Name: laser-assisted cytoplasmic microinjection in livestock zygotes
Uploaded: 2016-10-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes at JoVE.com

Work related to this technique is supported by NIH/NICHD RO1 HD070044 and USDA/NIFA Hatch projects W-3171 and W-2112.

1. Producción Micropipeta <ol><li> micropipeta de inyección <ol><li> Colocar un capilar de vidrio de borosilicato (diámetro externo (OD): 1,0 mm, diámetro interior (ID): 0,75 mm) en un extractor de micropipeta (en el centro de los titulares de derechos y capilares izquierda) y bloquearla. </li><li> Utilice un programa apropiado para tirar del capilar de vidrio por lo que se traduce en una punta fina con una larga Tapper. (Ejemplo: Calor: 825; Tire: 30; Velocidad: 120; Tiempo: 200; Presión: 500). </li><li> Retirar con cuidado las pipetas tirados desde el dispositivo y colocarlo en un microforge en una posición horizontal. </li><li> Llevar la pipeta accionada y el filamento calefactor microforge con su cuenta de vidrio en el foco. Utilice la retícula ocular para medir el espesor deseado y mover la pipeta horizontalmente hasta que el filamento calentador alcanza el diámetro interior de destino (5 micras). </li><li> Ajustar el calor a aproximadamente 45% y llevar suavemente la pipeta hacia abajo de manera que toque el filamento. Activar el calentador brevemente. esta wenfermo ligeramente fundir la pipeta por lo que se adhiere al filamento y tras el enfriamiento, la pipeta se romperá en el punto de contacto la generación de un corte recto. Nota: Ajuste de la temperatura adecuada es clave en este paso ya que las temperaturas demasiado altas harán que la curva de la pipeta y por lo tanto un corte recto no serán posibles y las temperaturas demasiado bajas no serán suficientes para fundir la pipeta (Figura 1A). </li><li> Hacer un aproximado ángulo de 30 °, cerca de la punta de la pipeta al colocarla cerca de 10 m de distancia del filamento calefactor. Ajuste la temperatura a 60% y activar el calentador. Nota: Esto doblar la pipeta sobre el filamento. Se desea Este ángulo de modo que la punta de la aguja es paralela a la superficie de la placa de inyección cuando está montado en el inyector (Figura 1B). </li><li> Manejar pipetas de microinyección con precaución, ya que son muy afiladas y frágil. </li></ol></li><li> sosteniendo micropipeta <ol><li> Coloque una borosiliccomió capilar de vidrio (diámetro exterior: 1,0 mm, ID: 0,75 mm) en un extractor de micropipeta (en el centro de los titulares de derechos y capilares izquierda) y bloquearlo. </li><li> Utilice un programa apropiado para tirar del capilar de vidrio por lo que se traduce en una punta fina con una larga incluso estrecharse y paredes paralelas (Ejemplo: Calor: 815; Tire: 20; Velocidad: 140; Tiempo: 175; Presión: 200). </li><li> Retirar con cuidado la pipeta retirado del dispositivo extractor y colocarlo en el soporte microforge en una posición horizontal. Ajuste el enfoque en el filamento calefactor y pipeta. </li><li> Utilice la retícula ocular para medir el diámetro de la pipeta y mover la pipeta hasta que su diámetro por encima del filamento llega a 180 micras. </li><li> En el tamaño indicado, marcar el capilar de vidrio con una pluma de punta de diamante, y luego presione suavemente en la punta tirado para romper el vidrio. Esto debe resultar en un corte recto (Figura 1C). </li><li> Mover la pipeta a una posición vertical con su punta cerca del filamento. Ajuste la temperatura<html> de la microforge a 60%. </li><li> Fuego esmalte de la punta de la pipeta usando técnicas estándar 7 hasta que alcanza una ID de 40 micras. Utilice la retícula ocular para comprobar el ID (Figura 1D). </li><li> Hacer un ángulo de la pipeta. <ol><li> Llevar la pipeta de vuelta a una posición horizontal sobre 10 m de distancia del filamento y 5 mm de distancia de la punta. Ajustar la temperatura a aproximadamente 60% y activar el calentador para doblar la pipeta sobre el filamento. Continuar calentando hasta que se alcanza un ángulo deseado (de alrededor de 30 o). Compruebe el ángulo visual (Figura 1E). Nota: La pipeta se monta generalmente a la microinyector en un ángulo aproximado de 60 o con respecto a la parte inferior de la placa de inyección. La punta