SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.

1. 96 puits à long PCR Primer <ol><li> Pré-gel refroidisseur 96 puits PCR à -80 ° C congélateur. </li><li> Dans un tube de 10 ml, préparer Master Mix A: 2,100 ul ddH 2 O, 105 ul PCR de qualité DMSO, 105 pi 10 mM dNTP, 105 pl pPot gabarit (25 ng / pl) 9, pour un volume total de 2415 pi par plaque . </li><li> Aliquoter 23 ul dans chaque puits d&#39;une plaque à 96 puits PCR. </li><li> Ajouter 2 pi de 100 uM communs amorces à chaque puits chargé à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux P20 12 canaux. Sceller avec le film, le lieu plaque sur le refroidisseur PCR pré-refroidi et laisser geler pendant un minimum de 20 min à -80 ° C. </li><li> Dans un tube de 10 ml, préparer Master Mix B: 2,048 ul ddH 2 O, 525 ul 10x tampon, 52,5 ul polymérase pour un volume total de 2626 pi par plaque. </li><li> Retirer la plaque et le refroidisseur PCR à partir de -80 ° C congélateur. </li><li> Avec la plaque encore sur le refroidisseur PCR, ajouter 25 pl Master Mix B sur le dessus du figean Master Mix A pour un volume réactionnel total de 50 ul. Ce temps est critique et devrait être achevée avant Mix A peut dégeler. Sceller la plaque avec un film. </li><li> Définir cycleur thermique comme suit: 94 ° C pendant 10 min, puis 30 cycles de 94 ° C pendant 15 s, 65 ° C pendant 30 secondes, 72 ° C pendant 2 minutes suivie d&#39;une période d&#39;extension finale de 72 ° C pendant 7 min . </li><li> Chargez la plaque PCR après le bloc a atteint 94 ° C. </li></ol> 2. Validation de 96 puits à long PCR Primer <ol><li> Lancer un grand 1% (p / v) d&#39;un gel d&#39;agarose dans du Tris acétate EDTA (TAE) tampon en cours avec des peignes 4 x 28 puits pour donner un gel avec 4 rangées de puits. Alignez alternés dents du peigne avec les pointes d&#39;une pipette multicanaux 12 canaux. plonger délicatement le gel dans TAE tampon courir après les voies sont chargés. </li><li> Charge 1 kb échelle d&#39; ADN dans le 1 er et le 28 ème puits de chaque rangée. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux P20 12 canaux, transférer 2 pl de produit PCR directement à chaque piste du gel (figure 1A). Pour ce faire rapidement pour réduire la possibilité de contamination des amplicons. <ol><li> Chargez les produits de PCR à partir de la ligne A de la plaque PCR dans les voies impaires de la 1ère rangée du gel (A1 - piste 3, A2 - piste 5 ...... A11 - piste 23, A12 - piste 25) et charger les produits de PCR à partir de la ligne B de la plaque PCR dans les voies paires de la 1 ère ligne du gel (B1 - piste 4, A2 - piste 6 ...... B11 - voie 24, B12 - piste 26). </li><li> Chargez les produits de PCR à partir de la ligne C et D de la plaque PCR en utilisant le même schéma que décrit ci-dessus, avec la ligne C dans l&#39;étrange voies numérotées et rangée D dans les voies paires. Continuer ce modèle de chargement jusqu&#39;à ce que chaque puits de la plaque PCR est chargé sur le gel. tampon ADN de chargement ne soit pas nécessaire de charger ce gel. </li></ol></li><li> Placer le gel dans le réservoir en cours d&#39;exécution et de remplir le réservoir avec TAE tampon en cours d&#39;exécution jusqu&#39;à ce que le gel est immergé. Exécutez à 100 V pendant 30 min etvisualiser en utilisant un transilluminateur UV. Voir la figure 1B pour un gel d&#39;exemple. Remarque: Les produits de PCR peuvent être conservés à -20 ° C pendant plusieurs semaines avant la transfection </li></ol> 3. Transfection 96 puits <ol><li> Utilisez le T. brucei procyclique ligne sous forme de cellules SMOXP9 10 pour cette procédure et de grandir dans SDM-79 contenant 10% de FCS 10. </li><li> En utilisant 1 x 10 7 cellules par transfection (total de 1,1 x 10 9 cellules) lorsque le marquage sur l&#39;extrémité N de la protéine et 2 x 10 7 cellules par transfection (total de 2,2 x 10 9 cellules) lorsque le marquage sur l&#39; extrémité C - terminale de la protéine. Maintenir les cellules à la mi-log (1,2 x 10 6 -1 x 10 7 cellules / ml) pendant plusieurs jours avant la transfection et récolter les cellules pour la transfection à une