SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.

1. 96-kuyu Uzun Primer PCR <ol><li> -80 ° C derin dondurucuda Öncesi donma 96-PCR soğutucu. </li><li> 10 ml&#39;lik bir tüp içinde, ana karışım A hazırlanması: 2100 ul GKD 2 O, 105 | il PCR sınıf DMSO, plaka başına 2.415 | il lik toplam hacim 105 ul 10 mM dNTP, 105 ul pPOT şablonu (25 ng / | il), 9, . </li><li> Kısım 96 gözlü PCR plakanın her oyuğuna 23 ul. </li><li> Her bir P20 12 kanal çok kanallı pipet kullanarak iyi yüklenmiş primerler toplanmış 100 mcM 2 ul ekleyin. Önceden soğutulmuş PCR soğutucu filmin, plaka ile kapatılır ve 80 ° C&#39;de 20 dakika en az dondurmak için izin verir. </li><li> 10 ml&#39;lik bir tüp içinde, ana karışım B hazırlanması: 2.048 ul GKD 2 O, 525 ul 10x tampon, plaka başına 2.626 | il lik toplam hacim için 52.5 ul polimeraz. </li><li> -80 ° C dondurucu plaka ve PCR soğutucusunu çıkarın. </li><li> PCR soğutucusu hala plakalı, dondu üstünde 25 ul Master Mix B ekleyinn Ana Karışım 50 ul toplam reaksiyon hacmi için. Bu sefer kritik olduğunu ve Mix A çözülme önce tamamlanmalıdır. film ile plaka mühür. </li><li> aşağıdaki şekilde termal döngü ayarlayın: 10 dakika boyunca 94 ° C, daha sonra, 7 dakika boyunca 72 ° C&#39;lik bir son uzatma süresi ardından 2 dakika 15 saniye, 30 saniye için 65 ° C, 72 ° C, 94 ° C&#39;de 30 döngü . </li><li> Blok 94 ° C ulaştıktan sonra PCR plaka yükleyin. </li></ol> 96-kuyu Uzun Primer PCR 2. Doğrulama <ol><li> Büyük bir% 1 döküm Tris asetat EDTA (TAE) &#39;de agaroz jel (w / v), 4 x 28 oyuklu tarakla çalışan tampon kuyu 4 satır ile bir jel elde edildi. 12 kanal çok kanallı pipet uçları ile tarak alternatif dişleri aynı hizaya getirin. şeritleri yüklendikten sonra dikkatli bir şekilde çalışan tampon TAE jel daldırın. </li><li> 1. ve 28. sıra her satır yükleyin 1 kb DNA merdiveni. </li><li> Bir P20 12 kanal çok kanallı pipet kullanarak, PCR ürünü dir 2 ul transferiectly jel (Şekil 1A) her şeride. amplıkonları kirlenmesine neden olma olasılığını azaltmak için hızla yapın. <ol><li> (- Şerit 3, A2 - şerit 5 ...... A11 - şerit 23, A12 - şerit 25 A1) ve PCR ürünleri yüklemek jel 1 satır tek numaralı şerit içine PCR plaka satır A PCR ürünleri yüklemek jel 1. satır bile sayılı şeride PCR plaka satır B (B1 - kulvar 4 A2 - şerit 6 ...... B11 - şerit 24, B12 - şerit 26). </li><li> Çift sayılı şeride sayılı kulvarlar ve satır D tek olarak satır C, yukarıda tarif edildiği gibi, aynı kalıp kullanılarak PCR levhanın sıralı C ve D, PCR ürünleri yükleyin. PCR plaka her bir jel üzerine yüklenir kadar bu yükleme modeli devam edin. DNA, yükleme tamponu Bu jel yüklemek için gerekli değildir. </li></ol></li><li> koşu tankına jel yerleştirin ve jel batık kadar tampon çalışan TAE ile deposunu doldurun. 30 dakika boyunca 100 V&#39;ta tutuldu veUV transilluminator kullanarak görselleştirmek. Örnek jel Şekil 1B&#39;ye bakınız. Not: PCR ürünleri birkaç hafta Transfeksiyondan önce -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir </li></ol> 3. 