Name: visualizing the early stages of phagocytosis
Uploaded: 2017-02-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
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Wir danken Wendy Lachs und Nicki Watson von der Keck-Anlage am Whitehead Institute des MIT für die Bildgebung.

1. Herstellung von DC2.4 und RAW 264.7-Zelllinien HINWEIS: Die Makrophagen-Zelllinie RAW 264.7 und die dendritische Zelllinie DC2.4 sind sowohl murinen Ursprungs, und die folgenden Bedingungen wurden verwendet, um die Zellen zu wachsen. <ol><li> Wachsen RAW 264.7 - Zellen in DMEM (Dulbeccos Minimal Eagle-Medium) , ergänzt mit 10% inaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. </li><li> Wachsen DC2.4 Zellen unter ähnlichen Bedingungen mit der RAW 264.7-Zellen, mit der Ausnahme Gebrauch RPMI (Roswell Park Memorial Institute) Medium, das mit L-Glutamin anstelle von DMEM. </li></ol> 2. Herstellung von Fluorescent Konjugierte Partikel: C. albicans, Zymosan, IgG-beschichtete Beads <ol><li> Wachsende Candida albicans <ol><li> Impfen SC5314 C. albicans Stamm aus einem gefrorenen Glycerolstammlösung in 25 ml YPD mit Uri ergänzt (2% Bacto-Pepton, 1%Hefeextrakt, 2% Glucose und 80 ug / ml Uridin) über Nacht bei 30 ° C. HINWEIS: Vermeiden Sie die Candida - Kultur wachsen mehr als einer OD 600 von 12. </li><li> Nehmen Sie 1 ml der C. albicans und Spin es bei 2.000 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur nach unten. </li><li> Aspirieren den Überstand und resuspendiere das Pellet mit 1 ml PBS. </li><li> Sammle das Pellet durch Zentrifugation bei 2.000 xg für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.1.4. </li><li> Berechne die Multiplizität der Infektion (MOI) von C. albicans in Bezug auf die Anzahl von Phagozyten und fahren mit der Phagocytose - Assay , wie in Kapitel 3 beschrieben eine OD 600 von 1 bis 2,5 x 10 7 Candida albicans pro 1 ml entspricht. HINWEIS: Die Erzeugung von Candida-BFP in Bezug 13 beschrieben. </li></ol></li><li> Herstellung von Zymosan und IgG beschichteten Beads HINWEIS: Zymosan ist ein β-Glucan enthaltendePilz-Kohlenhydrat - Partikelpräparat , das aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet. Zymosan ist bekannt Entzündungssignale in Makrophagen und dendritischen Zellen hervorzurufen, und es wurde 13 extensiv in Phagozytose Studien verwendet wurden, 14, 15. <ol><li> Kurz das Rohr Wirbel, der die Partikel enthält, und eine Menge für ein Experiment in ein 1,5-ml-Röhrchen ausreichend aliquotieren. HINWEIS: In der Regel verwenden wir im Verhältnis 1:10 (für eine Zelle, mit 10 zymosan Partikel oder IgG-beschichtete Beads). </li><li> 1 ml eiskaltem PBS, und sammelt die Partikel durch bei 10.000 x g für 1 min zentrifugiert. </li><li> Den Überstand aspirieren und das Pellet in 1 ml eiskaltem PBS. