SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.

1. 96-Well-Lange Primer PCR <ol><li> Pre-freeze 96-Well PCR-Kühler in -80 ° C Gefrierschrank. </li><li> In einem 10 - ml - Tube, Vorbereitung Master Mix A: 2.100 ul ddH 2 O, 105 &amp; mgr; l PCR - Klasse DMSO, 105 &amp; mgr; l 10 mM dNTPs, 105 &amp; mgr; l pPot - Vorlage (25 ng / ul) 9, für ein Gesamtvolumen von 2.415 ul pro Platte . </li><li> Aliquot 23 ul in jede Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte. </li><li> In 2 ul 100 uM gepoolt Primer an jeder geladen und ein P20 12-Kanal Mehrkanal-Pipette. Dichtung mit Film, Platz Platte auf der vorgekühlte PCR-Kühler und lassen für mindestens 20 min bei -80 ° C einzufrieren. </li><li> In einem 10 - ml - Tube, Vorbereitung Master Mix B: 2.048 ul ddH 2 O, 525 ul 10x - Puffer, 52,5 ul Polymerase für ein Gesamtvolumen von 2.626 ul pro Platte. </li><li> Entfernen Sie Platte und PCR-Kühler von -80 ° C-Gefrierschrank. </li><li> Mit der Platte noch auf dem PCR-Kühler, fügen Sie 25 ul Master Mix B auf der Oberseite des gefrorn Master Mix A für eine Gesamtreaktionsvolumen von 50 &amp; mgr; l. Dies ist zeitkritisch und sollte abgeschlossen sein, bevor Mix A auftauen kann. Dichtungsplatte mit Folie. </li><li> Eingestellt Thermocycler wie folgt: 94 ° C für 10 min, dann 30 Zyklen von 94 ° C für 15 sec, 65 ° C für 30 sec, 72 ° C für 2 min, gefolgt von einem letzten Verlängerungszeitraum von 72 ° C für 7 min . </li><li> Laden Sie die PCR-Platte, nachdem der Block 94 ° C erreicht hat. </li></ol> 2. Validierung von 96-Well-Lang Primer PCR <ol><li> Guss eine große 1% (w / v) Agarosegel in Tris-Acetat-EDTA (TAE) Laufpuffer mit 4 x 28-well Kämme ein Gel mit 4 Reihen von Vertiefungen zu geben. Richten abwechselnde Zähne des Kamms mit den Spitzen eines 12-Kanal-Mehrkanalpipette. versenken Sie vorsichtig das Gel in TAE-Puffer laufen, nachdem die Bahnen geladen werden. </li><li> Last 1 kb DNA - Leiter in der 1. und 28. Vertiefung jeder Reihe. </li><li> Unter Verwendung eines P20 12-Kanal Mehrkanal-Pipette 2 ul PCR-Produkt direkt auf jede Spur des Gels (1A). Tun Sie dies schnell die Möglichkeit einer Verunreinigung der Amplikons zu reduzieren. <ol><li> Laden Sie die PCR-Produkte aus der Zeile A der PCR-Platte in die ungeraden Bahnen der ersten Reihe des Gels (A1 - Spur 3, A2 - Bahn 5 ...... A11 - Spur 23, A12 - Spur 25) und laden Sie die PCR-Produkte von Zeile B der PCR - Platte in den geradzahligen Spuren der 1. Zeile des Gels (B1 - Spur 4, A2 - Spur 6 ...... B11 - Spur 24, B12 - Spur 26). </li><li> Laden Sie die PCR-Produkte von Zeile C und D der PCR-Platte das gleiche Muster wie oben beschrieben, mit der Zeile C in die ungeraden Bahnen und Reihe D in den geradzahligen Spuren. Wiederholen Sie diesen Lademuster, bis jede Vertiefung der PCR-Platte auf das Gel geladen wird. DNA-Ladepuffer ist nicht erforderlich, um dieses Gel zu laden. </li></ol></li><li> Legen Sie das Gel in den Lauftank und füllen Sie den Tank mit TAE-Laufpuffer, bis das Gel eingetaucht ist. Laufen bei 100 V für 30 min undunter Verwendung eines UV-Transilluminator sichtbar zu machen. Siehe 1B für ein Beispiel - Gel. Hinweis: Die PCR-Produkte können bei -20 ° C für mehrere Wochen vor der Transfektion gelagert werden </li></ol> 3. 96-Well-Transfection <ol><li> Verwenden Sie die T. brucei prozyklischen Form Zelllinie SMOXP9 10 für dieses Verfahren und wachsen in SDM-79 - Medium , das 10% FCS 10. </li><li> Verwenden 1 x 10 7 Zellen pro Transfektion (insgesamt 1,1 x 10 9 Zellen) , wenn auf dem N - Terminus des Proteins und 2 x 10 7 Zellen pro Transfektion (insgesamt 2,2 × 10 9 Zellen) etikettieren , wenn am C - Terminus Tagging von das Protein. Aufrechterhaltung der Zellen in mid-log (1,2 x 10 &amp; sup6 ; -1 · 10 &amp; sup7 ; Zellen / ml) für einige Tage vor der Transfektion geerntet und die Zellen für die Transfektion in einer Dichte von 5-8 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Erlauben