SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.

1. 96 poços longo iniciador de PCR <ol><li> Pré-congelação mais frio de 96 poços de PCR em -80 ° C congelador. </li><li> Num tubo de 10 ml, preparar a Mistura de PCR A: 2100 DDH ul H2O, 105 ul de PCR grau DMSO, 105 ul de dNTPs 10 mM, 105 ul de molde pPOT (25 ng / ul) 9, para um volume total de 2415 mL por placa . </li><li> Aliquota 23 uL em cada poço de uma placa de 96 poços de PCR. </li><li> Adicionar 2 ul de 100 uM reunidas iniciadores para cada uma carregada poço utilizando uma pipeta multicanal com P20 de 12 canais. Selar com filme, colocar a placa no sistema de arrefecimento por PCR pré-gelada e deixa-se congelar durante pelo menos 20 min a -80 ° C. </li><li> Num tubo de 10 ml, preparar a Mistura Principal B: 2048 ul de ddH2O, 525 ul de tampão 10X, 52,5 ul de polimerase para um volume total de 2626 mL por placa. </li><li> Remova a placa e refrigerador de PCR da -80 ° C congelador. </li><li> Com a placa ainda no sistema de arrefecimento de PCR, adicionar 25 ul de Mistura B em cima do congeloun mestre Mistura A para um volume total de reacção de 50 ul. Este é um tempo crítico, e deve ser concluída antes Mix A pode descongelar. Selar placa com película. </li><li> Definir termociclador como se segue: 94 ° C durante 10 min, depois 30 ciclos de 94 ° C durante 15 seg, 65 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 2 min, seguido por um período de extensão final de 72 ° C durante 7 min . </li><li> Coloque a placa de PCR após o bloco atingiu 94 ° C. </li></ol> 2. Validação de 96 poços longo Primer PCR <ol><li> Transmitir um grande 1% (w / v) em gel de agarose em Tris-Acetato EDTA (TAE) com tampão de corrida pentes 4 x 28 poços para dar um gel com 4 filas de poços. Alinhar dentes alternados do pente com a ponta de uma pipeta de canais múltiplos 12 de canal. Cuidadosamente submergir o gel em TAE de tampão de corrida após as pistas são carregados. </li><li> Carga escada de DNA 1 kb para o 1º e 28 de poço de cada linha. </li><li> Usando uma pipeta multicanal P20 12 canais, transferir 2 mL de dir produto de PCRrectamente para cada faixa do gel (Figura 1A). Fazer isso rapidamente para reduzir a possibilidade de contaminar os produtos de amplificação. <ol><li> Coloque os produtos de PCR de linha A da placa de PCR para as pistas numeradas ímpares da 1ª fila do gel (A1 - pista 3, A2 - pista 5 ...... A11 - pista 23, A12 - pista 25) e carregar os produtos de PCR da linha B da placa de PCR para as pistas pares do st linha 1 do gel (B1 - faixa 4, A2 - pista 6 ...... B11 - pista 24, B12 - pista 26). </li><li> Carregar os produtos de PCR a partir de linha C e D da placa de PCR, utilizando o mesmo padrão tal como descrito acima, com a linha C para a linha e pistas numeradas D estranho nas pistas de números pares. Continue este padrão de carga até que cada uma das cavidades da placa de PCR é carregado no gel. tampão de carga de ADN não é necessária para carregar este gel. </li></ol></li><li> Colocar o gel para o tanque de corrida e encher o depósito com tampão de corrida TAE até que o gel está submerso. Executar a 100 V durante 30 min evisualizar utilizando um transiluminador de UV. Ver Figura 1B para um gel de exemplo. Nota: Os produtos de PCR podem ser armazenadas a -20 ° C durante várias semanas antes da transfecção </li></ol> 3. A transfecção de 96 poços <ol><li> Use o T. linha brucei pró-cíclica de células forma SMOXP9 10 para este procedimento e crescer em SDM-79 meios contendo 10% FCS 10. </li><li> Use 1 x 10 7 células por transfecção (total de 1,1 x 10 9 células) ao etiquetar no terminal N da proteína e 2 x 10 7 células por transfecção (total de 2,2 x 10 9 células) ao etiquetar no terminal C de a proteína. Manter as células em mid-log (1,2 x 10 6 -1 x 10 7 células / ml) durante vários dias antes da