densité de 5-8 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Laisser les produits congelés de PCR pour la transfection décongeler à la température ambiante. </li><li> Compter les cellules en utilisant un hèmeocytometer ou compteur de cellules automatique. </li><li> Pellet nombre requis de cellules dans plusieurs tubes de 50 ml à 800 x g pendant 10 min. </li><li> Après centrifugation Rejeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 10 ml CYTOMIX modifiée (0,8 mM d&#39; EGTA, 24 mM de KCl, 0,15 mM de CaCl2, 10 mM de phosphate de potassium pH 7,6 tampon, 25 mM de HEPES-KOH à pH 7,6, 2,6 mM de MgCl2, 0,5% (p / v) de glucose, 100 pg / ml de BSA, 1 mM d&#39;hypoxanthine, 144 mM de saccharose) par tube. Transférer toutes les solutions de cellules à un seul tube et tourner de nouveau à 800 xg pendant 10 min. </li><li> Après centrifugation, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 23 ml de CYTOMIX modifié pour obtenir une concentration finale de 5 x 10 7 cellules / ml. </li><li> Alors que les cellules tournent, ajouter 1 ml de SDM-79 médias pour chaque puits de 4 x 24 puits des plaques de culture de tissus. Etiqueter les plaques AD et dessiner un anneau autour de puits A1 sur chaque plaque de marqueur permanent pour aider à l&#39;orientation de la plaque. </li><li> Connectez le gestionnaire de la plaque à l&#39;électroporation. Sur la electroporaUnité tor régler la tension de 1500 V, la longueur d&#39;impulsion de 100 microsecondes, et le nombre d&#39;impulsions à 12 et l&#39;intervalle d&#39;impulsion de 500 ms. Sur le manipulateur de plaques, régler le nombre d&#39;impulsions à 1. Ceci assure que cette électroporation appliquera une impulsion unique à chacune des 12 colonnes de la plaque d&#39;électroporation. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un P200 12 canaux pipette multicanaux, transférer les réactions de PCR de la plaque PCR sur les plaques d&#39;électroporation 96 puits jetables, écart de 4 mm. </li><li> Lorsque les cellules ont été filé et sont remises en suspension à la concentration finale de 5 x 10 7 cellules / ml (étape 3.7), le transfert vers un réservoir de réactif. Pipette 200 pi de la solution de cellules dans chaque puits de la plaque d&#39;électroporation en utilisant un canal pipette multicanaux P200 12, mélanger avec le produit PCR par pipetage. </li><li> En utilisant un tissu enlever les gouttelettes de la partie supérieure de la plaque pour éviter les courts-circuits. </li><li> Appliquer le film d&#39;étanchéité prévue dans l&#39;emballage de plaque à la partie supérieure de la plaque d&#39;électroporation, posil itioning de façon à laisser des trous pour les électrodes à découvert en haut et en bas de chaque colonne. Évitez de couvrir les points soulevés utilisés pour guider le film. </li><li> Chargez la plaque d&#39;électroporation dans le manipulateur de plaques et fermer le couvercle. Appuyez sur &#39;Pulse&#39; sur l&#39;unité de electroporator. </li><li> Après l&#39;électroporation, le transfert rapide des cellules du 96 puits électroporation plaque à 4 x 24 puits des plaques de culture tissulaire. Pour transférer les cellules, utilisez un P200 12 canaux pipette multicanaux avec chaque autre bout manquant de telle sorte que les 6 conseils restants alignés avec les 6 rangs sur une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Transférer les cellules électroporées dans les 96 puits de plaques à électroporations motif prédéfini pour les 24 puits des plaques de culture tissulaire (figure 2A). </li><li> Préparer les embouts de pipette P200 - pour chaque transfection de 96 puits préparer 2 boîtes de 96 pointes avec chaque autre colonne supprimée. <ol><li> Transfert puits A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 sur la plaque d&#39;électroporation 96 puits àplaque A la ligne A des plaques de culture de tissus à 24 puits, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 dans la rangée B, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 dans la ligne C et D1 / D3 / D5 / D7 / D9 / D11 en ligne D. Après le transfert de chaque ensemble de 6 