de la pipeta se dobla de modo que es paralelo al fondo de la placa, que es necesaria para la inyección correcta del embrión en su plano medio. </li></ol></li></ol></li></ol>Le &quot;&gt; 2. Configuración Micromanipulador <ol><li> Compruebe que los microinyectores están completamente cargados con aceite y que no haya burbujas de aire en el sistema (burbujas en el microinyector impiden un control preciso de la inyección). </li><li> Compruebe que los micromanipulador están en la posición central. Esto permitirá una amplia gama de movimiento de las pipetas. </li><li> Inserte la pipeta en el soporte que sostiene micromanipulador izquierda y la pipeta de inyección en el soporte de micromanipulación derecha. </li><li> Deje que el aceite entre en las pipetas por capilaridad y comprobar que el sistema está funcionando correctamente moviendo el petróleo hacia arriba y abajo dentro de la pipeta usando los controles microinyector. Nota: Si no hay circulación de aceite en el interior de las agujas, puede haber una obstrucción. En este caso, utilice una aguja nueva. </li><li> Utilice los controles micromanipulador para traer las pipetas en el centro del campo de visión del microscopio. El uso de magnificación 4X, comprobar que las puntas de micropipeta están en el ángulo correcto (pan paralelo a la parte inferior del plato). Nota: Una configuración correcta de las agujas es clave para una inyección de éxito y los resultados consistencia. </li><li> Calibrar el sistema láser siguiente manual de calibración del fabricante. </li></ol> 3. Preparación de plato de la inyección (Figura 2) <ol><li> Coloque una gota 50 l de calentado (37 ° C) SOF-HEPES (composición se detalla en la sección de materiales) suplementado con suero de 20% de bovino fetal (FBS) en el centro de la tapa de un 100 mm placa de Petri. Colocar un 1 - drop l 2 de la solución a inyectar cerca de la caída de la inyección. Asegúrese de que los embriones no se enfría por debajo de la temperatura ambiente. Nota: En este protocolo vamos a añadir el colorante rojo-dextrano a la solución de inyección para poder visualizar el sitio de la inyección y hacer un seguimiento posterior. </li><li> Cubrir las gotas en la placa de inyección utilizando aproximadamente 10 ml de aceite mineral. </li><li> Coloque el plato de inyección en la platina del microscopio invertido y llevar el PIPETTES en la gota de inyección. Compruebe que las agujas están en foco dentro de la gota. Ajustar su altura, según sea necesario utilizando los controles micromanipulador. </li><li> El uso de un microdispensador, cargar sobre 20-30 cigotos (17 a 20 horas después de la fecundación (HPF)) en el lado superior de la caída de la inyección. Realizar inyección a temperatura ambiente por lo que el número de embriones en la caída de la inyección se determina por la velocidad a la que la persona puede inyectar ellos. No cargue más embriones que los que se pueden inyectar en 30 min. <ol><li> Para cargar los embriones en el microdispensador, presione el émbolo completamente y sumerja la punta en la solución que contiene los embriones. Tocar los embriones para ser recogidos con la punta del capilar de vidrio (uno a la vez) y liberan lentamente el émbolo para cada embrión entra en el capilar. Repita esto hasta que todos los embriones son recogidos o la capacidad microdispensador está llena. </li><li> Para liberar los embriones cargados, presione el émbolo suavemente hasta que todo el volumen de containing los embriones se libera del capilar. </li></ol></li></ol> 4. La microinyección <ol><li> Usando el objetivo 4X, cargar la solución que se inyecta en la pipeta de inyección mediante la aplicación de presión negativa (aspiración). Cargar solución suficiente para inyectar 2 - 3 cigotos. A continuación, pasar a la caída de la inyección. </li><li> Dentro de la caída de la inyección, mover la pipeta que sostiene que la punta se acerca a un cigoto. Aplicar presión negativa (aspirado) con el microinyector de retención por lo que el cigoto se fija a la pipeta de sujeción y el cambio a un objetivo de 20X. </li><li> Una vez que el cigoto se une a la pipeta de sujeción, comprobar su calidad usando la pipeta de inyección para mover suavemente el embrión alrededor sin