transfecção e colheita das células para transfecção a uma densidade de 5-8 x 10 6 culas / ml. </li><li> Permitir que os produtos de PCR para a transfecção congelados a descongelar à temperatura ambiente. </li><li> Contagem de células utilizando um hemeocytometer ou contador de células automático. </li><li> Pellet número necessário de células em vários tubos de 50 ml a 800 xg durante 10 min. </li><li> Após centrifugação o sobrenadante de descarte e ressuspender as células em 10 ml cytomix modificado (EGTA 0,8 mM, KCl 24 mM, CaCl 0,15 mM de 2, 10 mM de tampão de fosfato de potássio pH 7,6, 25 mM de HEPES-KOH pH 7,6, 2,6 mM de MgCl2, 0,5% (w / v) de glucose, 100 ug / ml de BSA, 1 mM de hipoxantina, sacarose 144 mM) por tubo. Transferir todas as soluções de células a um único tubo e girar novamente a 800 xg durante 10 min. </li><li> Após centrifugação, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 23 ml de cytomix modificado para uma concentração final de 5 x 10 7 células / ml. </li><li> Enquanto as células estão girando, adicionar 1 ml de SDM-79 media a cada poço de placas de cultura de tecidos de 4 x 24 poços. Rotular as placas AD e desenhar um anel em torno de bem A1 em cada placa no marcador permanente para ajudar a orientação placa. </li><li> Ligue o manipulador de placa para a electroporator. No electroporaTor unidade definir a tensão de 1.500 V, a duração do pulso de 100 ms e o número de impulsos de 12 e o intervalo de pulso de 500 ms. No processador de chapa, defina a contagem de impulsos para 1. Isto assegura que electroporador que vai aplicar um único impulso para cada uma das 12 colunas da placa electroporação. </li><li> Usando uma pipeta multicanal canal P200 12, transferir as reacções de PCR a partir da placa de PCR para as placas de 96 poços de electroporação descartável, lacuna de 4 mm. </li><li> Quando as células foram fiadas e são ressuspensos a uma concentração final de 5 x 10 7 células / ml (Passo 3.7), transferidos para um reservatório de reagente. Pipete 200 pi da solução de células em cada poço da placa de electroporação utilizando um canal de pipeta multicanal P200 12, misturar com o produto de PCR por pipetagem. </li><li> Utilizando tecido remover quaisquer gotas a partir do topo da placa para evitar curto-circuitos. </li><li> Aplicar a película de vedação proporcionada na embalagem placa para o topo da placa de electroporação, positioning-lo de modo a deixar os furos para os eléctrodos descobertos na parte superior e inferior de cada coluna. Evite cobrir os pontos levantados usados ​​para guiar o filme. </li><li> Coloque a placa de eletroporação para o manipulador de placa e feche a tampa. Pressione &#39;Pulso&#39; na unidade electroporator. </li><li> Após a electroporação, transferir rapidamente as células a partir da placa de electroporação de 96 poços para as placas de cultura de tecidos de 4 x 24 poços. Para transferir as células, usar um canal de pipeta multicanal P200 12 com cada outra ponta ausente de tal modo que as restantes 6 pontas alinham com as 6 linhas sobre uma placa de cultura de tecidos de 24 cavidades. Transferir as células electroporadas em electroporações as placas de 96 poços em teste padrão pré-definido para as placas de cultura de tecidos de 24 poços (Figura 2A). </li><li> Prepare as pontas de pipeta P200 - para cada transfecção de 96 poços preparar 2 caixas de 96 pontas com cada outra coluna removido. <ol><li> poços de transferência de A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 na placa eletroporação de 96 poços paraplaca seguido uma das placas de cultura de 24 poços de tecido, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 na fileira B, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 na linha C e D1 / D3 / D5 / D7 / D9 / D11 em fileira D. Após a transferência de cada conjunto de 6 poços