puits de la plaque de 96 puits à la plaque de 24 puits, les puits de la plaque de 96 puits sont ensuite lavés avec les médias des puits correspondants dans le 24- bien plaque et le lavage est ensuite transféré vers les puits dans la plaque de 24 puits. </li><li> puits de transfert E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 sur la plaque d&#39;électroporation 96 puits à 24 puits plaque B rangée A, F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 dans la rangée B, G1 / G3 / G5 / G7 / G9 / G11 dans la ligne C et H1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11 en ligne D. Après le transfert de chaque ensemble de 6 puits de la plaque de 96 puits à la plaque de 24 puits, les puits dans le 96 plaque -Bien sont ensuite lavées avec les médias des puits correspondants de la plaque de 24 puits et le lavage est ensuite transféré dans les puits dans la plaque de 24 puits. </li><li> Transfert puits A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A12 sur la plaque d&#39;électroporation 96 puits à 24 puits plaque C rangée A, B2 / B4 / B6 / B8 / B10 / B12 dans la rangée B, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 dans la ligne C et D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 en ligne D. Après le transfert de chaque ensemble de 6 puits de la 96 plaque eh bien à la plaque de 24 puits, les puits de la plaque de 96 puits sont ensuite lavées avec les médias des puits correspondants de la plaque de 24 puits et le lavage est ensuite transféré dans les puits dans la plaque de 24 puits. </li><li> puits de transfert E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 sur la plaque d&#39;électroporation 96 puits à 24 puits plaque D rangée A, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12 dans la rangée B, G2 / G4 / G6 / G8 / G10 / G12 dans la ligne C et H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 en ligne D. Après le transfert de chaque ensemble de 6 puits de la plaque de 96 puits à la plaque de 24 puits, les puits dans le 96 plaque -Bien sont ensuite lavées avec les médias des puits correspondants de la plaque de 24 puits et le lavage est ensuite transféré dans les puits dans la plaque de 24 puits. </li></ol></li><li> En utilisant un microscope à contraste de phase inversée, examiner 1 puits de chaque colonne pour vérifier les cellules. Il y aura un mélange de cellules vivantes et mortes avecquantité importante de débris cellulaires. Les cellules vivantes peuvent être distinguées des cellules mortes parce qu&#39;ils seront brillants au microscope à contraste de phase et seront en mouvement. </li><li> Placez les plaques à 24 puits dans une boîte en plastique propre avec un couvercle qui forme un joint étanche. Mettez la boîte dans un incubateur à 28 °. </li><li> Entre 6-8 heures plus tard, ajouter 1 ml de SDM-79 avec 10% de FCS contenant un antibiotique sélectif 2x à chaque puits. Dans notre expérience, les lignées cellulaires où les gènes sont marqués sur l&#39;extrémité N sont résistantes à des concentrations plus élevées de médicaments sélectifs. Par conséquent, en utilisant la blasticidine, par exemple, le marquage à l&#39;extrémité N-terminale nécessite une concentration finale de 20 pg / ml de blasticidine et le marquage sur l&#39;extrémité C-terminale nécessite une concentration finale de 10 pg / ml de blasticidine. Note: les lignées cellulaires transgéniques deviendront visibles 9-10 jours après la transfection. </li><li> Passage au moins deux fois dans la drogue nouvelle et les médias avant l&#39;analyse. La figure 2B montre les résultats d&#39;un transfe 96 puits typiquection pour le marquage 96 protéines différentes sur la terminaison N. Évaluer chaque puits par microscopie à contraste de phase afin de déterminer si elle contient des cellules saines, résistantes aux médicaments. Un puits sain contient principalement (&lt;95%) des cellules très actives qui sont lumineuses en microscopie contrat de phase. Une analyse subséquente par microscopie épifluorescence ou western blot est nécessaire pour déterminer si la protéine a été identifiée avec succès. </li></ol>