separarlo. Un cigoto buena calidad debe tener los dos cuerpos polares (aunque a veces solamente se ve) y un citoplasma homogéneo. No se inyecte cigotos anormales (Figura 3A). </li><li> Si es necesario, vuelva a colocar el embrión para una inyección adecuadaubicación. Un buen posicionamiento sería aquel en el que hay algo de espacio entre la ZP y la PM, por lo que la PM no se dañe por el láser. </li><li> Compruebe que la pipeta de inyección se coloca en plano medio del embrión tocando con suavidad el cigoto en el sitio de la inyección. Si no está en su plano medio, la aguja tenderá a hacer girar el embrión en lugar de la punción. Ajuste la altura de la pipeta de inyección según sea necesario. </li><li> Hacer un agujero en la ZP utilizando un láser (Figura 3B). <ol><li> El uso de software lugar del láser el retículo láser en el ZP donde se hará el agujero (en el lado opuesto a donde el embrión está unido a la pipeta de sujeción). Uso de la ventana de control del láser, haga clic en el botón de disparo. Asegúrese de que el tamaño del agujero es lo suficientemente grande para crear una abertura en la ZP para la aguja de pasar a través sin dañar el PM (Ejemplo: 0,662 mseg de ancho de impulso / 6,9 m Tamaño del agujero). </li></ol></li><li> Pasar la aguja de inyeccióna través del agujero en la ZP y hacer contacto con la PM. Continúe empujando la pipeta hacia adelante hasta que la aguja es ¾ de la forma en el embrión (Figura 3C). </li><li> Observe la posición del menisco en la interfase solución de aceite, ya que esto puede utilizar para controlar constantemente el volumen de inyección. </li><li> Aplicar presión negativa (aspirado) en la pipeta de inyección, lo que resultará en PM y el citoplasma se aspiran en la aguja de inyección. Continuar hasta que el movimiento de citoplasma en la aguja acelera o cuando el contenido de citoplasma mezclar con una solución de inyección puede ser visto. Estos indicarán la rotura de la PM (Figura 3D). </li><li> Inyectar de nuevo el contenido citoplasmático, seguido de la solución en el citoplasma del cigoto mediante la aplicación de presión positiva (inyección), hasta que el menisco en la interfase solución de aceite ha avanzado diámetro equivalente de un cigoto pasado el punto de partida. Nota: Bajo nuestras condiciones, esto representa aproximadamente 7 pl de solución inyectada (Figura 3E). </li><li> Cambio a un objetivo 4X y mover el inyectado embrión / s para el lado inferior de la caída de la inyección. Liberar el embrión mediante la aplicación de presión positiva en el microinyector explotación. Mantener los embriones no inyectados en el lado superior y los inyectados que están en el lado inferior de la gota para ayudar a mantener un registro de los embriones inyectados / no-inyectada y trabajar de manera eficiente. </li></ol> 5. Recuperación de embriones y la inyección Resultados <ol><li> Haga 3 gotas de aproximadamente 200 l en un nuevo plato con pre-calentado SOF-HEPES. Recoger los embriones inyectados usando un microdispensador (como se describe más arriba). Lavar los embriones inyectados moviéndolos a través de la SOF 3-HEPES gotas. </li><li> Contar los embriones lisadas durante la microinyección y desecharlos. Nota: Un cigoto se lisaron puede distinguirse fácilmente de uno intacto desde el primero aparece translúcida, llene toda la ZP, y por lo general tiene citoplasmáticacontenido de fugas hacia el exterior del embrión. </li><li> Opcionalmente, comprobar la eficacia de microinyección usando un microscopio de fluorescencia. Tenga en cuenta que la exposición a la luz UV puede provocar daños de embriones que pueden afectar el desarrollo posterior. </li><li> Grupos de cultivo de 25 embriones inyectados en 50 gotas l de medio de optimización simplex de potasio (KSOM) suplementado con 4 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA) bajo aceite mineral en 38,5 ° C, 5% de CO2 en aire, y humedad de saturación. </li><li> Complementar los medios de cultivo con 5% de SFB dos días después de la inyección. </li><li> Compruebe blastocisto (BL) las tasas de 7 días después de la inyección. Calcular las tasas de BL como el número total de embriones de blastocisto / número total de embriones cultivados en esa gota. </li></ol>