da placa de 96 cavidades para a placa de 24 poços, os poços da placa de 96 poços são então lavadas com meio dos poços correspondentes na 24- bem placa e a lavagem é então transferida para os poços da placa de 24 poços. </li><li> poços de transferência E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 na placa de electroporação de 96 poços a 24-well plate B linha A, F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 para a linha B, G1 / G3 / G5 / G7 / G9 / G11 na linha C e H1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11 na fileira D. Após a transferência de cada conjunto de 6 poços da placa de 96 poços para a placa de 24 poços, os poços no 96 -bem placa são então lavadas com meio dos poços correspondentes na placa de 24 poços e a lavagem é então transferida para os poços da placa de 24 poços. </li><li> Transferência de poços A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A12 na placa electroporação de 96 poços a 24-well plate C fila A, B2 / B4 / B6 / B8 / B10 / B12 na fileira B, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 na linha C e D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 na fileira D. Após a transferência de cada conjunto de 6 poços a partir do 96 -bem placa para a placa de 24 poços, os poços da placa de 96 poços são então lavadas com meio dos poços correspondentes na placa de 24 poços e a lavagem é então transferida para os poços da placa de 24 poços. </li><li> poços de transferência E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 na placa de electroporação de 96 poços a 24-well plate D linha A, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12 para a linha B, G2 / G4 / G6 / G8 / G10 / G12 em linha C e H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 em fileira D. Após a transferência de cada conjunto de 6 poços da placa de 96 cavidades para a placa de 24 poços, os poços no 96 -bem placa são então lavadas com meio dos poços correspondentes na placa de 24 poços e a lavagem é então transferida para os poços da placa de 24 poços. </li></ol></li><li> Usando um microscópio de contraste de fase invertida, examine um bem de cada coluna para verificar as células. Haverá uma mistura de células vivas e mortas com umquantidade substancial de restos de células. As células vivas pode ser distinguido a partir de células mortas porque eles serão brilhante sob microscopia de contraste de fase e serão em movimento. </li><li> Colocar as placas de 24 poços numa caixa limpa, de plástico com uma tampa que forma uma vedação estanque. Coloque a caixa em um 28 ° C incubadora. </li><li> Entre 6-8 h mais tarde, adicionar 1 ml de SDM-79 com FCS a 10% contendo antibiótico selectivo 2x a cada poço. Na nossa experiência, linhas celulares onde os genes são codificados na extremidade N-terminal são resistentes a concentrações mais elevadas de droga selectiva. Portanto, utilizando blasticidina como um exemplo, a marcação na extremidade N-terminal requer uma concentração final de 20 ug / ml de blasticidina e marcação no terminal C exige uma concentração final de 10 ug / ml de blasticidina. Nota: linhas de células transgênicas se tornarão visíveis 9-10 dias após a transfecção. </li><li> Passagem, pelo menos, duas vezes em droga fresca e meios de comunicação antes da análise. A Figura 2B mostra os resultados de uma transfe típico de 96 poçoscção para colocação de etiquetas 96 proteínas diferentes na terminação N. Avaliar cada poço por microscopia de contraste de fase para determinar se ele contém as células saudáveis, resistentes a drogas. Um bem saudável contém predominantemente (&lt;95%), as células altamente ativos que são brilhantes em microscopia de contraste de fase. Análise subsequente por microscopia de epifluorescência ou western blot é necessário para determinar se a proteína foi marcado com sucesso. </li></ol>