96-çukurlu transfeksiyonu <ol><li> T. kullanın brucei procyclic formu hücre hattı bu prosedür için SMOXP9 10 ve FCS 10% 10 içeren SDM-79 medya büyür. </li><li> Transfeksiyon başına 1 x 10 7 hücre kullanın (1.1 x 10 9 hücrelerinin toplam) N proteinin terminalinden ve transfeksiyon başına 2 x 10 7 hücreleri üzerinde etiketleme (2.2 x 10 9 hücrelerinin toplamı) C terminali üzerindeki etiketleme protein. Transfeksiyondan önce birkaç gün orta log (1.2 x 10 6 -1 x 10 7 hücre / ml), hücrelerin korumak ve 5-8 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir yoğunlukta hücreler transfeksiyon için hasat edilir. </li><li> Transfeksiyon için, dondurulmuş PCR ürünleri, oda sıcaklığında çözülmesine izin verir. </li><li> Bir haem kullanarak hücrelerin sayısıocytometer veya otomatik hücre sayacı. </li><li> 10 dakika boyunca 800 x g&#39;de birden fazla 50 ml tüpler içinde, hücre topağından gerekli sayısı. </li><li> Santrifüj atmak yüzer sonra 10 ml hücrelerin tekrar süspansiyon modifiye cytomix (0,8 mM EGTA, 24 mM KCI, 0.15 mM CaCl2, 10 mM potasyum fosfat tamponu pH 7.6, 25 mM HEPES-KOH pH 7.6, 2.6 mM MgCl2, % 0.5 (a / h) glukoz, tüp başına 100 ug / ml BSA, 1 mM hipoksantin, 144 mM sükroz). tek bir tüp bütün hücre çözüm aktarın ve 10 dakika boyunca 800 x g hızında tekrar döndürür. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, süpernatant atılır ve 5 x 10 7 hücre / ml&#39;lik bir son konsantrasyon için modifiye cytomix 23 ml tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Hücreler eğirme iken, 4 x 24 oyuklu doku kültür plakalarının her bir oyuğuna SDM-79 ortam 1 ml. Plakalar AD Etiket ve plaka yönünü yardımcı olmak için kalıcı bir kalem her tabakta etrafında iyi A1 bir halka çizin. </li><li> Elektroporatör plaka işleyicisi bağlayın. electropora üzerindetor birimi 1500 V gerilim, 100 mikro-saniyeye darbe uzunluğu ve 12 darbe sayısını ve 500 msn darbe aralığını ayarlamak. plaka işleyicisi, bu o Electroporator elektroporasyon plakasının 12 sütun her tek bir darbe uygulamak olmasını sağlar 1&#39;e darbe sayımı ayarlayın. </li><li> P200 12 kanalı çok kanallı pipet kullanarak, 96 oyuklu tek elektroporasyon plakaları, 4 mm bir boşluk PCR plakadan PCR reaksiyonları aktarın. </li><li> Hücreler, döndürülmüştür edilmiş ve 5 x 10 7 hücre / ml (Aşama 3.7) nihai konsantrasyona kadar yeniden süspanse edilir zaman, reaktif hazneye aktarılır. Pipet P200 12 kanalı çok kanallı pipet kullanılarak elektroporasyon plakanın her oyuğuna hücre çözeltisinin 200 ul, pipetleme PCR ürünü ile karıştırın. </li><li> doku kullanarak kısa devreyi önlemek için levhanın üstüne herhangi damlaların çıkarılması. </li><li> elektroporasyon plaka, pos üstüne plaka ambalajında ​​sunulan sızdırmazlık sürünBunu itioning her sütunun üst ve alt kısmında ortaya elektrotlar için delikler bırakmak üzere. filmi rehberlik etmek için kullanılan yükseltilmiş noktaları kapsayan kaçının. </li><li> Plaka işleyicisi içine elektroporasyon plakasını yükleyin ve kapağını kapatın. Electroporator ünitesindeki Basın &#39;Darbe&#39;. </li><li> Elektroporasyondan sonra, hızlı bir şekilde 4 x 24 oyuklu doku kültür plakalarına 96 oyuklu elektroporasyon hücreleri plakadan aktarın. Hücreleri aktarmak için, her uç eksik olan bir P200 12 kanal çok kanallı pipet kullanın gibi kalan 6 ipuçları 24-iyi doku kültürü plakası üzerinde 6 satır ile hizaya söyledi. 24 oyuklu doku kültür plakaları (Şekil 2A) için önceden belirlenmiş bir modelde 96 oyuklu electroporations plakalarda Elektroporasyona tabi tutulan hücreler aktarın. </li><li> P200 pipet uçları hazırlayın - Her 96-kuyu transfeksiyon kaldırıldı her sütun ile 96 ipuçları 2 kutu hazırlamak için. <ol><li> 96-kuyu elektroporasyon plaka üzerinde Transferi kuyuları A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 içinSatır B içine 24-iyi doku kültürü plakaları bir satır A, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 plaka, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 satır C içine ve D1 / D3 / D5 / D7 24 plaka 96 oyuklu plaka 6 