frozen PCR-Produkte für die Transfektion bei Raumtemperatur auftauen. </li><li> Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämocytometer oder automatische Zellzähler. </li><li> Pellet erforderliche Anzahl von Zellen in mehrere 50 ml-Röhrchen bei 800 xg für 10 min. </li><li> Nach Zentrifugation discard Überstand und Resuspendieren der Zellen in 10 ml modifizierte cytomix (0,8 mM EGTA, 24 mM KCl, 0,15 mM CaCl 2, 10 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,6, 25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 2,6 mM MgCl 2, 0,5% (w / v) Glucose, 100 ug / ml BSA, 1 mM Hypoxanthin, 144 mM Saccharose) pro Röhrchen. Übertragen Sie alle Zellenlösungen zu einem einzigen Rohr und drehen wieder bei 800 × g für 10 min. </li><li> Nach dem Zentrifugieren der Überstand verwerfen und die Zellen in 23 ml modifizierter cytomix für eine Endkonzentration von 5 x 10 7 Zellen / ml resuspendieren. </li><li> Während Zellen drehen, 1 ml SDM-79-Medium zu jeder Vertiefung von 4 x 24-well Gewebekulturplatten. Beschriften Sie die Platten AD und zeichnen einen Ring um gut A1 auf jeder Platte in Permanentmarker Plattenorientierung zu helfen. </li><li> Schließen Sie den Plattenhandhabungs zum -Elektroporator. Auf der electroporator Einheit eingestellt, die Spannung auf 1500 V, bis 500 msec die Impulslänge auf 100 &amp; mgr; s und die Anzahl der Impulse bis 12 und des Impulsintervalls. Auf der Platte Handler, stellen Sie die Pulszahl auf 1. Dadurch wird sichergestellt, dass die -Elektroporator einen einzigen Impuls zu jeder der 12 Spalten der Elektroporation Platte gelten. </li><li> Unter Verwendung eines P200 12-Kanal-Mehrkanalpipette, übertragen Sie die PCR-Reaktionen aus der PCR-Platte auf den 96-Loch-Einweg-Elektroporation Platten, 4 mm Spalt. </li><li> Wenn die Zellen versponnen und werden bis zu einer Endkonzentration von 5 x 10 7 Zellen / ml (Schritt 3.7) resuspendiert, Transfer in ein Reaktionsmittelreservoir. Je 200 ul der Zelllösung in jede Vertiefung der Elektroporation Platte mit einer P200 12-Kanal-Multikanal-Pipette, mit PCR-Produkt durch Pipettieren mischen. </li><li> Mit Gewebe entfernen Sie alle Tröpfchen von der Oberseite der Platte um Kurzschlüsse zu vermeiden. </li><li> Tragen Sie die Dichtungsfolie in der Platte Verpackung an die Spitze der Elektroporation Platte, pos bereitgestelltitioning es, um die Löcher für die Elektroden an der Oberseite und Unterseite jeder Spalte freigelegt zu lassen. Vermeiden Sie die angesprochenen Punkte Abdeckung verwendet, um den Film zu führen. </li><li> Legen Sie die Elektroporation Platte in den Plattenhandhabungs und den Deckel schließen. Drücken Sie &#39;Pulse&#39; auf der -Elektroporator Einheit. </li><li> Nach der Elektroporation übertragen schnell die Zellen von der 96-Well-Platte Elektroporation auf die 4 x 24-well Gewebekulturplatten. Um die Zellen zu übertragen, verwenden Sie einen P200 12-Kanal-Mehrkanalpipette mit jeder anderen Spitze fehlt, so dass die restlichen 6 Tipps Linie mit den sechs Reihen auf einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Übertragen Sie die elektroporierten Zellen in den 96-Well - Platten electroporations in vordefinierten Muster auf die 24-Well - Gewebekulturplatten (2A). </li><li> Bereiten Sie die P200 Pipettenspitzen - für jede 96-Well-Transfektion 2 Boxen mit 96 Spitzen mit jeder anderen Spalte entfernt vorzubereiten. <ol><li> Transfer Brunnen A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 auf der 96-Loch-Elektroporation PlatteEine Reihe A der 24-Well-Gewebekulturplatten Platte, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 in Reihe B, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 in Reihe C und D1 / D3 / D5 / D7 / D9 / D11 in Reihe D. nach der Übertragung eines jeden Satzes von 6 Vertiefungen von der 96-Well-Platte mit der 24-Well-Platte werden die Vertiefungen in der 96-Well-Platte dann mit Medien aus den entsprechenden Vertiefungen