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2-2.2.3 HINWEIS: Gehen Sie 2.2.5 zu Schritt oder lagern Sie das Röhrchen bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Beschallen die Partikel für 10 Sekunden in Ultraschall-Ultraschallbad (120 V, 50-60 kHz), um eine zu vermeidenny Partikelaggregation. </li></ol></li></ol> 3. Phagozytose HINWEIS: Die Phagozytose ist ein komplexer Prozess, der mit der Bindung der Partikel auf der Zelloberfläche der Phagozyten durch Wechselwirkung von PRRs mit Liganden auf der Oberfläche des Partikels beginnt. Bindung wird durch die Montage von Aktin und seine zugehörigen Proteine ​​an der Stelle des Kontakts und die Bildung eines phagozytischen cup gefolgt. Die anschließende Aktin Demontage erfolgt auf phagosome und führt zur vollständigen engulfment des partikulären. Im Folgenden die verschiedenen Phasen der Phagozytose zu beschreiben. <ol><li> Bindungsassay HINWEIS: Der Zweck dieses Experiments ist es, die erste Stufe der Phagozytose zu überwachen, die die Wechselwirkung zwischen den Liganden auf den Zielpartikeln und den Rezeptoren auf den Phagozyten beinhaltet. <ol><li> Samen etwa 5 x 10 4 Zellen in einer Kammer gleiten , so dass sie 60-70% konfluent zu der Zeit des Experiments sind. Alterntiv, Platten Zellen auf Deckgläser (in 24- oder 12-Well-Format) oder Glasboden-96-Well-Platten. Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. HINWEIS: Die Zellen können unter Verwendung von Hämozytometer oder eine ähnliche Technik gezählt werden. </li><li> Legen Sie die Kammer Schieber (oder Platte) bei 10 ° C für 10 min. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Medium aus jedem Well einer Pipette oder Absauger verwenden. ACHTUNG: Führen Sie diesen Schritt sorgfältig wie jede Vertiefung von einem Kammerschalennautilus Abdeckglas System ist klein; es ist leicht, Zellen mit der Spitze einer Pipette oder einer starken Luftstrom von einem Absauggerät zu stören. </li><li> Mischen Sie die fluoreszenzmarkierte Partikel mit einem Zellkulturmedium (hergestellt wie oben beschrieben). Hinzufügen Candida -BFP (bei einer MOI von 10), fluoreszenz konjugiert-Zymosan oder Latexkügelchen-Kaninchen - IgG-FITC (10 Partikel pro Zelle) auf die Zellen. Verwenden, um ein Endvolumen von 200 &amp; mgr; l Medium für eine Kammer auch alle Zellen, um sicherzustellen, abgedeckt sind. </li><li> Spin down die Kammer Schieber bei 277xg für 3 min bei 10 ° C. Hinweis: dieser Zentrifugationsschritt hilft, den Kontakt zwischen den Teilchen und den Zellen zu erhöhen, und es synchronisiert den Bindevorgang. </li><li> Sofort übertragen die Kammer Folie zu einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für 5 min. </li><li> Entfernen Sie die Kammer Schlitten aus dem Inkubator und die Medien ansaugen. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit eiskaltem PBS 3x. HINWEIS: Überprüfen Sie das Vorhandensein von nicht gebundenen Partikel mit einem Lichtmikroskop und mehrmals mit PBS waschen, wenn nötig. Es ist wesentlich, ungebundene Partikel aus dem Bohrloch zu entfernen, Hintergrundrauschen während der Analyse zu minimieren. </li><li> Fix-Zellen durch Zugabe von 500 ul 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS verdünnt, für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. VORSICHT: Dieser Schritt erfordert die Verwendung von 4% PFA, die hoch toxisch, korrosiv ist und potentiell karzinogen. Die richtige Vorsicht ist geboten, wenn diese Flüssigkeit verwendet wird. Außerdem schützen Proben aus Licht. </li><li&gt; Die Zellen waschen von 500 ul PBS in die Kammer das Hinzufügen und die Lösung vorsichtig absaugen. </li><li> Zweimal wiederholen 3.1.9 Schritt. HINWEIS: Bei diesem Schritt füllen jedes Fläschchen unmittelbar nach dem vorherigen PBS zu