kuyu her bir grubu transfer edildikten sonra satır D içine / D9 / D11, 96 oyuklu bir plaka içerisinde Kaynaklar akabinde de 24 karşılık gelen kuyu ortamı ile yıkanır çukurlu plaka ve yıkama daha sonra 24 oyuklu plaka oyuklarına geri aktarılmaktadır. </li><li> Satır B içine E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 96-kuyu elektroporasyon plaka üzerinde 24 plaka B satır A, F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 transferi kuyuları, G1 / G3 / G5 / 96 satır C ve H1 / H3 / H5 / H7 / H9 24 plaka için 96-plaka 6 kuyu her set transfer edildikten sonra sıra D içine / H11, kuyu içine G7 / G9 / G11 eh plaka daha sonra 24 oyuklu plaka karşılık gelen kuyu ortamı ile yıkanır ve yıkama, sonra 24-çukurlu plaka içindeki yuvalara geri aktarılmaktadır. </li><li> 24 plaka Cı satır A, B2 / B4 / B6 / B 96 oyuklu elektroporasyon plaka Aktarım kuyu A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A128 / B10 / B12 sıra B içine, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 sıra C ve 96 6 kuyuların her set transfer edildikten sonra sıra D içine D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 içine 24 oyuklu plakaya eh levha, 96 oyuklu bir plaka içerisinde kuyular daha sonra 24 oyuklu plaka karşılık gelen kuyu ortamı ile yıkanır ve yıkama, sonra 24-çukurlu plaka içindeki yuvalara geri aktarılmaktadır. </li><li> Aktarım kuyuları E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 24-plaka D satır A 96-kuyu elektroporasyon plaka üzerinde, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / satır B içine F12, G2 / G4 / G6 / satır C içine G8 / G10 / G12 ve H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 satır D. içine 24 plaka için 96-plaka 6 kuyu her set transferinden sonra, 96 kuyu eh plaka daha sonra 24 oyuklu plaka karşılık gelen kuyu ortamı ile yıkanır ve yıkama, sonra 24-çukurlu plaka içindeki yuvalara geri aktarılmaktadır. </li></ol></li><li> ters bir faz kontrast mikroskop kullanarak hücreleri kontrol etmek için her sütundan iyi 1 inceleyin. Bir canlı ve ölü hücreleri bir karışımı olacaktırHücre kalıntılarının önemli miktarda. Onlar faz kontrast mikroskobu altında parlak olacak ve hareket edilecektir çünkü canlı hücreler ölü hücrelerden ayırt edilebilir. </li><li> sıkı bir mühür oluşturan bir kapak ile bir temiz plastik bir kutu içinde, 24 kuyucuklu plaklar yerleştirin. 28 ° C inkübatör kutuyu koydu. </li><li> HR 6-8 arasında, daha sonra her bir oyuğa 2x seçici antibiyotiği içeren% 10 FCS ile SDM-79 1 ml. Deneyimlerimize göre, genler, N terminalinden etiketlendikten hücre çizgileri seçici ilacın daha yüksek konsantrasyonlarına karşı dirençlidir. Bu nedenle, N-terminaline etiketleme, örnek olarak Blasticidin kullanılarak mi ve C terminali üzerindeki etiketleme / ml Blasticidin 10 ug bir son konsantrasyon gerektiren blastisidin / 20 ug bir son konsantrasyon gerektirmektedir. Not: Transgenik hücre hatları transfeksiyondan sonra görünür 9-10 gün olacak. </li><li> En az iki kez, taze ilaç ve medya analizden önce geçit. Şekil 2B, tipik bir 96 oyuklu transfe sonuçlarını gösterirN ucundan 96 farklı proteini etiketlenmesi için ction. sağlıklı, ilaca dirençli hücreler içerip içermediğini belirlemek için faz kontrast mikroskobu ile de her değerlendirin. Sağlıklı bir kuyu faz sözleşme mikroskopi parlak ağırlıklı (&lt;% 95) yüksek derecede aktif hücreleri içerir. Epifloresans mikroskobu veya western blot ile sonraki analiz proteini başarıyla etiketli olup olmadığını belirlemek için gereklidir. </li></ol>