in der 24- gewaschen Well-Platte und die Waschlösung wird dann zurück in die Vertiefungen in der Platte mit 24 Vertiefungen überführt. </li><li> Transfer Brunnen E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 auf der 96-Loch-Elektroporation Platte bis 24-Well-Platte B Reihe A, F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 in Reihe B, G1 / G3 / G5 / G7 / G9 / G11 in Zeile C und H1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11 in Reihe D. nach der Übertragung eines jeden Satzes von 6 Vertiefungen von der 96-Well-Platte mit der 24-Well-Platte, die Vertiefungen in der 96 -Wanne Platte werden dann mit Medien aus den entsprechenden Vertiefungen in der Platte mit 24 Vertiefungen gewaschen und die Waschlösung wird dann zurück in die Vertiefungen in der Platte mit 24 Vertiefungen überführt. </li><li> Transfer Brunnen A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A12 auf der 96-Loch-Elektroporation Platte bis 24-Well-Platte C Reihe A, B2 / B4 / B6 / B8 / B10 / B12 in Reihe B, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 in Reihe C und D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 in Reihe D. Nach der Übertragung eines jeden Satzes von sechs Brunnen aus dem 96 -Wanne Platte an der 24-Well-Platte, die Vertiefungen in der Platte mit 96 Vertiefungen werden dann mit Medien aus den entsprechenden Vertiefungen in der Platte mit 24 Vertiefungen gewaschen und die Waschlösung wird dann zurück in die Vertiefungen in der Platte mit 24 Vertiefungen überführt. </li><li> Transfer Brunnen E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 auf der 96-Loch-Elektroporation Platte bis 24-Well-Platte D Reihe A, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12 in Reihe B, G2 / G4 / G6 / G8 / G10 / G12 in Reihe C und H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 in Reihe D. nach der Übertragung eines jeden Satzes von 6 Vertiefungen von der 96-Well-Platte mit der 24-Well-Platte, die Vertiefungen in der 96 -Wanne Platte werden dann mit Medien aus den entsprechenden Vertiefungen in der Platte mit 24 Vertiefungen gewaschen und die Waschlösung wird dann zurück in die Vertiefungen in der Platte mit 24 Vertiefungen überführt. </li></ol></li><li> Unter Verwendung eines invertierten Phasenkontrastmikroskop untersuchen 1 gut aus jeder Spalte, die Zellen zu überprüfen. Es wird mit einem eine Mischung aus lebenden und toten Zellen seinbeträchtliche Menge an Zelltrümmern. Lebende Zellen können von toten Zellen unterschieden werden, weil sie unter dem Phasenkontrastmikroskopie hell sein wird und sich bewegen. </li><li> Legen Sie die 24-Well-Platten in einem sauberen, Kunststoff-Box mit einem Deckel, der eine dichte Abdichtung bildet. Legen Sie die Box in einem 28 ° C Inkubator. </li><li> Zwischen 6-8 Stunden später 1 ml SDM-79 mit FCS 10% gut 2x selektive Antibiotikum jeweils. In unserer Erfahrung, wo Zellinien die Gene am N-Terminus markiert sind, sind widerstandsfähig gegen höhere Konzentrationen des selektiven Arzneimittels. Daher erfordert / ml auf eine Endkonzentration von 20 ug verwendet Blasticidin als Beispiel am N-Terminus Tagging am C-Terminus Blasticidin und Etikettieren in einer Endkonzentration von 10 ug erfordert / ml Blasticidin. Hinweis: Transgene Zelllinien 9-10 Tage nach der Transfektion sichtbar werden. </li><li> Passage mindestens zweimal in frischem Arzneimittel- und Medien vor der Analyse. 2B zeigt die Ergebnisse aus einem typischen 96-well transfection für 96 verschiedene Proteine ​​am N-Terminus etikettieren. Beurteilen Sie jede Vertiefung durch Phasenkontrastmikroskopie zu bestimmen, ob es gesund enthält, arzneimittelresistenten Zellen. Eine gesunde und enthält überwiegend (&lt;95%) hochaktive Zellen, die in der Phase Vertrag Mikroskopie hell sind. Anschließende Analyse durch Epifluoreszenzmikroskopie oder Western-Blot ist erforderlich, um festzustellen, ob das Protein erfolgreich markiert ist. </li></ol>