<ol>
	<li>Kelly, S., Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+in+Trypanosoma+brucei:+a+collection+of+vectors+for+the+expression+of+tagged+proteins+from+endogenous+and+ectopic+gene+loci.">Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci.</a> Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).</li><li>Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei.">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 99 (1), 89-101 (1999).</li><li>Shi, H., Djikeng, A., Mark, T., Wirtz, L. E., Tschudi, C., Ullu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+interference+in+Trypanosoma+brucei+by+heritable+and+inducible+double-stranded+RNA.">Genetic interference in Trypanosoma brucei by heritable and inducible double-stranded RNA.</a> RNA. 6 (7), 1069-1076 (2000).</li><li>Alsford, S., Turner, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+phenotyping+using+parallel+sequencing+of+RNA+interference+targets+in+the+African+trypanosome.">High-throughput phenotyping using parallel sequencing of RNA interference targets in the African trypanosome.</a> Genome Res. 21 (6), 915-924 (2011).</li><li>Alsford, S., Eckert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+decoding+of+antitrypanosomal+drug+efficacy+and+resistance.">High-throughput decoding of antitrypanosomal drug efficacy and resistance.</a> Nature. 482 (7384), 232-236 (2012).</li><li>Mony, B. M., MacGregor, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+dissection+of+the+quorum+sensing+signalling+pathway+in+Trypanosoma+brucei.">Genome-wide dissection of the quorum sensing signalling pathway in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 505 (7485), 681-685 (2014).</li><li>Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., S&#233;raphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration+:+Abstract+Nature+Biotechnology.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration : Abstract Nature Biotechnology.</a> Nature Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Los, G. V., Encell, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaloTag:+A+Novel+Protein+Labeling+Technology+for+Cell+Imaging+and+Protein+Analysis.">HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).</li><li>Dean, S., Sunter, J. D., Wheeler, R. J., Hodkinson, I., Gluenz, E., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolkit+enabling+efficient,+scalable+and+reproducible+gene+tagging+in+trypanosomatids.">A toolkit enabling efficient, scalable and reproducible gene tagging in trypanosomatids.</a> Open biol. 5 (1), 140197 (2015).</li><li>Poon, S. K., Peacock, L., Gibson, W., Gull, K., Kelly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+and+optimized+single+marker+system+for+generating+Trypanosoma+brucei+cell+lines+expressing+T7+RNA+polymerase+and+the+tetracycline+repressor.">A modular and optimized single marker system for generating Trypanosoma brucei cell lines expressing T7 RNA polymerase and the tetracycline repressor.</a> Open biol. 2 (2), 110037 (2012).</li><li>Lam, S. S., Martell, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature meth. 12 (1), 51-54 (2014).</li><li>Shu, X., Lev-Ram, V., Deerinck, T. J., Qi, Y., Ramko, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells,+tissues,+and+organisms.">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLoS biology. , (2011).</li><li>Schimanski, B., Nguyen, T. N., G&#252;nzl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+tandem+affinity+purification+of+trypanosome+protein+complexes+based+on+a+novel+epitope+combination.">Highly efficient tandem affinity purification of trypanosome protein complexes based on a novel epitope combination.</a> Eukaryotic Cell. , (2005).</li><li>Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+stable+transformation+of+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei.">Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Des progrès spectaculaires dans la sensibilité de la protéomique et les méthodes de transcriptomique dans les 5-10 dernières années a fourni des données précieuses sur des milliers de gènes et de leurs produits. Cependant, les outils pour traiter la fonction de ces protéines n&#39;a pas suivi le rythme. Tagging une protéine facilite de nombreuses expériences pour déterminer sa fonction. Par exemple, une protéine peut être fusionnée à une protéine fluorescente dans une variété de différentes couleurs pour faciliter les études de localisation et de co-localisation. Mots - développés pour la microscopie électronique, tels que APEX2 ou miniSOG 11,12, permettent la localisation ultrastructurale de la protéine marquée. Mots - clefs pour la biochimie, comme la balise TAP et ProtC-TEV-ProtA (PTP) tag 7,13 permettent la purification des complexes associés à la protéine pour l&#39; identification de partenaires de liaison ou dans des dosages biochimiques in vitro. Les étapes spécifiques qui sont essentiels à la réussite de la protocol sont les suivantes: l&#39;incorporation de DMSO dans le maître-PCR Mix 1, la congélation de la PCR Master Mix 1 avant l&#39;addition du mélange maître 2, l&#39;utilisation de la polymerase commerciale Master Mix 2 et la modification du tampon CYTOMIX électroporation. Dans notre expérience, il est nécessaire d&#39;utiliser le double du nombre de cellules pour C transfections terminaux de marquage que pour N terminal de marquage transfections afin d&#39;atteindre une proportion similaire de puits positifs. Par conséquent, toutes les mesures doivent être effectuées comme décrit. Cette technique est seulement susceptible d&#39;être couronnée de succès lorsque transfecter l&#39;insecte forme procyclique trypanosome. Formes sanguines ont une efficacité de transfection inférieure 14, de plus ils sont susceptibles de mourir lors de la sélection en raison de la toxicité dépendante de la densité qui est sans rapport avec la drogue sélective. Par conséquent, notre protocole précédent représente la meilleure technologie actuelle pour le marquage de forme sanguine trypanosomes 9. Il est également probable que le transefficacité fection variera dépendant de la trypanosome isolat spécifique. Ce protocole a été optimisé à l&#39;aide de 927 SMOX formes procycliques - d&#39;autres souches peuvent nécessiter une optimisation supplémentaire. Les mesures qui peuvent augmenter la probabilité de succès comprennent: l&#39;augmentation de la quantité de amplicon PCR, ce qui augmente le nombre de cellules incluses dans la transfection. Nous présentons une méthode où des centaines de protéines peuvent être étiquetés en parallèle. Cela facilitera études à grande échelle sur la localisation et de l&#39;interaction, en complément de grands ensembles de données existants et de fournir des informations précieuses à la communauté. modèles Primer sont disponibles sur demande et une liste de plasmides modèles est disponible à partir de: http://www.sdeanresearch.com/