<ol>
	<li>Kelly, S., Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+in+Trypanosoma+brucei:+a+collection+of+vectors+for+the+expression+of+tagged+proteins+from+endogenous+and+ectopic+gene+loci.">Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci.</a> Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).</li><li>Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei.">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 99 (1), 89-101 (1999).</li><li>Shi, H., Djikeng, A., Mark, T., Wirtz, L. E., Tschudi, C., Ullu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+interference+in+Trypanosoma+brucei+by+heritable+and+inducible+double-stranded+RNA.">Genetic interference in Trypanosoma brucei by heritable and inducible double-stranded RNA.</a> RNA. 6 (7), 1069-1076 (2000).</li><li>Alsford, S., Turner, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+phenotyping+using+parallel+sequencing+of+RNA+interference+targets+in+the+African+trypanosome.">High-throughput phenotyping using parallel sequencing of RNA interference targets in the African trypanosome.</a> Genome Res. 21 (6), 915-924 (2011).</li><li>Alsford, S., Eckert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+decoding+of+antitrypanosomal+drug+efficacy+and+resistance.">High-throughput decoding of antitrypanosomal drug efficacy and resistance.</a> Nature. 482 (7384), 232-236 (2012).</li><li>Mony, B. M., MacGregor, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+dissection+of+the+quorum+sensing+signalling+pathway+in+Trypanosoma+brucei.">Genome-wide dissection of the quorum sensing signalling pathway in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 505 (7485), 681-685 (2014).</li><li>Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., S&#233;raphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration+:+Abstract+Nature+Biotechnology.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration : Abstract Nature Biotechnology.</a> Nature Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Los, G. V., Encell, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaloTag:+A+Novel+Protein+Labeling+Technology+for+Cell+Imaging+and+Protein+Analysis.">HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).</li><li>Dean, S., Sunter, J. D., Wheeler, R. J., Hodkinson, I., Gluenz, E., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolkit+enabling+efficient,+scalable+and+reproducible+gene+tagging+in+trypanosomatids.">A toolkit enabling efficient, scalable and reproducible gene tagging in trypanosomatids.</a> Open biol. 5 (1), 140197 (2015).</li><li>Poon, S. K., Peacock, L., Gibson, W., Gull, K., Kelly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+and+optimized+single+marker+system+for+generating+Trypanosoma+brucei+cell+lines+expressing+T7+RNA+polymerase+and+the+tetracycline+repressor.">A modular and optimized single marker system for generating Trypanosoma brucei cell lines expressing T7 RNA polymerase and the tetracycline repressor.</a> Open biol. 2 (2), 110037 (2012).</li><li>Lam, S. S., Martell, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature meth. 12 (1), 51-54 (2014).</li><li>Shu, X., Lev-Ram, V., Deerinck, T. J., Qi, Y., Ramko, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells,+tissues,+and+organisms.">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLoS biology. , (2011).</li><li>Schimanski, B., Nguyen, T. N., G&#252;nzl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+tandem+affinity+purification+of+trypanosome+protein+complexes+based+on+a+novel+epitope+combination.">Highly efficient tandem affinity purification of trypanosome protein complexes based on a novel epitope combination.</a> Eukaryotic Cell. , (2005).</li><li>Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+stable+transformation+of+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei.">Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Son 5-10 yıl içinde proteomik ve transkriptomik yöntemlerinin duyarlılığı dramatik gelişmeler genler ve bunların ürünlerinin binlerce değerli veriler sağlamıştır. Ancak, araçlar bu proteinlerin fonksiyonu ayak uyduramadı adresi. Bir protein etiketlenmesi işlevini belirlemek için çok sayıda deney kolaylaştırır. Örneğin, bir protein lokalizasyonu ve ko-lokalizasyon çalışmaları kolaylaştırmak için farklı renklerin çeşitli bir floresan protein kaynaştırılabilir. Etiketler Böyle APEX2 veya miniSOG 11,12 olarak elektron mikroskobu, için geliştirilmiş, etiketli protein ultrastrüktürel lokalizasyonu izin verir. Böyle TAP etiketi ve ProtC-TEV-Prota (PTP) olarak biyokimya için Etiketler 7,13 bağlayıcı ortakların belirlenmesi için ya da in vitro biyokimyasal tayinlerde protein ile ilişkili komplekslerin saflaştırma izin etiketleyin. protoc başarısı için kritik olan belirli adımlarPCR Master Mix 1&#39;e DMSO eklenmesi Master Mix 2 Master Mix 2 ticari polimeraz kullanımı ve cytomix elektroporasyon tamponu modifikasyon ilavesinden önce PCR Master Mix 1 dondurma: ol vardır. Deneyimlerimize göre, pozitif olan kaynaklar benzer bir oranını elde etmek için N-terminal etiketleme Transfeksiyonlar için de C ucu etiketleme Transfeksiyonlar için hücreleri iki kat kullanmak gereklidir. tarif edildiği gibi nedenle, tüm adımları yapılmalıdır. Bu teknik böcek procyclic formu tripanosom transfecting zaman başarılı olmak için sadece muhtemeldir. Kan akımı formları ayrıca onlar yüzünden seçici ilaç ilgisi yoktur yoğunluk bağımlı toksisite seçimi sırasında ölme olasılığı, düşük transfeksiyon verimi 14 var. Bu nedenle, önceki protokol kan formu tripanozomlann 9 etiketleme için mevcut en iyi teknolojiyi temsil eder. Ayrıca, trans-olasıdırFection verimlilik belirli bir tripanosom izolatı bağlı olarak değişecektir. Diğer türler ek optimizasyon gerektirebilir - Bu protokol 927 SMOX procyclic formları kullanarak optimize edilmiştir. başarı olasılığını arttırabilir tedbirler şunlardır: PCR amplikonu miktarını artırarak transfeksiyon dahil edilen hücre sayısı artmaktadır. Biz proteinlerin yüzlerce paralel olarak etiketlenmiş edilebilecek bir yöntem mevcut. Bu mevcut büyük veri setlerini tamamlayıcı ve topluma çok değerli bilgiler veren, yerelleştirme ve etkileşimi büyük ölçekli çalışmaları kolaylaştıracaktır. Primer şablonları istek ve plazmidler şablonlar listesinde üzerine mevcuttur edinilebilir: http://www.sdeanresearch.com/

