SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.

1. 96 pocillos largo cebador de PCR <ol><li> Pre-congelación enfriador 96 pocillos PCR en -80 ° C congelador. </li><li> En un tubo de 10 ml, preparar Master Mix A: 2100 ddH l 2 O, 105 l PCR grado DMSO, 105 l dNTPs 10 mM, 105 l plantilla pPot (25 ng / l) 9, para un volumen total de 2415 l por placa . </li><li> Alícuota de 23 l en cada pocillo de una placa de 96 pocillos PCR. </li><li> Añadir 2 l de 100 mM agrupados cebadores para cada uno cargado también con una pipeta multicanal P20 de 12 canales. Sellar con la película, placa lugar en el enfriador de PCR previamente enfriado y dejar que se congele durante un mínimo de 20 min a -80 ° C. </li><li> En un tubo de 10 ml, preparar Master Mix B: 2,048 l ddH 2 O, 525 l de 10x tampón, 52,5 l de la polimerasa para un volumen total de 2626 l por placa. </li><li> Retire la placa y el refrigerador de PCR a partir del congelador a -80ºC. </li><li> Con la placa todavía en el enfriador de PCR, se añaden 25 l Master Mix B en la parte superior de la congelón Master Mix A para un volumen total de reacción de 50 l. Este es el tiempo crítico, y debe ser completado antes de la mezcla A puede descongelarse. Sellar la placa con película. </li><li> Conjunto termociclador de la siguiente manera: 94 ° C durante 10 min, luego 30 ciclos de 94 ° C durante 15 s, 65 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 2 min seguido de un periodo de extensión final de 72 ° C durante 7 min . </li><li> Cargar la placa de PCR que el bloque haya alcanzado 94 ° C. </li></ol> 2. Validación de 96 pocillos a largo cebador de PCR <ol><li> Reparto de un gran 1% (w / v) en gel de agarosa en Tris acetato EDTA (TAE) tampón de ejecución con peines de 4 x 28 pocillos para dar un gel con 4 filas de pocillos. Alinear los dientes suplentes del peine con la punta de una pipeta multicanal de 12 canales. Sumerja con cuidado el gel en TAE funcionamiento de amortiguación después de que los carriles están cargados. </li><li> Cargar escalera de ADN de 1 kb en la 1ª y 28ª pocillo de cada fila. </li><li> Con una pipeta multicanal P20 de 12 canales, transferir 2 l de producto de PCR dirrectamente a cada carril del gel (Figura 1A). Hacer esto de manera rápida para reducir la posibilidad de contaminación de los amplicones. <ol><li> Cargar los productos de PCR de la fila A de la placa de PCR en las pistas impares de la fila 1 del gel (A1 - carril 3, A2 - carril 5 ...... A11 - carril 23, A12 - carril 25) y cargar los productos de PCR de la fila B de la placa de PCR en los carriles pares del st fila del gel 1 (B1 - carril 4, A2 - carril 6 ...... B11 - carril 24, B12 - carril 26). </li><li> Cargar los productos de PCR de la fila C y D de la placa de PCR utilizando el mismo patrón que se ha descrito anteriormente, con la fila C en el carril numeradas y la fila D extraña en los carriles de número par. Continuar este patrón de carga hasta que cada pocillo de la placa de PCR se carga en el gel. tampón de carga de DNA no es necesaria para cargar este gel. </li></ol></li><li> Colocar el gel en el tanque de correr y llenar el tanque con TAE tampón de ejecución hasta que se sumergió el gel. Ejecutar a 100 V durante 30 min yvisualizar utilizando un transiluminador UV. Véase la Figura 1B para un gel de ejemplo. Nota: Los productos de PCR se pueden almacenar a -20 ° C durante varias semanas antes de la transfección </li></ol> 3. La transfección de 96 pocillos <ol><li> Utilice la T. brucei línea celular de forma procíclica SMOXP9 10 para este procedimiento y crecer en SDM-79 medio que contiene FCS al 10% 10. </li><li> Utilice 1 x 10 7 células por transfección (total de 1,1 x 10 9 células) cuando se marcan en el extremo N de la proteína y 2 x 10 7 células por transfección (un total de 2,2 x 10 9 células) cuando se marcan en el extremo C terminal de la proteína. Mantener las células en mid-log (1,2 x 10 6 -1 x 10 7 células / ml) durante varios días antes de la transfección y cosechar las células para la transfección a una