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	<li>Kelly, S., Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+in+Trypanosoma+brucei:+a+collection+of+vectors+for+the+expression+of+tagged+proteins+from+endogenous+and+ectopic+gene+loci.">Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci.</a> Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).</li><li>Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. 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The authors have nothing to disclose.

Dramatische Verbesserungen in der Empfindlichkeit der Proteomik und Transkriptomik Methoden in den letzten 5-10 Jahren auf Tausenden von Genen und ihren Produkten wertvolle Daten zur Verfügung gestellt. Allerdings sind die Werkzeuge die Funktion dieser Proteine ​​Adresse haben nicht Schritt gehalten. Tagging ein Protein erleichtert zahlreiche Versuche, seine Funktion zu bestimmen. Zum Beispiel kann ein Protein in einer Vielzahl von verschiedenen Farben zu einem fluoreszierenden Protein fusioniert werden Studien Lokalisation und Co-Lokalisierung zu erleichtern. Stichworte für die Elektronenmikroskopie entwickelt, wie APEX2 oder miniSOG 11,12 erlauben ultrastrukturelle Lokalisierung des markierten Proteins. Tags für die Biochemie, wie dem TAP - Tag und ProtC-TEV-ProtA (PTP) -Tag 7,13 Reinigung von Komplexen ermöglichen , mit dem Protein zur Identifizierung von Bindungspartnern oder in vitro biochemische Assays verbunden. Die spezifischen Schritte, die für den Erfolg der Protoc kritischol, sind: der Einbau von DMSO in die PCR Master Mix 1, Gefrieren des PCR Master Mix 1 vor der Zugabe des Master Mix 2, die Verwendung des handelsüblichen Polymerase in Master Mix 2 und der Modifikation des cytomix Elektroporationspuffer. Nach unserer Erfahrung ist es notwendig, die doppelte Anzahl von Zellen für die C-terminalen Markierungs Transfektionen wie für N-Terminal-Tagging Transfektionen verwendet werden, um einen ähnlichen Anteil an positiven Vertiefungen zu erreichen. Daher sollten alle Schritte wie beschrieben durchgeführt. Diese Technik ist wahrscheinlich nur erfolgreich sein, wenn das Insekt prozyklischen Form Trypanosomen transfizieren. Blutstrom Formen haben eine geringere Transfektionseffizienz 14, zudem sind sie wahrscheinlich aufgrund von Dichteabhängigen Toxizität bei der Auswahl zu sterben, die mit dem selektiven Medikament nicht in Beziehung steht. Daher stellt unsere bisherigen Protokoll die aktuelle beste Technologie für 9 von Blutformen Trypanosomen - Tagging. Es ist auch wahrscheinlich, dass die transfection Effizienz hängt von der spezifischen Trypanosomen-Isolat variieren. Dieses Protokoll wurde mit 927 SMOX prozyklischen Formen optimiert - andere Stämme zusätzliche Optimierung erfordern. Maßnahmen, welche die Erfolgswahrscheinlichkeit erhöhen können, umfassen: die Menge des PCR-Amplikons, Erhöhung der Anzahl von Zellen in der Transfektionseffizienz eingeschlossen. Wir stellen eine Methode, in der Hunderte von Proteinen können parallel markiert werden. Dies wird, groß angelegte Studien über die Lokalisierung und Interaktion zu erleichtern, die Ergänzung bestehender großer Datensätze und wertvolle Informationen für die Allgemeinheit erbringen. Primer-Vorlagen sind auf Anfrage erhältlich und eine Liste von Plasmiden Vorlagen finden Sie unter: http://www.sdeanresearch.com/