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	<li>Kelly, S., Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+in+Trypanosoma+brucei:+a+collection+of+vectors+for+the+expression+of+tagged+proteins+from+endogenous+and+ectopic+gene+loci.">Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci.</a> Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).</li><li>Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. 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The authors have nothing to disclose.

melhorias dramáticas na sensibilidade da proteômica e métodos transcriptômica nos últimos 5-10 anos forneceu dados valiosos em milhares de genes e seus produtos. No entanto, as ferramentas para lidar com a função destas proteínas não mantiveram o ritmo. Marcação de uma proteína facilita numerosos experimentos para determinar a sua função. Por exemplo, uma proteína podem ser fundidos com uma proteína fluorescente em uma variedade de cores diferentes para facilitar estudos de localização e de co-localização. Etiquetas desenvolvido para microscopia eletrônica, tais como APEX2 ou miniSOG 11,12, permitir a localização ultra-estrutural da proteína marcada. Marcações de bioquímica, tais como a etiqueta TAP, e ProtC-TEV-Prota (PTP) etiquetar 7,13 permitir a purificação de complexos associados com a proteína para a identificação de parceiros de ligação ou em ensaios bioquímicos in vitro. Os passos específicos que são críticos para o sucesso da PROTOCol são: a incorporação de DMSO para a PCR master mix 1, congelação da PCR master mix 1 antes da adição da Mistura Principal 2, a utilização da polimerase comercial na Master Mix 2 e a modificação do tampão cytomix electroporação. Em nossa experiência, é necessário utilizar o dobro do número de células para C transfections terminal de marcação como for N transfections terminal de marcação, a fim de alcançar uma proporção semelhante de poços positivos. Portanto, todos os passos devem ser realizados tal como descrito. Esta técnica só é susceptível de ser bem sucedida quando a transfecção o inseto pró-cíclica forma tripanossoma. Formas corrente sanguínea tem uma menor eficiência de transfecção 14, além disso eles são propensos a morrer durante a selecção devido a toxicidade dependente de densidade que não está relacionada com a droga seletiva. Portanto, o nosso protocolo anterior representa a melhor tecnologia atual para marcar de forma sanguínea tripanossomas 9. É também provável que o transeficiência de infecção variará dependendo do isolado tripanossoma específica. Este protocolo foi otimizado usando 927 SMOX as formas procíclica - outras estirpes pode exigir otimização adicional. As medidas que podem aumentar a probabilidade de sucesso incluem: o aumento da quantidade do fragmento amplificado por PCR, o aumento do número de células incluídas na transfecção. Apresenta-se um método em que centenas de proteínas pode ser marcado em paralelo. Isso irá facilitar estudos de larga escala sobre a localização e interação, complementando conjuntos de dados grandes existentes e fornecendo informações valiosas para a comunidade. modelos de primers estão disponíveis mediante solicitação e uma lista de modelos de plasmídeos está disponível em: http://www.sdeanresearch.com/

Trypanosoma brucei é um parasita protozoário que causa trypanosomasis Africano humana e nagana em bovinos. T. brucei é um organismo ideal para a análise da função da proteína, devido à combinação de um genoma de alta qualidade, numerosos conjuntos de dados e proteómica transcriptômica e ferramentas moleculares bem desenvolvidos 1-3. Avanços na proteômica e sequenciamento resultaram em grandes conjuntos de dados que destacam potencialmente genes interessantes 4-6; no entanto, muitos genes têm o mínimo de informação que lhes estão associados nas bases de dados existentes. Existe portanto uma necessidade de um método de alto rendimento para ajudar a caracterização funcional de proteínas. A expressão de uma proteína com a etiqueta pode dar uma multiplicidade de perspectivas sobre a função de uma proteína. Por exemplo, uma proteína etiquetada com um epitopo ou a proteína fluorescente pode estar localizada por microscopia de fluorescência, que dá informações sobre o onde ProtEin pode ser exercer o seu efeito biológico. Alternativamente, uma proteína marcado com um TAP 7, 8 ou HaloTag Sua marca pode ser purificado para ensaios bioquímicos e identificação dos seus parceiros de interação. Recentemente, desenvolveu uma metodologia de marcação robusta para T. brucei 9. Este utilizado longo de iniciadores de PCR para gerar o ADN para transfecção e deixada a marcação de dezenas de proteínas em paralelo - uma grande melhoria com os protocolos existentes. Temos agora melhorou a escalabilidade deste protocolo em formas pró-cíclicos por uma ordem de magnitude. Aqui, apresentamos o nosso método em que realizar a PCR e transfecção em placas de 96 poços, com a recuperação e seleção ocorrendo em placas de 24 poços. Enquanto centenas de proteínas podem agora ser marcado em paralelo este método fornece um método rentável e viável para marcar o genoma inteiro tripanossoma.

<table><tbody><tr><td>Oligonucleotide</td><td>Life technologies</td><td>na</td><td>desalt only (do not use additional purification)</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roche</td><td>Included with the Expand HiFi pack</td><td>Must be PCR grade</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>any reputable</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expand HiFi polymerase</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>BTX ECM830</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td>Electroporator</td></tr><tr><td>HT-200 plate handler</td><td>Harvard Apparatus</td><td>HT-200</td><td>Handles the 96-well eletroplates</td></tr><tr><td>MOS 96 ELECTROPLATE 4 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0452</td><td>Electroplate for the 96-well electroporation</td></tr><tr><td>Blasticidin S Hydrochloride</td><td>Melford</td><td>3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin b Gold</td><td>Invivogen</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Phleomycin</td><td>Melford</td><td>P0187</td><td></td></tr><tr><td>225 cm TC Flask, canted neck, phenolic cap</td><td>Appletonwoods</td><td>BC006</td><td></td></tr><tr><td>24 well culture plates</td><td>Appletonwoods</td><td>BC017</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;reg; PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z606634-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96-well Multiply&amp;reg; PCR plate with lateral skirt</td><td>Sarstedt</td><td>72.1979.203</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput gene tagging in trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

