the bathing saline can be modified to examine the effects of its chemical characteristics, or drugs or hormones added. In summary, this technique allows the molecular characterization of basic mechanisms of epithelial ion transport in the Drosophila tubule, as well as regulation of these transport mechanisms.

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

This protocol describes the use of the Ramsay assay to measure fluid secretion rates from isolated Malpighian (renal) tubules from Drosophila melanogaster. In addition, the use of ion-specific electrodes to measure sodium and potassium concentrations in the secreted fluid, allowing calculation of transepithelial ion flux, is described.

El uso del ensayo de Ramsay medir la secreción de fluidos y de iones Flux tarifas en el<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Túbulo de Malpighi

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

Ensayo in vitro para medir Fosfatidiletanolamina metiltransferasa actividad

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...