Trypanosoma brucei sığır insan Afrika trypanosomasis ve nagana neden olan bir protozoon bir parazittir. T. brucei nedeniyle yüksek kaliteli genomu, çok sayıda proteomik ve transkriptomiks veri setleri ve iyi gelişmiş moleküler araçlar 1-3 kombinasyonu protein fonksiyonunun analizi için ideal bir organizmadır. Proteomik ve sıralama gelişmeler potansiyel olarak ilginç genlerin 4-6 vurgulamak büyük veri kümelerinde sonuçlandı; Ancak, pek çok gen mevcut veritabanlarında kendileriyle ilişkili çok az bilgi var. Protein fonksiyonel karakterizasyonu yardım etmek için yüksek verimli bir yönteme ihtiyaç duyulmaktadır. etiketli bir proteinin ifade bir proteinin fonksiyonundan içine anlayışlar çokluğu verebilir. Örneğin, bir flüoresan protein veya epitopu ile etiketlenmiş bir proteini PROT hakkında bilgi verir floresan mikroskobu ile lokalize edilebilirEin biyolojik etkisini uygularken olabilir. Seçenek olarak ise, bir musluk 7 ile etiketlenmiş bir protein, HaloTag 8 veya His etiketi biyokimyasal tahlillerde ve etkileşimi ortaklarının tespiti için arıtılabilir. Biz son zamanlarda T. için sağlam bir etiketleme yöntemi geliştirmiştir brucei 9. Bu transfeksiyon için DNA oluşturmak için uzun astar PCR kullanılan ve paralel proteinlerin onlarca etiketleme izin - Mevcut protokollerine büyük bir gelişme. Biz şimdi bir büyüklük sırasına göre procyclic formlarda bu protokolün ölçeklenebilirlik düzeldi. Burada biz, 24 yuvalı plakalar içinde meydana gelen geri kazanım ve seçim ile 96 gözlü plakalara PCR ve transfeksiyon gerçekleştirmek eden bir yöntem sunulmaktadır. Proteinlerin yüzlerce artık paralel olarak etiketlenmiş üzere bu yöntem tüm tripanozom genomunu etiketleme için bir maliyet-etkin ve uygulanabilir bir yöntem sağlar.