Trypanosoma brucei ist ein einzelliger Parasit, der bei Rindern menschlichen afrikanischen trypanosomasis und Nagana verursacht. T. brucei ist ein idealer Organismus für die Analyse von Proteinfunktion aufgrund der Kombination von hoher Qualität Genoms, zahlreiche Proteomik und Transkriptomik Datensätze und gut entwickelte molekulare Werkzeuge 1-3. Die Fortschritte in der Proteomik und Sequenzierung haben in großen Datensätzen geführt , die potentiell interessante Gene 4-6 hervorzuheben; Allerdings haben viele Gene minimale Informationen mit ihnen in den vorhandenen Datenbanken verbunden. Es besteht daher ein Bedarf für ein Hochdurchsatzverfahren Protein funktionelle Charakterisierung zu unterstützen. Expression eines markierten Proteins kann eine Vielzahl von Einsichten in ein Protein der Funktion geben. Zum Beispiel ist ein Protein mit einem fluoreszierenden Protein oder epitopmarkiert kann durch Fluoreszenzmikroskopie lokalisiert werden, die Informationen darüber, wo die prot gibtein könnte seine biologische Wirkung werden ausübt. Alternativ kann ein Protein mit einer TAP getaggt 7, HaloTag 8 oder His - Tag kann für biochemische Assays und Identifizierung seiner Interaktionspartner , gereinigt werden. Wir entwickelten kürzlich eine robuste Tagging Methodik für T. brucei 9. Benutzten langen Primer PCR die DNA für die Transfektion zu erzeugen und das Tagging von Dutzenden von Proteinen in parallel erlaubt - eine wesentliche Verbesserung bestehender Protokolle. Wir haben nun die Skalierbarkeit dieses Protokolls in prozyklischen Formen durch eine Größenordnung verbessert. Hier stellen wir unsere Methode, wo wir die PCR und Transfektion in 96-Well-Platten durchzuführen, wobei die Rückgewinnung und Auswahl auftretenden in Platten mit 24 Vertiefungen. Wie Hunderte von Proteinen können nun parallel markiert bietet dieses Verfahren eine kostengünstige und praktikable Methode für die gesamte Trypanosomen Genom-Tagging.

<table><tbody><tr><td>Oligonucleotide</td><td>Life technologies</td><td>na</td><td>desalt only (do not use additional purification)</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roche</td><td>Included with the Expand HiFi pack</td><td>Must be PCR grade</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>any reputable</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expand HiFi polymerase</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>BTX ECM830</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td>Electroporator</td></tr><tr><td>HT-200 plate handler</td><td>Harvard Apparatus</td><td>HT-200</td><td>Handles the 96-well eletroplates</td></tr><tr><td>MOS 96 ELECTROPLATE 4 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0452</td><td>Electroplate for the 96-well electroporation</td></tr><tr><td>Blasticidin S Hydrochloride</td><td>Melford</td><td>3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin b Gold</td><td>Invivogen</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Phleomycin</td><td>Melford</td><td>P0187</td><td></td></tr><tr><td>225 cm TC Flask, canted neck, phenolic cap</td><td>Appletonwoods</td><td>BC006</td><td></td></tr><tr><td>24 well culture plates</td><td>Appletonwoods</td><td>BC017</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;reg; PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z606634-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96-well Multiply&amp;reg; PCR plate with lateral skirt</td><td>Sarstedt</td><td>72.1979.203</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput gene tagging in trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