entfernen. </li><li> Stoppen Sie die Fixierung von 10 min mit 500 &amp; mgr; l von 50 mM NH 4 Cl in PBS inkubiert. </li><li> Wasche die Zellen zweimal mit PBS wie in Schritt 3.1.10 beschrieben. </li><li> Permeabilisieren Zellen durch Zugabe von 250 &amp; mgr; l Bindungspuffer (0,1% Saponin, 0,2% BSA in PBS) für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Stain F-Aktin durch fluoreszenz konjugiertes Phalloidin Zugabe von (1: 500 verdünnt in Bindungspuffer). Inkubiere Zellen für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Wasche die Zellen dreimal mit PBS wie in Schritt 3.1.10 beschrieben. </li><li> Zum Aufzeichnen von Bildern mit einem konfokalen Mikroskop (63X Ziel, und 402 nm und 488 nm Laser) unter Verwendung von und zu analysieren , Bilder mit ImageJ 16. HINWEIS: Eine erfolgreiche Partikelbindung durch das Vorhandensein einer Phagozyten cu gekennzeichnet istp an der Stelle , wo das partikuläre Kontakt die phagozytische Zelle (Abbildung 1). Siehe Schritt 3.2.5. </li></ol></li><li> Phagozytose Uptake Assay Hinweis: Dieses Experiment wurde entwickelt , die vollständige Internalisierung von fluoreszent markierten Partikel durch Phagozyten Mikroskopie mittels konfokaler zu überwachen (Abbildung 2). <ol><li> Samen etwa 5 x 10 4 Zellen in einer Kammer gleiten , so dass sie 60-70% konfluent zu der Zeit des Experiments sind. Alternativ Platte Zellen auf Deckgläser (in 24- oder 12-Well-Format) oder Glasboden-96-Well-Platten. Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. HINWEIS: Die Zellen können unter Verwendung von Hämozytometer oder eine ähnliche Technik gezählt werden. </li><li> Halten Sie die Kammer gleitet (oder Platte) bei 10 ° C für 10 min. HINWEIS: Die Kühlung ist erforderlich, um Endozytose sowie unerwünschte Phagozytose zu blockieren, und anschließend einen synchronisierten Phagozytose haben. </li><li> PerfORM Schritte von 3.1.3 bis 3.1.5 </li><li> Übertragen , um die Kammer auf einen Objektträger 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2, und inkubiere für verschiedene Zeitpunkte. Fix-Zellen nach 30, 60 und 90 Minuten nach der Infektion. Beobachten Sie C. albicans beginnen Hyphen bei 60 min nach der Infektion zu bilden; Phagozyten beginnen nach 90 min 8 Zelltod (pyroptosis) zu zeigen. ANMERKUNG: Dies ist eine Empfehlung und Optimierung ist wesentlich abhängig von dem Zelltyp und dem partikulären verwendet. </li><li> Führen Sie die Schritte von 3.1.7 bis 3.1.15. Analysieren von Bildern mit ImageJ 16. HINWEIS: eine erfolgreiche Aufnahme durch eine vollständige Internalisierung eines partikulären innerhalb des Zytoplasmas einer Phagozyten (Abbildung 2) gekennzeichnet ist. Die Färbung der Phagozyten mit Zelloberflächenmarker wie phalloidin hilft, die Form von Zellen zu beschreiben. Es ist auch wichtig, z-Stacks, um zu bestimmen, ob die teilchenförmige ist gebunden an der Zelloberfläche oder kompl auszuführenetely verinnerlicht. </li></ol></li><li> Live - Imaging von Phagozytose HINWEIS: In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung von Konfokalmikroskopie die verschiedenen Stadien der Phagozytose mittels fluoreszenz konjugiert Zymosan zu erfassen. Wir verwenden die dendritischen Zelllinie DC2.4 , die stabil exprimiert mCherry-markierten F-Actin - 8, einen