Esta técnica sirve como método fundamental para experimentos diseñados para ensayar el desarrollo embrionario o larvario del grillo. La principal ventaja de esta técnica es que es flexible y soportará varios tipos de enfoques experimentales, como los que utilizan interferencia de ARN o manipulación genómica. Demostrando el procedimiento estará Hadley Wilson Horch, la investigadora principal en el laboratorio.
Para comenzar este procedimiento humedezca el plano de la trituradora giratoria del biselador con agua goteando. Coloque la aguja tirada en el biselador y gírela a un ángulo de 20 grados. Baje la aguja hasta que toque la placa de molienda y bisele durante dos o tres minutos.
Evalúe el bisel colocando la aguja biselada en cinta de doble palo que se ha adherido a un portaobjetos de vidrio. Coloque la diapositiva en el escenario de un microscopio compuesto equipado con una cámara y un software de adquisición de imágenes. Adquirir una imagen de la aguja utilizando un objetivo 20x.
Utilice el software de imágenes para medir el diámetro del lumen interior de la aguja sólo proximal a la abertura biselada. Deseche las agujas con una abertura inferior a ocho micrómetros o más de 12 micrómetros. Primero, haz 40 mililitros de 1% de ágarosa en agua y vierta en un plato de Petri de 10 centímetros.
Coloque un sello de huevo en la superficie de la agarosa antes de que se solidifique. Una vez que la agarosa se solidifice, retire el sello para revelar los pozos. A continuación, llene la placa del pozo de agarosa con HBS que contiene 1%estreptomicina de penicilina.
Coloque la tapa en el plato, envuélvalo en Parafilm y guárdelo a cuatro grados centígrados. Después de esto, llene un plato de Petri de 35 milímetros con arena blanca del patio de recreo para hacer un plato de recolección de huevos para que los grillos pongan huevos. Cubra el plato de huevo con una toalla de papel cortada en cuadrados de aproximadamente 18 por 18 centímetros.
Llene con agua del grifo a través de la toalla de papel. A continuación, incline el plato de Petri y apriete suavemente la parte superior para eliminar el exceso de agua. Coloque las esquinas de la toalla de papel cuadrada debajo del plato y coloque el plato de huevo en una tapa invertida que ayudará a mantener la toalla de papel en su lugar.
Coloque el plato de huevo en el recipiente de cricket y deje que las hembras adultas oviposite los huevos durante una o dos horas. Mientras tanto, deje que el plato de agarosa se caliente a temperatura ambiente en preparación para la celebración de los huevos para inyección. Cuando esté listo, retire el plato de recolección de huevos, que ahora contiene huevos recién puestos, de la papelera de cricket.
Retire la toalla de papel y coloque un colador con un tamaño de poro entre 0,5 y un milímetros sobre un vaso de precipitados. Enjuague el contenido del plato de puesta de huevos en el colador bajo el agua del grifo que corre suavemente. Los granos de arena caerán a través de la malla coladora en el vaso de precipitados de abajo, mientras que los huevos de cricket permanecen en la cesta de colador.
Llene un recipiente con agua de ósmosis inversa y colóquelo en una bandeja. Invierta el colador sobre el recipiente y tócalo contra el plato para desalojar los huevos en el agua. Los huevos se hundirán en el fondo del recipiente.
A continuación, utilice tijeras para cortar la punta de una punta de pipeta P1000 para hacer una abertura de aproximadamente tres milímetros de diámetro. Coloque este consejo en un pipeteador P1000 y úselo para transferir los huevos del recipiente al plato de moldes de huevo de agarosa. Usando pinzas de plástico, alinee los huevos en los pozos de agarosa.
Cada huevo se hundirá en el fondo de un pozo individual. Cubra el plato de Petri con una tapa hasta que esté listo para inyectar. Para comenzar, coloque el plato de huevos bajo el microscopio de disección y seleccione un aumento bajo de alrededor de 10x.
Extraiga 1,5 microlitros de solución inyectable utilizando puntas de carga de 20 microlitros y una pipeta P10 e inserte la punta de carga en el extremo ancho de la aguja de inyección. Expulse la solución inyectable a la aguja de inyección. Inserte la aguja en la carcasa de inyección y apriete, asegurándose de que la aguja esté correctamente insertada y firmemente en la carcasa.