<table><tbody><tr><td>Oligonucleotide</td><td>Life technologies</td><td>na</td><td>desalt only (do not use additional purification)</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roche</td><td>Included with the Expand HiFi pack</td><td>Must be PCR grade</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>any reputable</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expand HiFi polymerase</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>BTX ECM830</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td>Electroporator</td></tr><tr><td>HT-200 plate handler</td><td>Harvard Apparatus</td><td>HT-200</td><td>Handles the 96-well eletroplates</td></tr><tr><td>MOS 96 ELECTROPLATE 4 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0452</td><td>Electroplate for the 96-well electroporation</td></tr><tr><td>Blasticidin S Hydrochloride</td><td>Melford</td><td>3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin b Gold</td><td>Invivogen</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Phleomycin</td><td>Melford</td><td>P0187</td><td></td></tr><tr><td>225 cm TC Flask, canted neck, phenolic cap</td><td>Appletonwoods</td><td>BC006</td><td></td></tr><tr><td>24 well culture plates</td><td>Appletonwoods</td><td>BC017</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;reg; PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z606634-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96-well Multiply&amp;reg; PCR plate with lateral skirt</td><td>Sarstedt</td><td>72.1979.203</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput gene tagging in trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

Bu temsilci transfeksiyon, primerler TagIT Perl 9 kullanılarak tasarlanmış ve ticari sentezlendi. 96 gözlü PCR yapılmış ve tarif edildiği gibi (Şekil 1A) halinde doğrulandı; Bu örnekte, 95/96 PCR (Şekil 1B) başarılı olmuştur. Bizim tecrübelerimize göre, başarılı bir PCR yol açmaz orijinal astar veya yeniden sentezlenmiş primerler ile ya başarısız tepkileri tekrarı. Amplikonlar elektroporasyon (Şekil 2A) için 96-çukurlu elektroporasyon plakalara aktarılmış ve daha sonra geri kazanımı ve seçim için 24 oyuklu bir kültür plakalarına aktarılmıştır. Seçim oluşmasına izin vermek için yeterli bir süre sonra, kaynaklar daha fazla analiz öncesinde hayatta kalmak için değerlendirildi. Bu örnekte, 88/96 kuyular (% 92) 15 gün sonra seçim pozitif. <img alt = &quot;Şekil 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54342 / 54342fig1.jpg&quot; /&gt; Şekil 1:. PCR doğrulama için agaroz jel 96-PCR plaka PCR ürünleri aktarmak için uzun astar PCR (A) Pattern Doğrulama. (B), N terminalinden 95 genleri etiketleme için temsili bir 96 gözlü PCR doğrulama jeli ve transfeksiyon bir negatif kontrol olarak hareket etme 5 hedefleme homoloji ihtiva eden 1 amplikon. Numuneler% 1 üzerine yüklenmiş (w / v) agaroz jel ve 30 dakika boyunca 100 V çözümlenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54342/54342fig2.jpg" /> Şekil 2: 96 oyuklu elektroporasyon ve seçme 96 oyuklu elektroporasyon topraklarda gelen Elektroporasyona tabi tutulan hücreler aktarılması için (A) Modeli.24 oyuklu doku kültür plakalarına örn. (B) şematik bir 24-yuvalı plakalar içinde bir seçim 15 gün sonra, tipik bir ölü / canlı puanlama gösteriliyor. Yeşil gri sadece ölü hücreleri ile iyi bir temsil, başarılı bir transfeksiyon temsil eder. Bu örnekte, kuyuların 88/96 (% 92) başarılı bir şekilde transfekte parazitler içeriyordu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei at JoVE.com

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Yüksek verimli Gen Etiketleme içinde<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

high-throughput-gene-tagging-in-trypanosoma-brucei

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

7.9K Görüntüleme.  University of Oxford. Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Video: High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate for telomerase for de novo telomere DNA synthesis and is therefore important for telomere maintenance. T. brucei is a protozoan parasite that causes sleeping sickness in humans and nagana in cattle. Once infected mammalian host, T. brucei cell regularly switches its surface antigen to evade the host's immune attack. We have recently demonstrated that the T. brucei telomere structure plays an essential role in regulation of surface antigen gene expression, which is critical for T. brucei pathogenesis. However, T. brucei telomere structure has not been extensively studied due to the limitation of methods for analysis of this specialized structure. We have now successfully adopted the native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension methods for examination of the telomere G-overhang structure and an adaptor ligation method for determination of the telomere terminal nucleotide in T. brucei cells. Here, we will describe the protocols in detail and compare their different advantages and limitations.

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Telomeres are essential for chromosome stability and the telomere G-overhang structure is essential for telomerase-mediated telomere maintenance. We have recently adopted two methods for detecting the telomere G-overhang structure in Trypanosoma brucei, which are native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension, which will be described.

Telomer G-çıkıntı Yapısı incelenmesi Trypanosoma brucei</em

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target against T. cruzi, it is important to validate the essentiality of the target gene in the mammalian stage of the parasite, the amastigote. Amastigotes of T. cruzi replicate inside the host cell; thus, it is difficult to conduct a knockout experiment without going through other developmental stages. Recently, our group reported a growth condition in which the amastigote can replicate axenically for up to 10 days without losing its amastigote-like properties. By using this temporal axenic amastigote culture, we successfully introduced gRNAs directly into the Cas9-expressing amastigote to cause gene knockouts and analyzed their phenotypes exclusively in the amastigote stage. In this report, we describe a detailed protocol to produce in vitro derived extracellular amastigotes, and to utilize the axenic culture in a CRISPR/Cas9-mediated knockout experiment. The growth phenotype of knockout amastigotes can be evaluated either by cell counts of the axenic culture, or by replication of intracellular amastigote after host cell invasion. This method bypasses the parasite stage differentiation normally involved in producing a transgenic or a knockout amastigote. Utilization of the temporal axenic amastigote culture has the potential to expand the experimental freedom of stage-specific studies in T. cruzi.