densidad de 5-8 x 10 6 células / ml. </li><li> Permitir a los productos de la PCR para la transfección congelados se descongelen a temperatura ambiente. </li><li> Recuento de células usando un hemoocytometer o contador de células automático. </li><li> Pellet requerido número de células en múltiples tubos de 50 ml a 800 xg durante 10 min. </li><li> Después de sobrenadante de centrifugación de descarte y resuspender las células en 10 ml Cytomix modificado (EGTA mM 0,8 mM, KCl 24, 0,15 mM CaCl 2, 10 mM de tampón de fosfato de potasio pH 7,6, 25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 2,6 mM MgCl 2, 0.5% (w / v) de glucosa, 100 mg / ml BSA, hipoxantina 1 mM, sacarosa 144 mM) por tubo. Transferencia de todas las soluciones de células a un solo tubo y girar de nuevo a 800 xg durante 10 min. </li><li> Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender las células en 23 ml de Cytomix modificado para una concentración final de 5 x 10 7 células / ml. </li><li> Mientras que las células están girando, añadir 1 ml de SDM-79 medios de comunicación a cada pocillo de placas de cultivo de tejido de 4 x 24 pocillos. Etiquetar las placas de AD y dibujar un anillo alrededor pocillo A1 en cada plato con un marcador permanente para ayudar orientación de la placa. </li><li> Conectar el controlador de placa a la electroporador. En la electroporaunidad tor ajustar el voltaje a 1500 V, la longitud del pulso de 100 microsegundos y el número de impulsos a 12 y el intervalo de impulso de 500 ms. En el controlador de placa, establecer el cómputo de impulsos a 1. Esto asegura que que electroporador se aplicará un pulso único a cada una de las 12 columnas de la placa de la electroporación. </li><li> El uso de un P200 12 pipeta multicanal canal, la transferencia de las reacciones de PCR de la placa de PCR a las placas de 96 pocillos de electroporación desechables, brecha 4 mm. </li><li> Cuando las células se han hecho girar y se resuspendieron a la concentración final de 5 x 10 7 células / ml (paso 3.7), transferir a un depósito de reactivo. Pipetear 200 l de la solución de células en cada pocillo de la placa de electroporación usando un P200 12 canal pipeta multicanal, mezclar con el producto PCR mediante pipeteo. </li><li> El uso de tejido a eliminar cualquier gota de la parte superior de la placa para evitar cortocircuitos. </li><li> Aplicar la película de sellado proporcionada en el envase placa a la parte superior de la placa de la electroporación, positioning que a fin de dejar los orificios de los electrodos no cubierto en la parte superior e inferior de cada columna. Evitar cubrir los puntos planteados utilizados para guiar la película. </li><li> Cargar la placa de electroporación en el controlador de la placa y cierre la tapa. Pulse &#39;Pulso&#39; en la unidad electroporador. </li><li> Después de la electroporación, transferir rápidamente las células de la placa de la electroporación de 96 pocillos a las placas de cultivo de tejido de 4 x 24 pocillos. Para transferir las células, utilizar una pipeta P200 12 canal multicanal con cada otra punta falta de tal manera que los 6 restantes puntas se alinean con los 6 filas en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Transferencia de las células electroporadas en las placas electroporaciones de 96 pocillos en patrón predefinido a las placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos (Figura 2A). </li><li> Preparar las puntas de pipeta P200 - para cada transfección de 96 pocillos preparar 2 cajas de 96 puntas con cada otra columna eliminado. <ol><li> pozos de transferencia A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 de la placa de electroporación de 96 pocillos aLa placa A la fila A de las placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 en la fila B, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 en la fila C y D1 / D3 / D5 / D7 / D9 / D11 en la fila D. Después de la transferencia de cada grupo de 6 pocillos de la placa de 96 pocillos a la placa de 24 pocillos, los pocillos