Trypanosoma brucei est un parasite protozoaire qui provoque trypanosomasis humaine africaine et le nagana chez les bovins. T. brucei est un organisme idéal pour l&#39;analyse de la fonction des protéines en raison de la combinaison d&#39;un génome de haute qualité, de nombreux protéomique et des ensembles de données de transcriptomique et des outils moléculaires bien développés 1-3. Les progrès de la protéomique et de séquençage ont abouti à grands ensembles de données qui mettent en évidence potentiellement gènes intéressants 4-6; Cependant, de nombreux gènes ont un minimum d&#39;information qui leur sont associés dans les bases de données existantes. Il existe donc un besoin d&#39;une méthode à haut débit pour faciliter la caractérisation fonctionnelle des protéines. L&#39;expression d&#39;une protéine marquée peut donner une pluralité de points de vue sur la fonction d&#39;une protéine. Par exemple, une protéine marquée avec une protéine fluorescente ou un epitope peuvent être localisés par microscopie à fluorescence, ce qui donne des informations sur l&#39;endroit où la protein pourrait exercer son effet biologique. En variante, une protéine marquée avec un TAP 7, 8 ou halotag Son tag peut être purifié pour des analyses biochimiques et l&#39; identification de ses partenaires d&#39;interaction. Nous avons récemment développé une méthodologie de marquage robuste pour T. 9 brucei. Cette habitude de longue amorce de PCR pour générer l&#39;ADN pour la transfection et a permis le marquage des dizaines de protéines en parallèle - une amélioration importante des protocoles existants. Nous avons maintenant amélioré l&#39;évolutivité de ce protocole dans les formes procycliques par un ordre de grandeur. Ici, nous présentons notre méthode où nous effectuons la PCR et la transfection dans des plaques à 96 puits, avec la récupération et la sélection se produisant dans des plaques à 24 puits. Comme des centaines de protéines peuvent maintenant être étiquetés en parallèle cette méthode fournit une méthode rentable et réalisable pour le marquage du génome du trypanosome entier.