Neste transfecção representativa, os iniciadores foram desenhados utilizando o script TagIt perl 9 e sintetizado comercialmente. A 96 poços de PCR foi realizada como descrito e validado (Figura 1A); Neste exemplo, 95/96 PCRs foram bem sucedidos (Figura 1B). Em nossa experiência, repetindo reacções falhadas quer com os iniciadores originais ou iniciadores sintetizados-re não resulta em um PCR bem sucedido. Os fragmentos amplificados foram transferidos para placas de 96 poços de electroporação para electroporação (Figura 2A) e, em seguida, transferidos para placas de cultura de 24 poços para a recuperação e selecção. Depois de tempo suficiente para permitir a selecção de ocorrer, os poços foram marcados para a sobrevivência antes de posterior análise. Neste exemplo, 88/96 cavidades (92%) foram positivos após 15 dias de selecção. <img alt = &quot;Figura 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54342 / 54342fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1: Validação da longa iniciador de PCR (A) padrão para a transferência de produtos de PCR a partir de placa de 96 poços de PCR para o gel de agarose para a validação de PCR.. (B) de 96 poços de gel representativa validação de PCR para etiquetar 95 genes na extremidade N-terminal, e um fragmento amplificado contendo não &quot;homologia segmentar 5 para actuar como um controlo negativo na transfecção. As amostras são carregados em um 1% (w / v) em gel de agarose e resolvidos a 100 V durante 30 minutos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54342/54342fig2.jpg" /> Figura 2: 96 poços electroporação e selecção (a) o padrão para a transferência de células electroporadas a partir de 96 poços plat electroporação.E para placas de 24 poços de cultura de tecidos. (B) um esquema que mostra uma pontuação ao vivo / morto típico após 15 dias de selecção em placas de 24 poços. Verde representa uma transfecção bem sucedida, cinzento representa um poço com apenas células mortas. Neste exemplo, 88/96 (92%) de poços continham parasitas transfectadas com sucesso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

De alto rendimento Gene Tagging no<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

high-throughput-gene-tagging-in-trypanosoma-brucei

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

7.9K visualizações.  University of Oxford. Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

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Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate for telomerase for de novo telomere DNA synthesis and is therefore important for telomere maintenance. T. brucei is a protozoan parasite that causes sleeping sickness in humans and nagana in cattle. Once infected mammalian host, T. brucei cell regularly switches its surface antigen to evade the host's immune attack. We have recently demonstrated that the T. brucei telomere structure plays an essential role in regulation of surface antigen gene expression, which is critical for T. brucei pathogenesis. However, T. brucei telomere structure has not been extensively studied due to the limitation of methods for analysis of this specialized structure. We have now successfully adopted the native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension methods for examination of the telomere G-overhang structure and an adaptor ligation method for determination of the telomere terminal nucleotide in T. brucei cells. Here, we will describe the protocols in detail and compare their different advantages and limitations.

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Telomeres are essential for chromosome stability and the telomere G-overhang structure is essential for telomerase-mediated telomere maintenance. We have recently adopted two methods for detecting the telomere G-overhang structure in Trypanosoma brucei, which are native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension, which will be described.

Exame da estrutura G-Telomere saliência na Trypanosoma brucei</em

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Imunologia e Infecção

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target against T. cruzi, it is important to validate the essentiality of the target gene in the mammalian stage of the parasite, the amastigote. Amastigotes of T. cruzi replicate inside the host cell; thus, it is difficult to conduct a knockout experiment without going through other developmental stages. Recently, our group reported a growth condition in which the amastigote can replicate axenically for up to 10 days without losing its amastigote-like properties. By using this temporal axenic amastigote culture, we successfully introduced gRNAs directly into the Cas9-expressing amastigote to cause gene knockouts and analyzed their phenotypes exclusively in the amastigote stage. In this report, we describe a detailed protocol to produce in vitro derived extracellular amastigotes, and to utilize the axenic culture in a CRISPR/Cas9-mediated knockout experiment. The growth phenotype of knockout amastigotes can be evaluated either by cell counts of the axenic culture, or by replication of intracellular amastigote after host cell invasion. This method bypasses the parasite stage differentiation normally involved in producing a transgenic or a knockout amastigote. Utilization of the temporal axenic amastigote culture has the potential to expand the experimental freedom of stage-specific studies in T. cruzi.