en la placa de 96 pocillos se lavan a continuación con los medios de los pocillos correspondientes en el 24- así placa y el lavado se transfirieron de nuevo a los pozos de la placa de 24 pocillos. </li><li> pozos de transferencia E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 en la placa de electroporación de 96 pocillos a 24 pocillos placa B fila A, F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 en la fila B, G1 / G3 / G5 / G7 / G9 / G11 en la fila C y H1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11 en la fila D. Después de la transferencia de cada conjunto de 6 pozos de la placa de 96 pocillos de la placa de 24 pocillos, los pozos en el 96 placa -bien se lavan entonces con medios de los pocillos correspondientes en la placa de 24 pocillos y el lavado se transfiere de nuevo a los pocillos en la placa de 24 pocillos. </li><li> pozos de transferencia A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A12 de la placa de electroporación de 96 pocillos a 24 pocillos placa C la fila A, B2 / B4 / B6 / B8 / B10 / B12 en la fila B, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 en la fila C y D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 en la fila D. Después de la transferencia de cada conjunto de 6 pozos desde el 96 -bien placa a la placa de 24 pocillos, los pozos de la placa de 96 pocillos se lavan a continuación con los medios de los pocillos correspondientes de la placa de 24 pocillos y el lavado se transfiere de nuevo a los pozos de la placa de 24 pocillos. </li><li> pozos de transferencia E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 en la placa de electroporación de 96 pocillos a 24 pocillos placa D fila A, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12 en la fila B, G2 / G4 / G6 / G8 / G10 / G12 en la fila C y H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 en la fila D. Después de la transferencia de cada conjunto de 6 pozos de la placa de 96 pocillos de la placa de 24 pocillos, los pozos en el 96 placa -bien se lavan entonces con medios de los pocillos correspondientes en la placa de 24 pocillos y el lavado se transfiere de nuevo a los pocillos en la placa de 24 pocillos. </li></ol></li><li> Utilizando un microscopio de contraste de fase invertida, así examinar 1 de cada columna para comprobar las células. Habrá una mezcla de células vivas y muertas con unacantidad sustancial de los restos celulares. Las células vivas se pueden distinguir de las células muertas, ya que será brillante bajo un microscopio de contraste de fase y se mueve. </li><li> Colocar las placas de 24 pocillos en una caja limpia, de plástico con una tapa que forma un sello hermético. Ponga la caja en un 28 ° C incubadora. </li><li> Entre 6-8 horas más tarde, añadir 1 ml de SDM-79 con 10% de FCS que contiene el antibiótico selectivo 2x a cada pocillo. En nuestra experiencia, las líneas celulares donde los genes etiquetados en el extremo N terminal son resistentes a concentraciones más altas de la droga selectiva. Por lo tanto, el uso de blasticidin como un ejemplo, el marcado en el extremo N terminal requiere una concentración final de 20 mg / ml de blasticidina y etiquetado en el extremo C terminal requiere una concentración final de 10 mg / ml de blasticidina. Nota: Las líneas celulares transgénicas serán visibles 9-10 días después de la transfección. </li><li> Passage al menos dos veces en fármaco fresco y medios de comunicación antes del análisis. La Figura 2B muestra los resultados de una típica transfe 96 pocilloscción para el marcado de 96 proteínas diferentes en el extremo N-terminal. Evaluar cada pocillo por microscopía de contraste de fase para determinar si contiene células sanas, resistentes a las drogas. Un bien sana contiene predominantemente (&lt;95%) las células altamente activos que son brillantes en microscopía de contraste de fase. se requiere un análisis posterior por microscopía de epifluorescencia o transferencia de western para determinar si la proteína ha sido etiquetado con éxito. </li></ol>