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Here, we describe a protocol to introduce a gene knockout into the extracellular amastigote of Trypanosoma cruzi, using the CRISPR/Cas9 system. The growth phenotype can be followed up either by cell counting of axenic amastigote culture or by proliferation of intracellular amastigotes after host cell invasion.

CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak Trypanosoma cruzi 'Nin Amastigote aşamasına doğrudan bir gene Knockout tanıtımı

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Genetik

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

Genetik Manipülasyon<em&gt; Δku80</emFonksiyonel Genomik Analiz&gt; Suşlarının<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Floresan Proteinleri kullanarak Afrika tripanosom içinde Glycosome Dynamics Monitör

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many non-endemic countries due to the increase in migration. This disease affects nearly 8 million people, with new cases estimated at 50,000 per year. In the 1960s and 70s, two drugs for ChD treatment were introduced: nifurtimox and benznidazole (BZN). Both are effective in newborns and during the acute phase of the disease but not in the chronic phase, and their use is associated with important side effects. These facts underscore the urgent need to intensify the search for new drugs against T. cruzi.
T. cruzi is transmitted through hematophagous insect vectors of the Reduviidae and Hemiptera families. Once in the mammalian host, it multiplies intracellularly as the non-flagellated amastigote form and differentiates into the trypomastigote, the bloodstream non-replicative infective form. Inside the insect vector, trypomastigotes transform into the epimastigote stage and multiply through binary fission.
This paper describes an assay based on measuring the activity of the cytoplasmic &#946;-galactosidase released into the culture due to parasites lysis by using the substrate, chlorophenol red &#946;-D-galactopyranoside (CPRG). For this, the T. cruzi Dm28c strain was transfected with a &#946;-galactosidase-overexpressing plasmid and used for in vitro pharmacological screening in epimastigote, trypomastigote, and amastigote stages. This paper also describes how to measure the enzymatic activity in cultured epimastigotes, infected Vero cells with amastigotes, and trypomastigotes released from the cultured cells using the reference drug, benznidazole, as an example. This colorimetric assay is easily performed and can be scaled to a high-throughput format and applied to other T. cruzi strains.

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

We describe a high-throughput colorimetric assay measuring &#946;-galactosidase activity in three life cycle stages of Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. This assay can be used to identify trypanocidal compounds in an easy, fast, and reproducible manner.

İn Vitro β-galaktosidaz İfade Eden Parazitleri Kullanarak Trypanosoma cruzi'nin Tüm Yaşam Döngüsü Aşamalarına Karşı İlaç Taraması

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

Biyokimya

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.
Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.
Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Biyoparlaklık Görüntüleme Afrika Trypanosomiasis Geç Evre Enfeksiyon Algılama için

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Algılama<em&gt; Trypanosoma brucei</emManyetik Aktif Hücre Sorting ve Akış Sitometrisi ile&gt; Varyant Yüzey Glikoprotein Değiştirme

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is the best method for diagnosis of first stage HAT and furthermore this parasite purification method permits serological and research investigations.
HAT is caused by Tsetse fly transmitted Trypanosoma brucei gambiense and T. b. rhodesiense. Related trypanosomes are the causative agents of animal trypanosomiasis. Trypanosome detection is essential for HAT diagnosis, treatment and follow-up. The technique described here is the most sensitive parasite detection technique, adapted to field conditions for the diagnosis of T. b. gambiense HAT and can be completed within one hour. Blood is layered onto an anion-exchanger column (DEAE cellulose) previously adjusted to pH 8, and elution buffer is added. Highly negatively charged blood cells are adsorbed onto the column whereas the less negatively charged trypanosomes pass through. Collected trypanosomes are pelleted by centrifugation and observed by microscopy. Moreover, parasites are prepared without cellular damage whilst maintaining their infectivity.
Purified trypanosomes are required for immunological testing; they are used in the trypanolysis assay, the gold standard in HAT serology. Stained parasites are utilized in the card agglutination test (CATT) for field serology. Antigens from purified trypanosomes, such as variant surface glycoprotein, exoantigens, are also used in various immunoassays. The procedure described here is designed for African trypanosomes; consequently, chromatography conditions have to be adapted to each trypanosome strain, and more generally, to the blood of each species of host mammal.
These fascinating pathogens are easily purified and available to use in biochemical, molecular and cell biology studies including co-culture with host cells to investigate host-parasite relationships at the level of membrane receptors, signaling, and gene expression; drug testing in vitro; investigation of gene deletion, mutation, or overexpression on metabolic processes, cytoskeletal biogenesis and parasite survival.