Biosensor, der die Verteilung von fadenförmigen Aktin in lebenden Zellen zeigt. Da Phagozytose ein Aktin-gesteuerter Prozess ist ermöglicht die Live - Bildgebung in dieser Zelle nicht nur uns , die Bewegung und Dynamik von F-Actin - Netzwerk zu erfassen, sondern auch die verschiedenen phagozytischen Ereignisse innerhalb der lebenden Zellen (Abbildung 3, Film 1) zu visualisieren. <ol><li> Samen etwa 5 x 10 4 Zellen in einer Kammer Schieber in einer Konzentration , so dass sie 60-70% konfluent zu der Zeit des Experiments sind. Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. HINWEIS: Die Zellen können mit Hämozytometer oder ein gezählt werdenähnliche Technik. </li><li> Halten Sie die Kammer gleitet auf Eis für 10 min. HINWEIS: Die Kühlung ist erforderlich, um unerwünschte Aufnahme zu blockieren, und ein synchronisiertes Phagozytose haben. </li><li> Führen Sie die Schritte von 3.1.3 bis 3.1.5 </li><li> Pre-warm das Mikroskoptisch bis 37 ° C und die Kammer mit 5% CO 2 ins Gleichgewicht. Warten 30-45 min für die Temperatur und das CO 2 zu stabilisieren , bevor die Abbildungs beginnen. Hinweis: Da der CO 2 und Temperaturniveaus für die Phagozytose kritisch sind, ist es wichtig , auf dem Mikroskop Erhitzer dem Experiment vor , um den Umgebungsraum äquilibrieren. </li><li> Legen Sie die Kammer schieben Sie die Zellen im Mikroskop - Inkubator - Gehäuse ins Gleichgewicht gebracht bei 37 ° C und 5% CO 2 enthält. </li><li> Führen Sie die Live - Darstellung 17, 18. HINWEIS: Die Einstellungen für die Laserleistung (Verstärkung, pinhole, etc.) kann in Abhängigkeit von der Art der th variierene Mikroskop und Fluoreszenzsonde verwendet. Daher empfehlen wir die Beratung in der Bedienungsanleitung des Mikroskops für eine optimale Voraussetzung für Ihre Live - Bildgebung 17,18. <ol><li> Verwenden der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (und die dazugehörige Software) für die Live-Darstellung. Verwenden Sie 63X 1.4NA Öl-Objektiv mit einer Loch von 1-1,1 Airy-Einheiten. </li><li> Um die Bildgebung zu starten, verwendet, um das Hellfeld einen repräsentativen Bereich auf der Kammer Folie zu finden. Als nächstes wählen Sie das Feld, indem Sie auf die Software, um die Option für die Position klicken. Zum Nachweis von GFP in Spur 1 der Filtersatz bei 582 nm für 488-nm-Laser mit einem Strahlteiler verwendet, zu erfassen, Wellenlängen zwischen 488 und 582 nm. </li><li> In Track 2 wählen einen Filter optimal für mCherry (RFP) einen Strahlteiler bei 578 nm und Wellenlängen zwischen 578 und 600 nm zu erkennen. Verwenden 488 nm und 578 nm-Laser mit 50% Laserleistung und einem Verstärkungsleistung von 600-700. Erhalten Sie Bilder alle 30 Sekunden für insgesamt 90 min. </li></ol></li></ol></li></ol>

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The authors declare no conflicts of interest.

Professionelle Phagozyten, wie Makrophagen und dendritischen Zellen, verschlingen und zu beseitigen Krankheitserreger daher macht Phagozytose ein wichtiger Bestandteil des Abwehrsystems eindringen. Während dieses Prozesses durchlaufen Phagozyten umfangreiche Membran Reorganisation und Zytoskelett Umlagerung an ihrer Zelloberfläche 8, 19, 20. Um diesem dynamischen Prozess zu verstehen, die Visualisierung der verschiedenen Phas...