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Here, we describe a protocol to introduce a gene knockout into the extracellular amastigote of Trypanosoma cruzi, using the CRISPR/Cas9 system. The growth phenotype can be followed up either by cell counting of axenic amastigote culture or by proliferation of intracellular amastigotes after host cell invasion.

Introduzindo um nocaute genético diretamente no estágio Amastigote do Trypanosoma cruzi usando o sistema crispr/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Genética

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

Manipulação genética em<em&gt; Δku80</em&gt; Cepas para Análise Genômica Funcional de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Utilizando Proteínas Fluorescentes para monitorar glicossomo Dynamics do Trypanosoma Africano

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many non-endemic countries due to the increase in migration. This disease affects nearly 8 million people, with new cases estimated at 50,000 per year. In the 1960s and 70s, two drugs for ChD treatment were introduced: nifurtimox and benznidazole (BZN). Both are effective in newborns and during the acute phase of the disease but not in the chronic phase, and their use is associated with important side effects. These facts underscore the urgent need to intensify the search for new drugs against T. cruzi.
T. cruzi is transmitted through hematophagous insect vectors of the Reduviidae and Hemiptera families. Once in the mammalian host, it multiplies intracellularly as the non-flagellated amastigote form and differentiates into the trypomastigote, the bloodstream non-replicative infective form. Inside the insect vector, trypomastigotes transform into the epimastigote stage and multiply through binary fission.
This paper describes an assay based on measuring the activity of the cytoplasmic &#946;-galactosidase released into the culture due to parasites lysis by using the substrate, chlorophenol red &#946;-D-galactopyranoside (CPRG). For this, the T. cruzi Dm28c strain was transfected with a &#946;-galactosidase-overexpressing plasmid and used for in vitro pharmacological screening in epimastigote, trypomastigote, and amastigote stages. This paper also describes how to measure the enzymatic activity in cultured epimastigotes, infected Vero cells with amastigotes, and trypomastigotes released from the cultured cells using the reference drug, benznidazole, as an example. This colorimetric assay is easily performed and can be scaled to a high-throughput format and applied to other T. cruzi strains.

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

We describe a high-throughput colorimetric assay measuring &#946;-galactosidase activity in three life cycle stages of Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. This assay can be used to identify trypanocidal compounds in an easy, fast, and reproducible manner.

In vitro Triagem de drogas contra todas as etapas do ciclo de vida de Trypanosoma cruzi usando parasitas expressando β-galactosidase

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

Bioquímica

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.
Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.
Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Bioluminescência de imagem para detectar a infecção fase tardia Africano Tripanossomíase

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

detecção de<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Switching Variant glicoproteína de superfície por Magnetic celular ativado Seleção e citometria de fluxo

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is the best method for diagnosis of first stage HAT and furthermore this parasite purification method permits serological and research investigations.
HAT is caused by Tsetse fly transmitted Trypanosoma brucei gambiense and T. b. rhodesiense. Related trypanosomes are the causative agents of animal trypanosomiasis. Trypanosome detection is essential for HAT diagnosis, treatment and follow-up. The technique described here is the most sensitive parasite detection technique, adapted to field conditions for the diagnosis of T. b. gambiense HAT and can be completed within one hour. Blood is layered onto an anion-exchanger column (DEAE cellulose) previously adjusted to pH 8, and elution buffer is added. Highly negatively charged blood cells are adsorbed onto the column whereas the less negatively charged trypanosomes pass through. Collected trypanosomes are pelleted by centrifugation and observed by microscopy. Moreover, parasites are prepared without cellular damage whilst maintaining their infectivity.
Purified trypanosomes are required for immunological testing; they are used in the trypanolysis assay, the gold standard in HAT serology. Stained parasites are utilized in the card agglutination test (CATT) for field serology. Antigens from purified trypanosomes, such as variant surface glycoprotein, exoantigens, are also used in various immunoassays. The procedure described here is designed for African trypanosomes; consequently, chromatography conditions have to be adapted to each trypanosome strain, and more generally, to the blood of each species of host mammal.
These fascinating pathogens are easily purified and available to use in biochemical, molecular and cell biology studies including co-culture with host cells to investigate host-parasite relationships at the level of membrane receptors, signaling, and gene expression; drug testing in vitro; investigation of gene deletion, mutation, or overexpression on metabolic processes, cytoskeletal biogenesis and parasite survival.