In dieser repräsentativen Transfektion wurden die Primer mit der TagIt Perl - Skript 9 und synthetisiert kommerziell entwickelt. Die 96-Well - PCR wurde wie beschrieben (1A) durchgeführt und validiert; in diesem Beispiel 95/96 PCRs erfolgreich waren (1B). Nach unserer Erfahrung Wiederholen fehlgeschlagen Reaktionen entweder mit den ursprünglichen Primern oder neu synthetisierten Primer nicht in erfolgreicher PCR führt. Die Amplikons wurden in 96-well Platten transferiert Elektroporation zur Elektroporation (2A) und dann in 24-Well - Kulturplatten zur Gewinnung und Selektion transferiert. Nach ausreichender Zeit die Auswahl stattfinden zu lassen, wurden die Vertiefungen für das Überleben vor der weiteren Analyse erzielt. In diesem Beispiel 88/96 Brunnen (92%) waren nach 15 Tagen Selektion positiv. <img alt = &quot;1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54342 / 54342fig1.jpg&quot; /&gt; Abbildung 1: Validierung von langer Primer PCR (A) Muster für die Übertragung von PCR - Produkte von 96-Well - PCR - Platte auf dem Agarose - Gel für die Validierung von PCR.. (B) Ein repräsentativer 96-Well - PCR - Validierung Gel für 95 Gene auf dem N - Terminus - Tagging und 1 Amplikon keine 5 &#39;Targeting Homologie enthalten , als negative Kontrolle in die Transfektionseffizienz zu wirken. Die Proben werden geladen auf ein 1% (w / v) Agarose - Gel und für 30 Minuten bei 100 V aufgelöst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54342/54342fig2.jpg" /> Abbildung 2: 96-Well - Elektroporation und Selektion (A) Muster für elektroporierten Zellen von 96-Well - Elektroporation plat übertragen.E 24-Well-Gewebekulturplatten. (B) Ein Schema , das eine typische Live / Dead - Scoring nach 15 Tagen Selektion in 24-Well - Platten zeigt. Grün steht für eine erfolgreiche Transfektion, grau stellt ein gut mit nur tote Zellen. In diesem Beispiel 88/96 (92%) von Wells enthielten erfolgreich transfizierten Parasiten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Hochdurchsatz-Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

high-throughput-gene-tagging-in-trypanosoma-brucei

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

7.9K Aufrufe.  University of Oxford. Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Serie: High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate for telomerase for de novo telomere DNA synthesis and is therefore important for telomere maintenance. T. brucei is a protozoan parasite that causes sleeping sickness in humans and nagana in cattle. Once infected mammalian host, T. brucei cell regularly switches its surface antigen to evade the host's immune attack. We have recently demonstrated that the T. brucei telomere structure plays an essential role in regulation of surface antigen gene expression, which is critical for T. brucei pathogenesis. However, T. brucei telomere structure has not been extensively studied due to the limitation of methods for analysis of this specialized structure. We have now successfully adopted the native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension methods for examination of the telomere G-overhang structure and an adaptor ligation method for determination of the telomere terminal nucleotide in T. brucei cells. Here, we will describe the protocols in detail and compare their different advantages and limitations.

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Telomeres are essential for chromosome stability and the telomere G-overhang structure is essential for telomerase-mediated telomere maintenance. We have recently adopted two methods for detecting the telomere G-overhang structure in Trypanosoma brucei, which are native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension, which will be described.

Die Untersuchung der Telomere G-Überhang Struktur in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target against T. cruzi, it is important to validate the essentiality of the target gene in the mammalian stage of the parasite, the amastigote. Amastigotes of T. cruzi replicate inside the host cell; thus, it is difficult to conduct a knockout experiment without going through other developmental stages. Recently, our group reported a growth condition in which the amastigote can replicate axenically for up to 10 days without losing its amastigote-like properties. By using this temporal axenic amastigote culture, we successfully introduced gRNAs directly into the Cas9-expressing amastigote to cause gene knockouts and analyzed their phenotypes exclusively in the amastigote stage. In this report, we describe a detailed protocol to produce in vitro derived extracellular amastigotes, and to utilize the axenic culture in a CRISPR/Cas9-mediated knockout experiment. The growth phenotype of knockout amastigotes can be evaluated either by cell counts of the axenic culture, or by replication of intracellular amastigote after host cell invasion. This method bypasses the parasite stage differentiation normally involved in producing a transgenic or a knockout amastigote. Utilization of the temporal axenic amastigote culture has the potential to expand the experimental freedom of stage-specific studies in T. cruzi.