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	<li>Kelly, S., Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+in+Trypanosoma+brucei:+a+collection+of+vectors+for+the+expression+of+tagged+proteins+from+endogenous+and+ectopic+gene+loci.">Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci.</a> Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).</li><li>Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. 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The authors have nothing to disclose.

mejoras dramáticas en la sensibilidad de la proteómica y transcriptómica métodos en los últimos 5-10 años ha proporcionado valiosos datos sobre miles de genes y sus productos. Sin embargo, las herramientas para hacer frente a la función de estas proteínas no han avanzado al mismo ritmo. Etiquetar una proteína facilita numerosos experimentos para determinar su función. Por ejemplo, una proteína se puede fusionar a una proteína fluorescente en una variedad de diferentes colores para facilitar los estudios de localización y co-localización. Etiquetas desarrollados para microscopía electrónica, tales como APEX2 o miniSOG 11,12, permitir la localización ultraestructural de la proteína de la etiqueta. Etiquetas para la bioquímica, como la etiqueta TAP, y ProtC-TEV-ProtA (PTP) Marcar 7,13 permitir la purificación de complejos asociados con la proteína para la identificación de las parejas de unión o en ensayos bioquímicos in vitro. Los pasos específicos que son críticos para el éxito de la protocol son: la incorporación de DMSO en la PCR Master Mix 1, la congelación de la PCR Master Mix 1 antes de la adición de la mezcla maestra 2, el uso de la polimerasa comercial en Master Mix 2 y la modificación de la memoria intermedia de Cytomix electroporación. En nuestra experiencia, es necesario usar el doble del número de células para C transfecciones terminal de marcado como para N terminal de transfecciones de etiquetado con el fin de lograr una proporción similar de los pocillos positivos. Por lo tanto, todos los pasos deben realizarse como se ha descrito. Esta técnica sólo es probable que tenga éxito cuando la transfección de la forma de insecto tripanosoma procíclico. Formas sanguíneas tienen una menor eficiencia de transfección 14, por otra parte son propensos a morir durante la selección debido a la toxicidad dependiente de la densidad que no está relacionada con el fármaco selectivo. Por lo tanto, nuestro protocolo anterior representa la mejor tecnología actual para etiquetar de forma tripanosomas torrente sanguíneo 9. También es probable que el transeficiencia infección variará dependiendo del aislado tripanosoma específico. Este protocolo se ha optimizado el uso de 927 SMOX procíclico formas - otras cepas pueden requerir una optimización adicional. Medidas que pueden aumentar la probabilidad de éxito incluyen: el aumento de la cantidad de amplicón de PCR, el aumento del número de células incluidas en la transfección. Se presenta un método donde cientos de proteínas se pueden etiquetar de forma paralela. Esto facilitará estudios a gran escala sobre la localización y la interacción, como complemento de grandes conjuntos de datos existentes y proporcionar información de gran valor para la comunidad. plantillas de cebadores están disponibles bajo petición y una lista de plantillas de plásmidos está disponible a partir de: http://www.sdeanresearch.com/

Trypanosoma brucei es un parásito protozoario que causa trypanosomasis africana humana y nagana en el ganado. T. brucei es un organismo ideal para el análisis de la función de la proteína debido a la combinación de un genoma de alta calidad, numerosos proteómica y conjuntos de datos transcriptómica y herramientas moleculares bien desarrollados 1-3. Los avances en la proteómica y la secuenciación han dado lugar a grandes conjuntos de datos que ponen de relieve los genes potencialmente interesantes 4-6; sin embargo, muchos genes tienen un mínimo de información asociada con ellos en las bases de datos existentes. Por tanto, existe una necesidad de un método de alto rendimiento para ayudar a la caracterización funcional de proteínas. La expresión de una proteína marcada puede dar una multiplicidad de conocimientos sobre la función de una proteína. Por ejemplo, una proteína marcada con una proteína fluorescente o epítopo puede ser localizada mediante microscopía de fluorescencia, lo que da información acerca de dónde la protein podría estar ejerciendo su efecto biológico. Alternativamente, una proteína marcada con un TAP 7, 8 o HaloTag His se puede purificar para los ensayos bioquímicos y la identificación de sus compañeros de interacción. Recientemente hemos desarrollado una metodología robusta para el etiquetado T. brucei 9. Este utilizado durante mucho tiempo cebador de PCR para generar el ADN para la transfección y permitió que el marcaje de proteínas de docenas en paralelo - una mejora importante de los protocolos existentes. Ahora hemos mejorado la escalabilidad de este protocolo en formas procíclicas en un orden de magnitud. A continuación, presentamos nuestro método en el que llevamos a cabo la PCR y la transfección en placas de 96 pocillos, con la recuperación y la selección se produce en placas de 24 pocillos. Como cientos de proteínas ahora se pueden etiquetar de forma paralela este método proporciona un método rentable y viable para etiquetar todo el genoma tripanosoma.