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	<li>McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+composition+of+lipids+in+immature+cattle,+pig+and+sheep+oocytes+with+intact+zona+pellucida.">Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida.</a> J Reprod Fertil. 118 (1), 163-170 (2000).</li><li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs.">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li><li>Ross, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parthenogenetic+activation+of+bovine+oocytes+using+bovine+and+murine+phospholipase+C+zeta.">Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta.</a> BMC Dev Biol. 8 (1), (2008).</li><li>Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jumonji+domain-containing+protein+3+regulates+histone+3+lysine+27+methylation+during+bovine+preimplantation+development.">Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2400-2405 (2012).</li><li>Bogliotti, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4+Developmental+outcomes+and+effiency+of+two+CRISPR/Cas9+microinjection+methods+in+bovine+zygotes.">4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes.</a> Reprod Fertil Dev. 27 (1), 94-94 (2015).</li><li>Bakhtari, A., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DPPA3+prevents+cytosine+hydroxymethylation+of+the+maternal+pronucleus+and+is+required+for+normal+development+in+bovine+embryos.">DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos.</a> Epigenetics. 9 (9), 1271-1279 (2014).</li><li>Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+process+of+polishing+borosilicate+glass+capillaries+used+for+fabrication+of+in-vitro+fertilization+(iVF)+micro-pipettes.">Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes.</a> Biomed Microdevices. 10 (1), 123-128 (2008).</li><li>Sutter Instrument. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pipette Cookbook 2015 P-97 &amp; P-1000 Micropipette Pullers. , (2015).</li><li>Sutter Instrument. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825). , (2014).</li><li>Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of cloning. , (2002).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+reporter+gene+after+microinjection+of+mammalian+artificial+chromosomes+into+pronuclei+of+bovine+zygotes.">Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes.</a> Mol Reprod Dev. 60 (4), 433-438 (2001).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La microinyección de cigotos es un método bien establecido para la introducción de soluciones en embriones de mamíferos. Con algunas variaciones dependientes de la especie y el objetivo del experimento, esta técnica se puede utilizar ampliamente. Mostramos cómo realizar la microinyección intracitoplasmática de usar un láser para ayudar a la entrada de una micropipeta de extremos romos. Los cigotos de algunas especies de ganado (tales como ganado vacuno, ovejas y cerdos) tienen un citoplasma oscuro, dificultando la visualización de la pipeta de inyección una vez dentro del embrión. Además, sus membranas plasmáticas son muy elásticas, por lo que su penetración con una aguja de punta biselada (generalmente se usa para inyectar cigotos de especies de roedores) difícil de lograr. Para superar estas limitaciones, se utilizó un láser para permitir el paso de una aguja de extremo romo a través de la zona pelúcida y la posterior aspiración de contenido citoplásmico para asegurar la rotura de la membrana plasmática y la liberación de la solución en el interior del citoplasma del embrión. Por otra parte, por injecting en el sitio opuesto de la entrada de la aguja (aproximadamente 3/4 en el interior del embrión) nuestro objetivo es desplazar el PN y evitar así su aspiración / inyección. Además, esto proporciona mayor punto de contacto para la membrana rota para sanar, lo que resulta en tasas más bajas de lisis. La producción de buenos micropipetas (especialmente la pipeta de inyección) y apropiadamente colocarlos en el micromanipulador es clave para lograr buenos resultados con esta técnica. La aguja de inyección se puede utilizar durante el tiempo que la solución de inyección se mueve suavemente dentro de la aguja. A veces, el contenido de contenido o incluso pronúcleos citoplásmica se queda atascado en el interior de la punta de la aguja, haciendo que el flujo se ejecute de forma desigual y complicando de inyección (esto también aumenta las tasas de lisis y retrasa el proceso). Cambio de la aguja de inyección cuando esto ocurre es necesario para obtener resultados óptimos con este protocolo. La cantidad de tiempo que los embriones están fuera de la incubadora es crucialpara obtener tasas de supervivencia consistentes y no debe exceder de 30 minutos. Después de la formación y la práctica, los operadores suelen alcanzar una velocidad de inyección de 1-2 embriones inyectados por minuto. Otro punto clave para el éxito de este protocolo es inyectar constantemente la misma cantidad de volumen de solución por embrión. Esto se controla fácilmente y con precisión mediante la observación del desplazamiento de la interfaz de menisco solución de aceite. Es importante que el diámetro de la pipeta es coherente entre manipulaciones y que la punta tiene un diámetro regular y constante. Con 5 pipetas ID M en la punta, un 7 - 10 l de volumen de inyección se consigue inyectando el equivalente a la longitud de un cigoto. El exceso de inyección a menudo resulta en la lisis de embriones. El uso de este protocolo, el 100% de los embriones se inyectan correctamente en el citoplasma, evitando completamente falso perivitelino inyecciones espaciales (Figura 4). Esto maximiza la fiabilidad y reproducibilidad del ensayo se realiza (independientemente de la solución inyectada) ya que los resultados se deben únicamente al efecto de la solución inyectada y no a inconsistencias de inyección. Algunos de los cigotos inyectados generalmente lisar debido a los daños mecánicos durante la inyección. Una tasa habitual de la supervivencia después de la inyección es del 75% 11. Usando este método, somos capaces de conseguir tasas mínimas de embriones lisadas (Figura 5). Además, las tasas de desarrollo de blastocistos fueron comparables a no inyectado (de control) de embriones (Figura 6), que denota que la técnica de inyección no tiene efectos perjudiciales sobre el desarrollo embrionario temprano. La eficiencia de este protocolo fue recientemente en comparación con el protocolo de microinyección citoplasmática convencional (microinyección citoplasmática directa utilizando una aguja de vidrio de punta biselada sin el uso del láser para penetrar de ZP) para la inyección de cigotos bovinos 5. Los resultados mostraron tasas significativamente mayores de embriones lisadas y menores tasas de formación de blastocistos para el cytopl directamicroinyección asmic. Creemos que estas diferencias se deben a un menor daño mecánico durante la penetración de la aguja cuando se utiliza la microinyección citoplasmática asistida por láser, haciendo de este protocolo el preferido para la inyección de las especies de ganado en nuestro laboratorio. A continuación, presentamos los datos para los embriones de bovinos y ovinos obtenidos por fecundación in vitro en ejercicio, sino que también hemos probado usando el protocolo in vivo e in vitro de embriones porcinos obteniendo resultados similares (datos no mostrados). Dependiendo de la solución inyectada, este protocolo se puede utilizar para muchas aplicaciones. Recientemente, hemos utilizado para introducir un sistema de CRISPR / Cas9 que ronda los genes específicos en fecundado in vitro de embriones de bovino y se encontró una alta proporción de blastocistos secuenciados con mutaciones: el 50% de los embriones (n = 6) tenían mutaciones bialélicas , el 33% (n = 4) tenían mutaciones monoallelic, y el 17% (n = 2) fueron de tipo salvaje 5. Este protocolo ha sido muy fiable y se podría utilizar envarias especies y aplicaciones innumerables.