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Here, we describe a protocol to introduce a gene knockout into the extracellular amastigote of Trypanosoma cruzi, using the CRISPR/Cas9 system. The growth phenotype can be followed up either by cell counting of axenic amastigote culture or by proliferation of intracellular amastigotes after host cell invasion.

Einführung eines Gene Knockout direkt in die Amastigote-Phase von Trypanosoma cruzi mit dem CRISPR/Cas9-System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Genetik

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

Genetische Manipulation in<em&gt; Δku80</em&gt; Die Stämme für Funktionelle Genomanalyse<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Mit fluoreszierenden Proteinen zu Glycosome Dynamics in der afrikanischen Trypanosomen auf Monitor

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many non-endemic countries due to the increase in migration. This disease affects nearly 8 million people, with new cases estimated at 50,000 per year. In the 1960s and 70s, two drugs for ChD treatment were introduced: nifurtimox and benznidazole (BZN). Both are effective in newborns and during the acute phase of the disease but not in the chronic phase, and their use is associated with important side effects. These facts underscore the urgent need to intensify the search for new drugs against T. cruzi.
T. cruzi is transmitted through hematophagous insect vectors of the Reduviidae and Hemiptera families. Once in the mammalian host, it multiplies intracellularly as the non-flagellated amastigote form and differentiates into the trypomastigote, the bloodstream non-replicative infective form. Inside the insect vector, trypomastigotes transform into the epimastigote stage and multiply through binary fission.
This paper describes an assay based on measuring the activity of the cytoplasmic &#946;-galactosidase released into the culture due to parasites lysis by using the substrate, chlorophenol red &#946;-D-galactopyranoside (CPRG). For this, the T. cruzi Dm28c strain was transfected with a &#946;-galactosidase-overexpressing plasmid and used for in vitro pharmacological screening in epimastigote, trypomastigote, and amastigote stages. This paper also describes how to measure the enzymatic activity in cultured epimastigotes, infected Vero cells with amastigotes, and trypomastigotes released from the cultured cells using the reference drug, benznidazole, as an example. This colorimetric assay is easily performed and can be scaled to a high-throughput format and applied to other T. cruzi strains.

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

We describe a high-throughput colorimetric assay measuring &#946;-galactosidase activity in three life cycle stages of Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. This assay can be used to identify trypanocidal compounds in an easy, fast, and reproducible manner.

In vitro Arzneimittelscreening gegen alle Lebenszyklusstadien von Trypanosoma cruzi unter Verwendung von Parasiten, die β-Galactosidase exprimieren

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

Biochemie

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.
Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.
Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Biolumineszenz-Bildgebung zur Erkennung von Late Stage-Infektion der afrikanischen Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Nachweis von<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variante Oberflächen-Glykoprotein Switching von Magnetic Activated Cell Sorting und Durchflusszytometrie

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is the best method for diagnosis of first stage HAT and furthermore this parasite purification method permits serological and research investigations.
HAT is caused by Tsetse fly transmitted Trypanosoma brucei gambiense and T. b. rhodesiense. Related trypanosomes are the causative agents of animal trypanosomiasis. Trypanosome detection is essential for HAT diagnosis, treatment and follow-up. The technique described here is the most sensitive parasite detection technique, adapted to field conditions for the diagnosis of T. b. gambiense HAT and can be completed within one hour. Blood is layered onto an anion-exchanger column (DEAE cellulose) previously adjusted to pH 8, and elution buffer is added. Highly negatively charged blood cells are adsorbed onto the column whereas the less negatively charged trypanosomes pass through. Collected trypanosomes are pelleted by centrifugation and observed by microscopy. Moreover, parasites are prepared without cellular damage whilst maintaining their infectivity.
Purified trypanosomes are required for immunological testing; they are used in the trypanolysis assay, the gold standard in HAT serology. Stained parasites are utilized in the card agglutination test (CATT) for field serology. Antigens from purified trypanosomes, such as variant surface glycoprotein, exoantigens, are also used in various immunoassays. The procedure described here is designed for African trypanosomes; consequently, chromatography conditions have to be adapted to each trypanosome strain, and more generally, to the blood of each species of host mammal.
These fascinating pathogens are easily purified and available to use in biochemical, molecular and cell biology studies including co-culture with host cells to investigate host-parasite relationships at the level of membrane receptors, signaling, and gene expression; drug testing in vitro; investigation of gene deletion, mutation, or overexpression on metabolic processes, cytoskeletal biogenesis and parasite survival.