<table><tbody><tr><td>Oligonucleotide</td><td>Life technologies</td><td>na</td><td>desalt only (do not use additional purification)</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roche</td><td>Included with the Expand HiFi pack</td><td>Must be PCR grade</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>any reputable</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expand HiFi polymerase</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>BTX ECM830</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td>Electroporator</td></tr><tr><td>HT-200 plate handler</td><td>Harvard Apparatus</td><td>HT-200</td><td>Handles the 96-well eletroplates</td></tr><tr><td>MOS 96 ELECTROPLATE 4 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0452</td><td>Electroplate for the 96-well electroporation</td></tr><tr><td>Blasticidin S Hydrochloride</td><td>Melford</td><td>3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin b Gold</td><td>Invivogen</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Phleomycin</td><td>Melford</td><td>P0187</td><td></td></tr><tr><td>225 cm TC Flask, canted neck, phenolic cap</td><td>Appletonwoods</td><td>BC006</td><td></td></tr><tr><td>24 well culture plates</td><td>Appletonwoods</td><td>BC017</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;reg; PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z606634-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96-well Multiply&amp;reg; PCR plate with lateral skirt</td><td>Sarstedt</td><td>72.1979.203</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput gene tagging in trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

Dans cette transfection représentative, les amorces ont été conçues en utilisant le script TagIt perl 9 et synthétisés dans le commerce. Le 96 puits PCR a été réalisée et validée comme décrit (figure 1A); dans cet exemple, ont réussi 95/96 PCR (figure 1B). Dans notre expérience, en répétant les réactions ont échoué soit avec les amorces originales ou des amorces de re-synthèse ne se traduit pas dans une PCR réussie. Les amplicons ont été transférées dans des plaques de 96 puits électroporation pour l&#39; électroporation (figure 2A), puis transférées à 24 puits des plaques de culture de récupération et de sélection. Après un temps suffisant pour permettre la sélection de se produire, les puits ont été notés pour la survie avant l&#39;analyse ultérieure. Dans cet exemple, 88/96 puits (92%) étaient positifs après la sélection de 15 jours. <ialt mg = &quot;Figure 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54342 / 54342fig1.jpg&quot; /&gt; Figure 1: Validation de longue amorce de PCR (A) Motif de transfert de produits de PCR provenant de plaque à 96 puits par PCR sur le gel d&#39; agarose pour la validation de la PCR.. (B) A 96 puits PCR gel de validation représentant pour le marquage 95 gènes sur la terminaison N et 1 amplicon ne contenant pas 5 &#39;homologie de ciblage pour agir en tant que témoin négatif dans la transfection. Les échantillons sont chargés sur un 1% (p / v) gel d&#39;agarose et résolues à 100 V pendant 30 min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54342/54342fig2.jpg" /> Figure 2: (A) Motif de transfert de cellules électroporées 96 puits électroporation plat à 96 puits électroporation et sélection.e à 24 puits des plaques de culture tissulaire. (B) montrant un schéma d&#39; un pointage en direct / mort typique après 15 jours de sélection dans des plaques à 24 puits. Le vert représente une transfection réussie, gris représente un puits avec seulement les cellules mortes. Dans cet exemple, 88/96 (92%) des puits contenaient des parasites transfectées avec succès. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei at JoVE.com

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Haut-débit Gene Tagging dans<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

high-throughput-gene-tagging-in-trypanosoma-brucei

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

7.9K vues.  University of Oxford. Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Vidéo: High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate for telomerase for de novo telomere DNA synthesis and is therefore important for telomere maintenance. T. brucei is a protozoan parasite that causes sleeping sickness in humans and nagana in cattle. Once infected mammalian host, T. brucei cell regularly switches its surface antigen to evade the host's immune attack. We have recently demonstrated that the T. brucei telomere structure plays an essential role in regulation of surface antigen gene expression, which is critical for T. brucei pathogenesis. However, T. brucei telomere structure has not been extensively studied due to the limitation of methods for analysis of this specialized structure. We have now successfully adopted the native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension methods for examination of the telomere G-overhang structure and an adaptor ligation method for determination of the telomere terminal nucleotide in T. brucei cells. Here, we will describe the protocols in detail and compare their different advantages and limitations.

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Telomeres are essential for chromosome stability and the telomere G-overhang structure is essential for telomerase-mediated telomere maintenance. We have recently adopted two methods for detecting the telomere G-overhang structure in Trypanosoma brucei, which are native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension, which will be described.

L&#39;examen des télomères G-structure en porte à faux Trypanosoma brucei</em

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Recherche

Immunologie et infection

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target against T. cruzi, it is important to validate the essentiality of the target gene in the mammalian stage of the parasite, the amastigote. Amastigotes of T. cruzi replicate inside the host cell; thus, it is difficult to conduct a knockout experiment without going through other developmental stages. Recently, our group reported a growth condition in which the amastigote can replicate axenically for up to 10 days without losing its amastigote-like properties. By using this temporal axenic amastigote culture, we successfully introduced gRNAs directly into the Cas9-expressing amastigote to cause gene knockouts and analyzed their phenotypes exclusively in the amastigote stage. In this report, we describe a detailed protocol to produce in vitro derived extracellular amastigotes, and to utilize the axenic culture in a CRISPR/Cas9-mediated knockout experiment. The growth phenotype of knockout amastigotes can be evaluated either by cell counts of the axenic culture, or by replication of intracellular amastigote after host cell invasion. This method bypasses the parasite stage differentiation normally involved in producing a transgenic or a knockout amastigote. Utilization of the temporal axenic amastigote culture has the potential to expand the experimental freedom of stage-specific studies in T. cruzi.