microinyección citoplasmática de embriones de 1 célula es una técnica muy poderosa. Puede ser utilizado para la entrega de cualquier solución en el embrión, por ejemplo, producir genes knock-outs para estudiar la función de genes o de genes para generar animales editado. Cigotos de animales de granja agrícolas más relevantes tienen una composición de ácidos grasos muy alto que hace que su citoplasma opacos y oscuros 1. También tienen una membrana plasmática bastante elásticas (PM). Estas características hacen que la microinyección pronuclear mediante inyección convencional / citoplasmática como se utiliza en especies de roedores difíciles y, a menudo inexactos. Microinyección citoplasmática tiene ventajas sobre la microinyección pronuclear, ya que es más fácil de realizar y también causa menos daño a los embriones inyectados, resultando en una mayor viabilidad 2. El objetivo general de este protocolo es demostrar un método exitoso para la entrega de soluciones en el citoplasma de cigotos de animales de granja. Para ser capaz de realizarmicroinyección citoplásmica con una alta eficiencia en embriones de ganado, se utiliza un láser para generar un agujero en la zona pelúcida (ZP) y luego una aguja de vidrio de extremo romo se utiliza para la microinyección. Esta estrategia tiene como objetivo reducir el daño mecánico impreso en el embrión durante la inyección. Entonces, la aspiración del contenido citoplasmático dentro de la aguja de inyección permite la rotura eficiente y seguro de la PM asegurar que la solución se suministra en el citoplasma del embrión. Esta técnica ya se ha utilizado con éxito en los embriones de bovino para entregar siRNA en el citoplasma cigóticos 3,4 y para generar mutaciones utilizando las repeticiones agrupadas espaciadas regularmente cortos palindrómicas (CRISPR) / sistema CRISPR asociado 9 sistema 5 (Cas9). También es adecuado (con modificaciones menores) para inyectar la especie bovina ovocitos cumulus-cerrado 6. A continuación, describimos nuestro protocolo de inyección entrega de un medio de contraste, que puede ser aplicable a inyectar cualquier dessolución IRED en el zigoto, y muestran que el uso de esta técnica provoca la lisis mínima y no afecta el desarrollo embrionario temprano.