<table><tbody><tr><td>Oligonucleotide</td><td>Life technologies</td><td>na</td><td>desalt only (do not use additional purification)</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roche</td><td>Included with the Expand HiFi pack</td><td>Must be PCR grade</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>any reputable</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expand HiFi polymerase</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>BTX ECM830</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td>Electroporator</td></tr><tr><td>HT-200 plate handler</td><td>Harvard Apparatus</td><td>HT-200</td><td>Handles the 96-well eletroplates</td></tr><tr><td>MOS 96 ELECTROPLATE 4 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0452</td><td>Electroplate for the 96-well electroporation</td></tr><tr><td>Blasticidin S Hydrochloride</td><td>Melford</td><td>3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin b Gold</td><td>Invivogen</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Phleomycin</td><td>Melford</td><td>P0187</td><td></td></tr><tr><td>225 cm TC Flask, canted neck, phenolic cap</td><td>Appletonwoods</td><td>BC006</td><td></td></tr><tr><td>24 well culture plates</td><td>Appletonwoods</td><td>BC017</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;reg; PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z606634-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96-well Multiply&amp;reg; PCR plate with lateral skirt</td><td>Sarstedt</td><td>72.1979.203</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput gene tagging in trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

En este transfección representativa, los cebadores se diseñaron utilizando la secuencia de comandos Perl TagIt 9 y sintetizados comercialmente. El 96 pocillos PCR se llevó a cabo y validó como se describe (Figura 1A); en este ejemplo, 95/96 PCR tuvieron éxito (Figura 1B). En nuestra experiencia, la repetición de las reacciones fallidas ya sea con los cebadores originales o re-sintetizado cebadores no da lugar a una PCR con éxito. Los amplicones se transfirieron a placas de 96 pocillos de electroporación para la electroporación (Figura 2A) y después se transfirieron a placas de cultivo de 24 pocillos para la recuperación y selección. Después de tiempo suficiente para permitir la selección que se produzca, los pocillos se marcaron para la supervivencia antes de un análisis adicional. En este ejemplo, pozos 88/96 (92%) fueron positivos después de la selección de los 15 días. <img alt = &quot;Figura 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54342 / 54342fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1: Validación de PCR del patrón largo de imprimación (A) para la transferencia de productos de PCR de 96 pocillos placa de PCR para el gel de agarosa para la validación de PCR.. (B) A 96 pocillos gel representante validación de PCR para el marcado de 95 genes en el terminal N, y 1 amplicón no contiene &#39;homología 5 de orientación para actuar como un control negativo en la transfección. Las muestras se cargan en un 1% (w / v) en gel de agarosa y se resolvieron a 100 V durante 30 minutos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54342/54342fig2.jpg" /> Figura 2: de 96 pocillos electroporación y selección (A) Modelo para la transferencia de las células sometidas a electroporación de 96 pocillos plat electroporación.e a placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos. (B) Un diagrama esquemático que muestra una puntuación típica en vivo / muerto después de 15 días de selección en placas de 24 pocillos. El verde representa una transfección exitosa, gris representa un pozo con sólo las células muertas. En este ejemplo, 88/96 (92%) de los pozos contenían parásitos transfectadas con éxito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

De Alto Rendimiento de genes de marcado en las<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

high-throughput-gene-tagging-in-trypanosoma-brucei

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

7.9K vistas.  University of Oxford. Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Video: High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate for telomerase for de novo telomere DNA synthesis and is therefore important for telomere maintenance. T. brucei is a protozoan parasite that causes sleeping sickness in humans and nagana in cattle. Once infected mammalian host, T. brucei cell regularly switches its surface antigen to evade the host's immune attack. We have recently demonstrated that the T. brucei telomere structure plays an essential role in regulation of surface antigen gene expression, which is critical for T. brucei pathogenesis. However, T. brucei telomere structure has not been extensively studied due to the limitation of methods for analysis of this specialized structure. We have now successfully adopted the native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension methods for examination of the telomere G-overhang structure and an adaptor ligation method for determination of the telomere terminal nucleotide in T. brucei cells. Here, we will describe the protocols in detail and compare their different advantages and limitations.

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Telomeres are essential for chromosome stability and the telomere G-overhang structure is essential for telomerase-mediated telomere maintenance. We have recently adopted two methods for detecting the telomere G-overhang structure in Trypanosoma brucei, which are native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension, which will be described.

El examen de los telómeros G-Estructura en voladizo Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Investigación

Inmunología e Infección

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target against T. cruzi, it is important to validate the essentiality of the target gene in the mammalian stage of the parasite, the amastigote. Amastigotes of T. cruzi replicate inside the host cell; thus, it is difficult to conduct a knockout experiment without going through other developmental stages. Recently, our group reported a growth condition in which the amastigote can replicate axenically for up to 10 days without losing its amastigote-like properties. By using this temporal axenic amastigote culture, we successfully introduced gRNAs directly into the Cas9-expressing amastigote to cause gene knockouts and analyzed their phenotypes exclusively in the amastigote stage. In this report, we describe a detailed protocol to produce in vitro derived extracellular amastigotes, and to utilize the axenic culture in a CRISPR/Cas9-mediated knockout experiment. The growth phenotype of knockout amastigotes can be evaluated either by cell counts of the axenic culture, or by replication of intracellular amastigote after host cell invasion. This method bypasses the parasite stage differentiation normally involved in producing a transgenic or a knockout amastigote. Utilization of the temporal axenic amastigote culture has the potential to expand the experimental freedom of stage-specific studies in T. cruzi.