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns

This method of trypanosome separation from blood depends on their surface charge being less negative than mammalian blood cells. Infected blood is placed and treated on an anion-exchanger column. This method, the most fitting diagnostic for African trypanosomiasis, provides purified parasites for immunological, biological, biochemical, pharmaceutical and molecular biology investigations.

Reinigung der extrazellulären Trypanosomen, einschließlich Afrika, aus Blut von Anionen-Austauscher (Diethylaminoethyl-Zellulose Spalten)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

Entwicklung eines pHluorin2-basierten Sensors für den glykosomalen pH-Wert bei Trypanosoma brucei

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. Little is known about the cellular responses generated when environmental glucose levels change. In both bloodstream and procyclic form (insect stage) parasites, glycosomes house most of glycolysis. These organelles are rapidly acidified in response to glucose deprivation, which likely results in the allosteric regulation of glycolytic enzymes such as hexokinase. In previous work, localizing the chemical probe used to make pH measurements was challenging, limiting its utility in other applications.
This paper describes the development and use of parasites that express glycosomally localized pHluorin2, a heritable protein pH biosensor. pHluorin2 is a ratiometric pHluorin variant that displays a pH (acid)-dependent decrease in excitation at 395 nm while simultaneously yielding an increase in excitation at 475 nm. Transgenic parasites were generated by cloning the pHluorin2 open reading frame into the trypanosome expression vector pLEW100v5, enabling inducible protein expression in either lifecycle stage. Immunofluorescence was used to confirm the glycosomal localization of the pHluorin2 biosensor, comparing the localization of the biosensor to the glycosomal resident protein aldolase. The sensor responsiveness was calibrated at differing pH levels by incubating cells in a series of buffers that ranged in pH from 4 to 8, an approach we have previously used to calibrate a fluorescein-based pH sensor. We then measured pHluorin2 fluorescence at 405 nm and 488 nm using flow cytometry to determine glycosomal pH. We validated the performance of the live transgenic pHluorin2-expressing parasites, monitoring pH over time in response to glucose deprivation, a known trigger of glycosomal acidification in PF parasites. This tool has a range of potential applications, including potentially being used in high-throughput drug screening. Beyond glycosomal pH, the sensor could be adapted to other organelles or used in other trypanosomatids to understand pH dynamics&#160;in the live cell setting.

Autor im Rampenlicht: Fortschritte bei der glykosomalen pH-Überwachung bei Trypanosoma brucei mit dem pHluorin2-Biosensor

We describe a method to study how pH responds to environmental cues in the glycosomes of the bloodstream form of African trypanosomes. This approach involves a pH-sensitive heritable protein sensor in combination with flow cytometry to measure pH dynamics, both as a time-course assay and in a high-throughput screen format.

Messung dynamischer glykosomaler pH-Änderungen bei lebenden Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

Hochdurchsatz-Gene Tagging in

Zusammenfassung

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Die Untersuchung der Telomere G-Überhang Struktur in Trypanosoma brucei

Einführung eines Gene Knockout direkt in die Amastigote-Phase von Trypanosoma cruzi mit dem CRISPR/Cas9-System

Genetische Manipulation in

Mit fluoreszierenden Proteinen zu Glycosome Dynamics in der afrikanischen Trypanosomen auf Monitor

In vitro Arzneimittelscreening gegen alle Lebenszyklusstadien von Trypanosoma cruzi unter Verwendung von Parasiten, die β-Galactosidase exprimieren

Biolumineszenz-Bildgebung zur Erkennung von Late Stage-Infektion der afrikanischen Trypanosomiasis

Nachweis von

Reinigung der extrazellulären Trypanosomen, einschließlich Afrika, aus Blut von Anionen-Austauscher (Diethylaminoethyl-Zellulose Spalten)

Messung dynamischer glykosomaler pH-Änderungen bei lebenden Trypanosoma brucei

Messung dynamischer glykosomaler pH-Änderungen bei lebenden Trypanosoma brucei