<table><tbody><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Sutter instruments</td><td>B100-75-10</td><td>These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-9</td><td>Equipped with 10X magnification lense.</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Nikon/ Narishige</td><td>NT88-V3</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>TE2000-U</td><td>Equipped with 4X, 20X lenses and with a laser system.</td></tr><tr><td>Laser</td><td>Research Instruments</td><td>7-47-500</td><td>Saturn 5 Active laser.</td></tr><tr><td>Microdispenser</td><td>Drummond</td><td>3-000-105</td><td>The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.</td></tr><tr><td>100 x 15 mm culture dish</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micromanipulator easier. The lid of a 60 mm culture dish can also be used.</td></tr><tr><td>35 mm culture dish</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>These dishes are used for culturing the embryos in 50 &amp;mu;l drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hr prior to transfering the embryos to them.</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td>Any incubator that can be set to 38.5 &amp;deg;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; conditions can be used.</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td>Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10X magnification can be used.</td></tr><tr><td>Control Unit HT</td><td>Minitube</td><td>12055/0400</td><td>Heating system attached to the stereomicroscope.</td></tr><tr><td>Heated Microscope Stage</td><td>Minitube</td><td>12055/0003</td><td>Heating system attached to the stereomicroscope.</td></tr><tr><td>Dextran-Red</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1828</td><td>A sterile 10 mg/ml solution is used to inject.</td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>sigma</td><td>M8410</td><td>Keep the mineral oil at room temperature and&amp;nbsp; protected from light using foil paper.</td></tr><tr><td>KSOMaa Evolve Bovine</td><td>Zenit</td><td>ZEBV-100</td><td>Supplemented with 4 mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hr before use.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-525</td><td>Use a stem-cell qualified FBS.</td></tr><tr><td>Zygotes</td><td></td><td></td><td>Zygotes are injected 17 - 20 hpf and can be &lt;em&gt;in-vitro&lt;/em&gt;- or &lt;em&gt;in-vivo&lt;/em&gt;-derived.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>Final concentration: 107.7 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Final concentration: 7.16 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Final concentration: 1.19 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>Final concentration: 0.49 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Sodium DL-lactate</td><td>Sigma</td><td>L4263</td><td>Final concentration: 5.3 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>Final concentration: 1.71 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>D-(&amp;minus;)-Fructose&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F3510</td><td>Final concentration: 0.5 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Final concentration: 21 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>BME-EAA</td><td>Sigma</td><td>B6766</td><td>Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Final concentration: 4 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P4562</td><td>Final concentration: 0.33 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050</td><td>Final concentration: 1 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-3311</td><td>Final concentration: 1 mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td>G-1397</td><td>Final concentration: 5 &amp;mu;g/ml. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Water for embryo transfer</td><td>Sigma</td><td>W1503</td><td>Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>SOF-HEPES medium</td><td>Made in the lab</td><td></td><td>pH 7.3 - 7.4, 280 &amp;plusmn; 10 mOs. Filter sterilized through a 22 &amp;mu;m filter can be stored in the fridge at 4 &amp;deg;C for 1 month. Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr></tbody></table>