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns

This method of trypanosome separation from blood depends on their surface charge being less negative than mammalian blood cells. Infected blood is placed and treated on an anion-exchanger column. This method, the most fitting diagnostic for African trypanosomiasis, provides purified parasites for immunological, biological, biochemical, pharmaceutical and molecular biology investigations.

Afrika, anyon-değiştiriciler (Diethylaminoethyl-selüloz sütunlar) tarafından kandan da dahil olmak üzere hücre dışı Tripanozomlar arıtma

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

Trypanosoma brucei'de Glikozomal pH için pHluorin2 Tabanlı Sensörün Geliştirilmesi

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. Little is known about the cellular responses generated when environmental glucose levels change. In both bloodstream and procyclic form (insect stage) parasites, glycosomes house most of glycolysis. These organelles are rapidly acidified in response to glucose deprivation, which likely results in the allosteric regulation of glycolytic enzymes such as hexokinase. In previous work, localizing the chemical probe used to make pH measurements was challenging, limiting its utility in other applications.
This paper describes the development and use of parasites that express glycosomally localized pHluorin2, a heritable protein pH biosensor. pHluorin2 is a ratiometric pHluorin variant that displays a pH (acid)-dependent decrease in excitation at 395 nm while simultaneously yielding an increase in excitation at 475 nm. Transgenic parasites were generated by cloning the pHluorin2 open reading frame into the trypanosome expression vector pLEW100v5, enabling inducible protein expression in either lifecycle stage. Immunofluorescence was used to confirm the glycosomal localization of the pHluorin2 biosensor, comparing the localization of the biosensor to the glycosomal resident protein aldolase. The sensor responsiveness was calibrated at differing pH levels by incubating cells in a series of buffers that ranged in pH from 4 to 8, an approach we have previously used to calibrate a fluorescein-based pH sensor. We then measured pHluorin2 fluorescence at 405 nm and 488 nm using flow cytometry to determine glycosomal pH. We validated the performance of the live transgenic pHluorin2-expressing parasites, monitoring pH over time in response to glucose deprivation, a known trigger of glycosomal acidification in PF parasites. This tool has a range of potential applications, including potentially being used in high-throughput drug screening. Beyond glycosomal pH, the sensor could be adapted to other organelles or used in other trypanosomatids to understand pH dynamics&#160;in the live cell setting.

Yazar Spotlight: pHluorin2 Biyosensörü Kullanılarak Trypanosoma brucei'de Glikozomal pH İzlemedeki Gelişmeler

We describe a method to study how pH responds to environmental cues in the glycosomes of the bloodstream form of African trypanosomes. This approach involves a pH-sensitive heritable protein sensor in combination with flow cytometry to measure pH dynamics, both as a time-course assay and in a high-throughput screen format.

Canlı Trypanosoma brucei'de Dinamik Glikozomal pH Değişikliklerinin Ölçülmesi

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

Yüksek verimli Gen Etiketleme içinde

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Telomer G-çıkıntı Yapısı incelenmesi Trypanosoma brucei

CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak Trypanosoma cruzi 'Nin Amastigote aşamasına doğrudan bir gene Knockout tanıtımı

Genetik Manipülasyon

Floresan Proteinleri kullanarak Afrika tripanosom içinde Glycosome Dynamics Monitör

İn Vitro β-galaktosidaz İfade Eden Parazitleri Kullanarak Trypanosoma cruzi'nin Tüm Yaşam Döngüsü Aşamalarına Karşı İlaç Taraması

Biyoparlaklık Görüntüleme Afrika Trypanosomiasis Geç Evre Enfeksiyon Algılama için

Algılama

Afrika, anyon-değiştiriciler (Diethylaminoethyl-selüloz sütunlar) tarafından kandan da dahil olmak üzere hücre dışı Tripanozomlar arıtma

Canlı Trypanosoma brucei'de Dinamik Glikozomal pH Değişikliklerinin Ölçülmesi

Canlı Trypanosoma brucei'de Dinamik Glikozomal pH Değişikliklerinin Ölçülmesi