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Here, we describe a protocol to introduce a gene knockout into the extracellular amastigote of Trypanosoma cruzi, using the CRISPR/Cas9 system. The growth phenotype can be followed up either by cell counting of axenic amastigote culture or by proliferation of intracellular amastigotes after host cell invasion.

Présentation d'un Knockout Génique Directement dans la phase Amastigote de Trypanosoma cruzi à l'aide du système CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Génétique

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

Manipulation génétique<em&gt; Δku80</em&gt; Les souches pour l&#39;analyse génomique fonctionnelle de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Utilisation de protéines fluorescentes pour surveiller glycosome Dynamics dans le trypanosome africain

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many non-endemic countries due to the increase in migration. This disease affects nearly 8 million people, with new cases estimated at 50,000 per year. In the 1960s and 70s, two drugs for ChD treatment were introduced: nifurtimox and benznidazole (BZN). Both are effective in newborns and during the acute phase of the disease but not in the chronic phase, and their use is associated with important side effects. These facts underscore the urgent need to intensify the search for new drugs against T. cruzi.
T. cruzi is transmitted through hematophagous insect vectors of the Reduviidae and Hemiptera families. Once in the mammalian host, it multiplies intracellularly as the non-flagellated amastigote form and differentiates into the trypomastigote, the bloodstream non-replicative infective form. Inside the insect vector, trypomastigotes transform into the epimastigote stage and multiply through binary fission.
This paper describes an assay based on measuring the activity of the cytoplasmic &#946;-galactosidase released into the culture due to parasites lysis by using the substrate, chlorophenol red &#946;-D-galactopyranoside (CPRG). For this, the T. cruzi Dm28c strain was transfected with a &#946;-galactosidase-overexpressing plasmid and used for in vitro pharmacological screening in epimastigote, trypomastigote, and amastigote stages. This paper also describes how to measure the enzymatic activity in cultured epimastigotes, infected Vero cells with amastigotes, and trypomastigotes released from the cultured cells using the reference drug, benznidazole, as an example. This colorimetric assay is easily performed and can be scaled to a high-throughput format and applied to other T. cruzi strains.

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

We describe a high-throughput colorimetric assay measuring &#946;-galactosidase activity in three life cycle stages of Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. This assay can be used to identify trypanocidal compounds in an easy, fast, and reproducible manner.

In vitro Dépistage médicamenteux contre tous les stades du cycle de vie du trypanosoma cruzi à l’aide de parasites exprimant la β-galactosidase

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

Biochimie

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.
Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.
Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Bioluminescence Imaging pour détecter Late Stage infection de la trypanosomiase africaine

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

détection de la<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Switching Variant de glycoprotéine de surface par magnétique tri cellulaire activé et cytométrie de flux

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is the best method for diagnosis of first stage HAT and furthermore this parasite purification method permits serological and research investigations.
HAT is caused by Tsetse fly transmitted Trypanosoma brucei gambiense and T. b. rhodesiense. Related trypanosomes are the causative agents of animal trypanosomiasis. Trypanosome detection is essential for HAT diagnosis, treatment and follow-up. The technique described here is the most sensitive parasite detection technique, adapted to field conditions for the diagnosis of T. b. gambiense HAT and can be completed within one hour. Blood is layered onto an anion-exchanger column (DEAE cellulose) previously adjusted to pH 8, and elution buffer is added. Highly negatively charged blood cells are adsorbed onto the column whereas the less negatively charged trypanosomes pass through. Collected trypanosomes are pelleted by centrifugation and observed by microscopy. Moreover, parasites are prepared without cellular damage whilst maintaining their infectivity.
Purified trypanosomes are required for immunological testing; they are used in the trypanolysis assay, the gold standard in HAT serology. Stained parasites are utilized in the card agglutination test (CATT) for field serology. Antigens from purified trypanosomes, such as variant surface glycoprotein, exoantigens, are also used in various immunoassays. The procedure described here is designed for African trypanosomes; consequently, chromatography conditions have to be adapted to each trypanosome strain, and more generally, to the blood of each species of host mammal.
These fascinating pathogens are easily purified and available to use in biochemical, molecular and cell biology studies including co-culture with host cells to investigate host-parasite relationships at the level of membrane receptors, signaling, and gene expression; drug testing in vitro; investigation of gene deletion, mutation, or overexpression on metabolic processes, cytoskeletal biogenesis and parasite survival.