laser-assisted cytoplasmic microinjection in livestock zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

Asistida por láser microinyección citoplásmica es un protocolo potente y fiable para ofrecer soluciones en el citoplasma de cigotos de ganado. La figura 3 muestra un esquema general de los cigotos antes y después de la inyección, así como el esquema general de la técnica. Dextrano-rojo se utiliza como solución de la inyección para permitir sitio de seguimiento de la eficiencia y la precisión de la inyección y la inyección. El éxito de la entrega de la solución se ilustra en la Figura 4 que muestra un embrión recientemente inyectado en el que el tinte se distribuye homogéneamente en el citoplasma. Usando esta técnica 100% de los embriones se inyectan en su citoplasma. Este protocolo ha demostrado tener tasas de lisis mínimos en zigotos bovinos y ovinos. Sólo 15,6 ± 5 y 5,8 ± 3,9% de los embriones inyectados fueron lisadas en ganado vacuno y ovino, respectivamente, como resultado de la microinyección <strong&gt; (Figura 5). También, como se muestra en la Figura 6, hay diferencias estadísticamente significativas en las tasas de desarrollo de blastocistos en el control frente a los grupos inyectados tanto para bovino (control 32,8 ± 6,6%, 31,4 ± 5,9% inyectada) y embriones ovinos (de control 40,3 ± 7,8, 30,3 ± 6,0% inyectada). Estos resultados indican que la inyección intracitoplasmática asistida por láser causa daños mínimos durante la inyección y los resultados de las tasas de desarrollo de blastocistos normales. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54465/54465fig1.jpg" /> Figura 1: un esquema general que muestran cómo hacer la explotación y pipetas de inyección. AB) de la pipeta de inyección, CE) Sosteniendo la pipeta. A) toca suavemente el filamento con la pipeta tirado en el diámetro deseado (5 micras). Activar el calentador brevemente (demostrada en O<html> distancia). Esto derretirá ligeramente la pipeta por lo que se adhiere al filamento y tras el enfriamiento, la pipeta se romperá en el punto de contacto la generación de un corte recto. B) Hacer y el ángulo en la pipeta de aproximadamente 0,5 cm de distancia de su punta por el posicionamiento de la pipeta sobre 10 m de distancia del filamento calentador. Calentar hasta que se alcanza el ángulo deseado. C) Utilizar una pluma de punta de diamante para marcar y cortar la pipeta de sujeción en el diámetro deseado (180 micras). D) en posición vertical, extinción de esmalte de la punta de la pipeta de sujeción hasta que se alcanza el diámetro deseado interna (40 micras). e) forman un ángulo de la pipeta con lo que la pipeta nuevo a una posición horizontal un par m de distancia del filamento y aproximadamente 0,5 cm de distancia de la punta. Activar el calentador para doblar la pipeta sobre el filamento. Continuar calentando hasta que se consigue el ángulo deseado. Ver 8,9,10 para obtener más detalles sobre cómo hacer que las agujas.= &quot;Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54465/54465fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54465/54465fig2.jpg" /> Figura 2:.. Configuración general del Plato inyección Disposición de las pipetas, gotas, y los embriones se muestran en este dibujo <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54465/54465fig2large.jpg" target="_blank">favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54465/54465fig3.jpg" /> Figura 3:. Intracitoplasmática de protocolo de inyección asistida por láser A) Un diagrama general de un cigoto unido a la pipeta de sujeción antes de la inyección. PB: cuerpos polares, ZP: zona pelúcida, Cit: citoplasma, PN: pronúcleos, PM: Membranas de plasmae, HP: sosteniendo la pipeta, IP:. pipeta de inyección BE) pasos de microinyección: b) realizar un orificio en la zona pelúcida de un cigoto unido a la pipeta de sujeción usando un láser C) Introducir la pipeta de inyección hacia el lado opuesto del embrión. . Posición del menisco (a). D Verificar) Romper la membrana plasmática mediante la aspiración de contenido citoplasmática dentro de la pipeta de inyección. E) Inyectar de nuevo contenido citoplásmico y la solución en el citoplasma cigóticos, hasta que el menisco alcanza un diámetro de cigoto (b) más allá del punto de partida . Distancia ab representa ~ 7 pl de solución inyectada. F) Un diagrama general de un cigoto después de la inyección. Tenga en cuenta que la solución inyectada se extiende de forma homogénea en el citoplasma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54465/54465fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 4:.. Figura Representante de un cigoto inyectado con dextrano-roja A) Imagen de campo brillante del cigoto inyectada B) Imagen fluorescente del cigoto inyectada <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54465/54465fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54465/54465fig5.jpg" /> Figura 5:. Proporción de lisaron embriones después de la microinyección de cigotos en dos diferentes especies de datos representa 4 repeticiones para los embriones de bovinos (un total de 103 cigotos inyectados) y 3 repeticiones para los embriones ovinos (total de 173 cigotos inyectados). Las barras de error representan sem <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54465/54465fig5large.jpg" target="_blank">favor, haga clic aquí para ver</a>una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54465/54465fig6.jpg" /> Figura 6:. Blastocito Tarifas en embriones bovinos y ovinos de datos representa 4 repeticiones para la especie bovina con un total de 102 y 156 embriones inyectados de control y 3 repeticiones para la especie ovina, con un total de 163 y 239 embriones inyectados de control. Las barras de error representan sem <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54465/54465fig6large.jpg" target="_blank">favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Asistida por láser citoplasmática microinyección en el ganado cigotos