A continuación, inserte cuidadosamente la carcasa de inyección en el micromanipulador, teniendo cuidado de no romperse o lesionarse por la aguja. Mientras mira los huevos y la aguja a través del microscopio, mueva la aguja cerca de la X en la esquina superior izquierda de la rejilla del plato. Baje la aguja hasta que la punta entre en la solución tamponada de estreptomicina de HBS más estrecilina en la bandeja.
Centrar la aguja en el campo de visión y mover el plato de huevo para que la aguja esté unos milímetros más cerca del borde del plato que los huevos. Después de esto, ajuste el microscopio al filtro apropiado para Que Rhodamine observe la fluorescencia en la aguja y concéntrese en su punta. En el microinyector gire lentamente la perilla de la balanza en el sentido de las agujas del reloj hasta que la solución de inyección comience a salir de la aguja a la solución de suspensión.
A continuación, gire la perilla hacia atrás ligeramente hasta que el tinte deje de salir de la aguja. Con la aguja todavía centrada en el campo de visión, mueva el plato de huevo para que la aguja esté dirigida al huevo que se va a inyectar primero. Ajuste el aumento a aproximadamente 50x para que un solo huevo llene la mayor parte del campo de visión.
Utilice tanto el micromanipulador como la mano en la bandeja de huevo para mover la aguja a su posición para la inyección. Utilice el micromaniprógrafo para avanzar la aguja e inserte la punta en el primer óvulo que se va a inyectar, asegurándose de insertar la aguja en 20 a 30% de la longitud del huevo desde el extremo posterior del huevo perpendicular al eje largo del huevo. Inyecte la solución con el pedal de inyección o con el botón de inyección del microinyector.
Un pequeño bolo de material fluorescente dentro del huevo indicará una inyección exitosa. Después de esto, retraiga la aguja del huevo. Si el huevo se levanta involuntariamente de su pozo al retracción de la aguja, utilice pequeños fórceps para empujar el huevo de nuevo en el pozo mientras retrae la aguja.
En este estudio, los huevos de cricket se inyectan utilizando una técnica que sirve como un método fundamental en muchos experimentos, incluyendo pero no limitado a, interferencia de ARN y manipulación genómica. La tasa de supervivencia es un parámetro importante para evaluar el éxito de este experimento. La mayoría de los óvulos muertos se pueden identificar fácilmente por la vista, ya que la yema y el tejido embrionario dentro del óvulo comienzan a aglucuarse de manera desigual, y con el tiempo la mayor parte de la yema migrará a un lado del óvulo.
Cuando se evalúa después de cuatro a seis días, más del 85% de los óvulos no inyectados sobrevivieron, mientras que los óvulos inyectados con reactivos experimentales generalmente tenían una tasa de supervivencia más baja. Se requiere el control de todos los aspectos de la inyección en sí, incluida la punción de la aguja, la introducción de tinte y tampón, o la presencia de ARN de vehículo o de doble cadena, para comprender los verdaderos efectos de la manipulación experimental intentada. La forma en que se evalúan los resultados fenotípicos de la inyección depende de lo que se inyectó.
Por ejemplo, los cambios fenotípicos como resultado de derribos específicos de ARNm pueden ser obvios a nivel de anatomía bruta. Si por otro lado se inserta un ADNC que codifica un gen de histona 2B etiquetado por EGFP bajo el control de un promotor de G.bimaculatus actin en el genoma del grillo utilizando transposasa de piggyback, se hace posible visualizar cada núcleo en el óvulo utilizando fluorescencia para excitar la proteína EGFP tagged hist 2B. Ajustar la balanza para que las agujas no se obstruyan es un paso crítico en este procedimiento.
Es posible que deba realizar varios ajustes después de las inyecciones posteriores, ya que la yema a veces obstruye la punta de la aguja. El grillo es un insecto hemimetabolous que se ramifica basalmente a insectos holometabolos bien estudiados como Drosophila. Estudiar el desarrollo del cricket nos ayudará a entender más sobre la evolución y el desarrollo en todo el reino animal.
Esta técnica requiere un poco de práctica. Recomendamos practicar inyecciones de control hasta que la tasa de supervivencia cuatro o cinco días después de la inyección sea al menos del 80%