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns

This method of trypanosome separation from blood depends on their surface charge being less negative than mammalian blood cells. Infected blood is placed and treated on an anion-exchanger column. This method, the most fitting diagnostic for African trypanosomiasis, provides purified parasites for immunological, biological, biochemical, pharmaceutical and molecular biology investigations.

Purification des Trypanosomes extracellulaires, y compris les pays d’Afrique, du sang par échangeurs d’anions (colonnes diéthylaminoéthyl-cellulose)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

Développement d’une sonde à base de pHluorin2 pour le pH glycosomal chez Trypanosoma brucei

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. Little is known about the cellular responses generated when environmental glucose levels change. In both bloodstream and procyclic form (insect stage) parasites, glycosomes house most of glycolysis. These organelles are rapidly acidified in response to glucose deprivation, which likely results in the allosteric regulation of glycolytic enzymes such as hexokinase. In previous work, localizing the chemical probe used to make pH measurements was challenging, limiting its utility in other applications.
This paper describes the development and use of parasites that express glycosomally localized pHluorin2, a heritable protein pH biosensor. pHluorin2 is a ratiometric pHluorin variant that displays a pH (acid)-dependent decrease in excitation at 395 nm while simultaneously yielding an increase in excitation at 475 nm. Transgenic parasites were generated by cloning the pHluorin2 open reading frame into the trypanosome expression vector pLEW100v5, enabling inducible protein expression in either lifecycle stage. Immunofluorescence was used to confirm the glycosomal localization of the pHluorin2 biosensor, comparing the localization of the biosensor to the glycosomal resident protein aldolase. The sensor responsiveness was calibrated at differing pH levels by incubating cells in a series of buffers that ranged in pH from 4 to 8, an approach we have previously used to calibrate a fluorescein-based pH sensor. We then measured pHluorin2 fluorescence at 405 nm and 488 nm using flow cytometry to determine glycosomal pH. We validated the performance of the live transgenic pHluorin2-expressing parasites, monitoring pH over time in response to glucose deprivation, a known trigger of glycosomal acidification in PF parasites. This tool has a range of potential applications, including potentially being used in high-throughput drug screening. Beyond glycosomal pH, the sensor could be adapted to other organelles or used in other trypanosomatids to understand pH dynamics&#160;in the live cell setting.

Pleins feux sur l’auteur : Progrès dans la surveillance du pH glycosomal chez Trypanosoma brucei à l’aide du biocapteur pHluorin2

We describe a method to study how pH responds to environmental cues in the glycosomes of the bloodstream form of African trypanosomes. This approach involves a pH-sensitive heritable protein sensor in combination with flow cytometry to measure pH dynamics, both as a time-course assay and in a high-throughput screen format.

Mesure des changements dynamiques du pH glycosomal chez Trypanosoma brucei vivant

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

Haut-débit Gene Tagging dans

Résumé

Explorer plus de vidéos

Chapitres dans cette vidéo

L'examen des télomères G-structure en porte à faux Trypanosoma brucei

Présentation d'un Knockout Génique Directement dans la phase Amastigote de Trypanosoma cruzi à l'aide du système CRISPR/Cas9

Manipulation génétique

Utilisation de protéines fluorescentes pour surveiller glycosome Dynamics dans le trypanosome africain

In vitro Dépistage médicamenteux contre tous les stades du cycle de vie du trypanosoma cruzi à l’aide de parasites exprimant la β-galactosidase

Bioluminescence Imaging pour détecter Late Stage infection de la trypanosomiase africaine

détection de la

Purification des Trypanosomes extracellulaires, y compris les pays d’Afrique, du sang par échangeurs d’anions (colonnes diéthylaminoéthyl-cellulose)

Mesure des changements dynamiques du pH glycosomal chez Trypanosoma brucei vivant

Mesure des changements dynamiques du pH glycosomal chez Trypanosoma brucei vivant