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

laser-assisted-cytoplasmic-microinjection-in-livestock-zygotes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

8.9K vistas.  University of California, Davis. This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Video: Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

Imágenes en vivo de inmune innata y preneoplásicas Interacciones de celda que utilizan un sistema de expresión / UAS Inducible Gal4 en larvas de pez cebra de la piel

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Entrega de ácidos nucleicos mediante microinyección de embriones en el Mundial de la Agricultura de plagas de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Genética

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biología

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Dispositivos microestructurados para microinyección optimizado y la proyección de imagen de larvas de pez cebra

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Microinyección de cigoto para la creación de alelos de genes de casete knock-in y flox en ratones

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microinyecciones de Sea Urchin cigotos

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the host chromosome and is passed on to progeny. Thus, they are ideal vectors for creation of stable cell lines, in vivo delivery of indicators, and transduction of single cell fertilized eggs to create transgenic animals. However, mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against lentiviral gene delivery. Lentiviruses are too large to penetrate the zona and are typically delivered by microinjection of viral particles into the perivitelline cavity, the space between the zona and the embryonic cells. The requirement for highly skilled technologists and specialized equipment has minimized the use of lentiviruses for gene delivery to mouse embryos. This article describes a protocol for permeabilizing the mouse fertilized eggs by perforating the zona with a laser. Laser-perforation does not result in any damage to embryos and allows lentiviruses to gain access to embryonic cells for gene delivery. Transduced embryos can develop into blastocyst in vitro, and if implanted in pseudopregnant mice, develop into transgenic pups. The laser used in this protocol is effective and easy to use. Genes delivered by lentiviruses stably incorporate into mouse embryonic cells and are germline transmittable. This is an alternative method for creation of transgenic mice that requires no micromanipulation and microinjection of fertilized eggs.

Mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against gene delivery. This article describes a protocol for perforating the zona with a laser to transduce embryonic cells with lentiviral vectors and to create transgenic mice.

Entrega de Gene lentivirales asistida por láser ratón huevos fertilizados

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

Zebrafish Microinjection Techniques

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage embryos. Using this technique, solutions containing genetic material or knockdown constructs are delivered into the blastomeres: the embryonic cells sitting atop the yolk of the newly fertilized egg. Delivery into the cytoplasm is achieved either through direct injection into the blastomere, or via natural cytoplasmic movements that occur after a solution is injected into the yolk. Successful genetic manipulations are usually followed by quantification of embryonic phenotypes in order to elucidate the genetic mechanisms of development.
This video will provide an introduction to carrying out microinjections in zebrafish embryos. The discussion begins with a review of the essential tools for the technique, including the injection apparatus and the microinjector, which controls fluid movement with pressure pulses of air. Next, important preparatory steps are demonstrated, such as the pouring of agar plates to stabilize embryos during injection and calibration of the microinjection apparatus. The injection procedure is then presented along with tips on when and where injections should be performed. Finally, applications of the microinjection technique are discussed, including gene overexpression via mRNA injection, gene silencing by delivery of antisense morpholino oligonucleotides, and the generation of transgenic zebrafish using specially engineered plasmid DNA.

Introduction to Microinjection of Early Zebrafish Embryos

Técnicas de microinyección en el pez cebra

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage ...

Educación

JoVE Science Education

Biología básica

Biología II: Ratón, Pez cebra y Polluelo

Laser-Assisted Lentiviral Gene Delivery: A Technique to Permeabilize Mouse Fertilized Eggs to Facilitate Lentiviral Gene Delivery

Source: Martin, N. P., et al. <a href="https://www.jove.com/v/58327">Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs.</a> J. Vis. Exp. (2018).
In this video, we demonstrate the laser-assisted permeation of the protective layer of zona pellucida in mouse fertilized eggs for facilitating lentiviral gene delivery. Lentivirus enables the generation of transgenic animals with a gene of interest stably integrated into their genome.

Administración de genes lentivirales asistida por láser: una técnica para permeabilizar óvulos fertilizados de ratón para facilitar la entrega de genes lentivirales

Source: Martin, N. P., et al. Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs. J. Vis. Exp. (2018).
In this video, we demonstrate the ...