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Here, we describe a protocol to introduce a gene knockout into the extracellular amastigote of Trypanosoma cruzi, using the CRISPR/Cas9 system. The growth phenotype can be followed up either by cell counting of axenic amastigote culture or by proliferation of intracellular amastigotes after host cell invasion.

Introducción de un Knockout Gene Directamente en la etapa de Amastigote de Trypanosoma cruzi usando el sistema CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Genética

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

La manipulación genética en<em&gt; Δku80</em&gt; Las cepas de Análisis Genómico Funcional de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

El uso de proteínas fluorescentes de Seguimiento glicosoma Dinámica en el tripanosoma africano

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many non-endemic countries due to the increase in migration. This disease affects nearly 8 million people, with new cases estimated at 50,000 per year. In the 1960s and 70s, two drugs for ChD treatment were introduced: nifurtimox and benznidazole (BZN). Both are effective in newborns and during the acute phase of the disease but not in the chronic phase, and their use is associated with important side effects. These facts underscore the urgent need to intensify the search for new drugs against T. cruzi.
T. cruzi is transmitted through hematophagous insect vectors of the Reduviidae and Hemiptera families. Once in the mammalian host, it multiplies intracellularly as the non-flagellated amastigote form and differentiates into the trypomastigote, the bloodstream non-replicative infective form. Inside the insect vector, trypomastigotes transform into the epimastigote stage and multiply through binary fission.
This paper describes an assay based on measuring the activity of the cytoplasmic &#946;-galactosidase released into the culture due to parasites lysis by using the substrate, chlorophenol red &#946;-D-galactopyranoside (CPRG). For this, the T. cruzi Dm28c strain was transfected with a &#946;-galactosidase-overexpressing plasmid and used for in vitro pharmacological screening in epimastigote, trypomastigote, and amastigote stages. This paper also describes how to measure the enzymatic activity in cultured epimastigotes, infected Vero cells with amastigotes, and trypomastigotes released from the cultured cells using the reference drug, benznidazole, as an example. This colorimetric assay is easily performed and can be scaled to a high-throughput format and applied to other T. cruzi strains.

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

We describe a high-throughput colorimetric assay measuring &#946;-galactosidase activity in three life cycle stages of Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. This assay can be used to identify trypanocidal compounds in an easy, fast, and reproducible manner.

In vitro Detección de drogas contra todas las etapas del ciclo de vida de Trypanosoma cruzi utilizando parásitos que expresan β-galactosidasa

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

Bioquímica

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.
Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.
Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Imágenes de bioluminiscencia para detectar la infección en fase tardía de la tripanosomiasis africana

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Detección de<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant glicoproteína de superficie de conmutación por Magnetic Activated Cell Sorting y Citometría de Flujo

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is the best method for diagnosis of first stage HAT and furthermore this parasite purification method permits serological and research investigations.
HAT is caused by Tsetse fly transmitted Trypanosoma brucei gambiense and T. b. rhodesiense. Related trypanosomes are the causative agents of animal trypanosomiasis. Trypanosome detection is essential for HAT diagnosis, treatment and follow-up. The technique described here is the most sensitive parasite detection technique, adapted to field conditions for the diagnosis of T. b. gambiense HAT and can be completed within one hour. Blood is layered onto an anion-exchanger column (DEAE cellulose) previously adjusted to pH 8, and elution buffer is added. Highly negatively charged blood cells are adsorbed onto the column whereas the less negatively charged trypanosomes pass through. Collected trypanosomes are pelleted by centrifugation and observed by microscopy. Moreover, parasites are prepared without cellular damage whilst maintaining their infectivity.
Purified trypanosomes are required for immunological testing; they are used in the trypanolysis assay, the gold standard in HAT serology. Stained parasites are utilized in the card agglutination test (CATT) for field serology. Antigens from purified trypanosomes, such as variant surface glycoprotein, exoantigens, are also used in various immunoassays. The procedure described here is designed for African trypanosomes; consequently, chromatography conditions have to be adapted to each trypanosome strain, and more generally, to the blood of each species of host mammal.
These fascinating pathogens are easily purified and available to use in biochemical, molecular and cell biology studies including co-culture with host cells to investigate host-parasite relationships at the level of membrane receptors, signaling, and gene expression; drug testing in vitro; investigation of gene deletion, mutation, or overexpression on metabolic processes, cytoskeletal biogenesis and parasite survival.