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns

This method of trypanosome separation from blood depends on their surface charge being less negative than mammalian blood cells. Infected blood is placed and treated on an anion-exchanger column. This method, the most fitting diagnostic for African trypanosomiasis, provides purified parasites for immunological, biological, biochemical, pharmaceutical and molecular biology investigations.

Purificação de tripanosomas extracelulares, incluindo africanos, de sangue por permutadores de aniões (colunas de celulose-Diethylaminoethyl)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

Desenvolvimento de Sensor Baseado em pHluorin2 para pH Glicossômico em Trypanosoma brucei

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. Little is known about the cellular responses generated when environmental glucose levels change. In both bloodstream and procyclic form (insect stage) parasites, glycosomes house most of glycolysis. These organelles are rapidly acidified in response to glucose deprivation, which likely results in the allosteric regulation of glycolytic enzymes such as hexokinase. In previous work, localizing the chemical probe used to make pH measurements was challenging, limiting its utility in other applications.
This paper describes the development and use of parasites that express glycosomally localized pHluorin2, a heritable protein pH biosensor. pHluorin2 is a ratiometric pHluorin variant that displays a pH (acid)-dependent decrease in excitation at 395 nm while simultaneously yielding an increase in excitation at 475 nm. Transgenic parasites were generated by cloning the pHluorin2 open reading frame into the trypanosome expression vector pLEW100v5, enabling inducible protein expression in either lifecycle stage. Immunofluorescence was used to confirm the glycosomal localization of the pHluorin2 biosensor, comparing the localization of the biosensor to the glycosomal resident protein aldolase. The sensor responsiveness was calibrated at differing pH levels by incubating cells in a series of buffers that ranged in pH from 4 to 8, an approach we have previously used to calibrate a fluorescein-based pH sensor. We then measured pHluorin2 fluorescence at 405 nm and 488 nm using flow cytometry to determine glycosomal pH. We validated the performance of the live transgenic pHluorin2-expressing parasites, monitoring pH over time in response to glucose deprivation, a known trigger of glycosomal acidification in PF parasites. This tool has a range of potential applications, including potentially being used in high-throughput drug screening. Beyond glycosomal pH, the sensor could be adapted to other organelles or used in other trypanosomatids to understand pH dynamics&#160;in the live cell setting.

Autor em destaque: Avanços no monitoramento do pH glicossômico em Trypanosoma brucei usando o biossensor pHluorin2

We describe a method to study how pH responds to environmental cues in the glycosomes of the bloodstream form of African trypanosomes. This approach involves a pH-sensitive heritable protein sensor in combination with flow cytometry to measure pH dynamics, both as a time-course assay and in a high-throughput screen format.

Medindo as alterações dinâmicas do pH glicossomal em Trypanosoma brucei vivo

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

De alto rendimento Gene Tagging no

Resumo

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Exame da estrutura G-Telomere saliência na Trypanosoma brucei

Introduzindo um nocaute genético diretamente no estágio Amastigote do Trypanosoma cruzi usando o sistema crispr/Cas9

Manipulação genética em

Utilizando Proteínas Fluorescentes para monitorar glicossomo Dynamics do Trypanosoma Africano

In vitro Triagem de drogas contra todas as etapas do ciclo de vida de Trypanosoma cruzi usando parasitas expressando β-galactosidase

Bioluminescência de imagem para detectar a infecção fase tardia Africano Tripanossomíase

detecção de

Purificação de tripanosomas extracelulares, incluindo africanos, de sangue por permutadores de aniões (colunas de celulose-Diethylaminoethyl)

Medindo as alterações dinâmicas do pH glicossomal em Trypanosoma brucei vivo

Medindo as alterações dinâmicas do pH glicossomal em Trypanosoma brucei vivo