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns

This method of trypanosome separation from blood depends on their surface charge being less negative than mammalian blood cells. Infected blood is placed and treated on an anion-exchanger column. This method, the most fitting diagnostic for African trypanosomiasis, provides purified parasites for immunological, biological, biochemical, pharmaceutical and molecular biology investigations.

Purificación de tripanosomas extracelulares, incluyendo a africano, de la sangre por intercambiadores de aniones (celulosa Diethylaminoethyl columnas)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

Desarrollo de un sensor basado en pHluorin2 para el pH glusómico en Trypanosoma brucei

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. Little is known about the cellular responses generated when environmental glucose levels change. In both bloodstream and procyclic form (insect stage) parasites, glycosomes house most of glycolysis. These organelles are rapidly acidified in response to glucose deprivation, which likely results in the allosteric regulation of glycolytic enzymes such as hexokinase. In previous work, localizing the chemical probe used to make pH measurements was challenging, limiting its utility in other applications.
This paper describes the development and use of parasites that express glycosomally localized pHluorin2, a heritable protein pH biosensor. pHluorin2 is a ratiometric pHluorin variant that displays a pH (acid)-dependent decrease in excitation at 395 nm while simultaneously yielding an increase in excitation at 475 nm. Transgenic parasites were generated by cloning the pHluorin2 open reading frame into the trypanosome expression vector pLEW100v5, enabling inducible protein expression in either lifecycle stage. Immunofluorescence was used to confirm the glycosomal localization of the pHluorin2 biosensor, comparing the localization of the biosensor to the glycosomal resident protein aldolase. The sensor responsiveness was calibrated at differing pH levels by incubating cells in a series of buffers that ranged in pH from 4 to 8, an approach we have previously used to calibrate a fluorescein-based pH sensor. We then measured pHluorin2 fluorescence at 405 nm and 488 nm using flow cytometry to determine glycosomal pH. We validated the performance of the live transgenic pHluorin2-expressing parasites, monitoring pH over time in response to glucose deprivation, a known trigger of glycosomal acidification in PF parasites. This tool has a range of potential applications, including potentially being used in high-throughput drug screening. Beyond glycosomal pH, the sensor could be adapted to other organelles or used in other trypanosomatids to understand pH dynamics&#160;in the live cell setting.

Autor destacado: Avances en el monitoreo del pH glusómico en Trypanosoma brucei usando el biosensor pHluorin2

We describe a method to study how pH responds to environmental cues in the glycosomes of the bloodstream form of African trypanosomes. This approach involves a pH-sensitive heritable protein sensor in combination with flow cytometry to measure pH dynamics, both as a time-course assay and in a high-throughput screen format.

Medición de los cambios dinámicos del pH glusómico en el Trypanosoma brucei vivo

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

De Alto Rendimiento de genes de marcado en las

Resumen

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El examen de los telómeros G-Estructura en voladizo Trypanosoma brucei

Introducción de un Knockout Gene Directamente en la etapa de Amastigote de Trypanosoma cruzi usando el sistema CRISPR/Cas9

La manipulación genética en

El uso de proteínas fluorescentes de Seguimiento glicosoma Dinámica en el tripanosoma africano

In vitro Detección de drogas contra todas las etapas del ciclo de vida de Trypanosoma cruzi utilizando parásitos que expresan β-galactosidasa

Imágenes de bioluminiscencia para detectar la infección en fase tardía de la tripanosomiasis africana

Detección de

Purificación de tripanosomas extracelulares, incluyendo a africano, de la sangre por intercambiadores de aniones (celulosa Diethylaminoethyl columnas)

Medición de los cambios dinámicos del pH glusómico en el Trypanosoma brucei vivo

Medición de los cambios dinámicos del pH glusómico en el Trypanosoma brucei vivo