Trotz der kontinuierlichen Exposition gegenüber Krankheitserregern wie Bakterien, Viren und Pilze, ist unser Körper gut mit Immun-Mechanismus ausgestattet, der Schutz gegen eine Infektion bieten. Das angeborene Immunsystem ist die erste Verteidigungslinie gegen eindringende Krankheitserreger und stützt sich hauptsächlich auf Phagozyten, die erkennen und ausländische Ziele verinnerlichen. Phagozytose ist ein evolutionär konserviert zellulären Prozess, der die Phagozytose von unerwünschten Partikeln größer als 0,5 &amp; mgr; m umfasst. Phagozytische Zellen exprimieren eine Vielzahl von Immunrezeptoren auf der Zelloberfläche (auch als pattern recognition receptors, PRR bekannt) , die es ihnen ermöglichen , 3 pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) , die auf Krankheitserreger vor engulfment zu erkennen. Pathogen-Bindung wird durch Rezeptor clustering an der Zelloberfläche folgt und löst die Bildung einer phagozytischen Tasse. Dies führt zu einer Membran Remodeling Aktin-angetrieben, ragt runddas Ziel ist , umhüllen sie schließlich und Abklemmen eines diskreten phagosomalen Vakuole 2, 5 zu bilden. Die phagosome reift dann und säuert durch anschließende Fusion mit späten Endosomen und Lysosomen , die Phagolysosom 6 bildet. Obwohl die Phagozytose als rezeptorvermittelte und Aktin-driven Ereignis beschrieben wird, stützt sich dieses Verfahren auch auf räumlich-zeitlichen Modifikation von Lipiden, die die Plasmamembran, wie Phosphoinositiden (PIs) und Sphingolipide 7, 8 zusammenzusetzen . Während Aktin - Polymerisation durch eine lokale Ansammlung von Phosphoinositol-4,5-bisphosphat (PI (4,5) P 2) an der Basis des phagozytischen cup diktiert wird, hängt Aktin Depolymerisation auf der Umwandlung von (PI (4,5) P 2 bis Phosphoinosit-3,4,5-bisphosphat (PI (3,4,5) P 3) 3, 9. Beide Änderungensind wichtig , da Ersteres führt zu einer erfolgreichen Verlängerung der Pseudopodien um das Ziel und die letztere ermöglicht 10 von Teilchen in das Cytosol der Phagozyten sinkt. Die Zellen, die die Fähigkeit zu phagozytieren haben , sind entweder professionelle Phagozyten, wie Makrophagen / Monozyten, Granulozyten / Neutrophilen und dendritischen Zellen (DCs) oder nicht - professionellen Phagozyten, wie Fibroblasten und Epithelzellen 11. Die Phagozytose von allen Phagozyten ausgeführt spielt eine zentrale Rolle bei der Gewebe Wartung und Umbau, während der Phagozytose von professionellen Phagozyten durchgeführt, um die Koordination der angeborenen und adaptiven Immunantwort gegen Krankheitserreger verantwortlich ist. Professionelle Phagozyten nicht nur überfluten und den Erreger zu töten, sondern auch Antigene zu den lymphatischen Zellen des adaptiven Immunsystems. Dies trägt zur Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen und den Eingriff von lymphoiden Zellen, daher führt zudie erfolgreiche Blockade der Infektion 12. Herkömmliche biochemische Techniken haben dazu beigetragen, Wissen zu gewinnen über die molekularen Mechanismen der verschiedenen zellulären Prozessen während der Phagozytose, wie post-translationale Modifikationen und verschiedene hochaffinen Assoziation zwischen Proteinen. mit den üblichen biochemischen Methoden ist es jedoch schwierig, Informationen über die räumlichen und zeitlichen Dynamik der phagozytischen Ereignisse zu erhalten. Live-Cell-Imaging ermöglicht uns nicht nur zelluläre Ereignisse in einer Zeit, sensible Art und Weise zu überwachen, sondern auch ermöglicht es uns, Informationen auf Einzelzellebene zu gewinnen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um die verschiedenen Stadien der Phagozytose zu untersuchen, sowie den gesamten Prozess zu analysieren raumzeitlich konfokalen Mikroskopie.

<table><tbody><tr><td>&amp;beta;-Mercaptoethanol</td><td>AppliChem</td><td>A1108</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Cell Signaling Technology&amp;nbsp;</td><td>9998</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)</td><td>ThermoFisher</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP-231-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&amp;rsquo;s Minimal Eagle&amp;rsquo;s medium)</td><td>Gibco</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline)</td><td>Corning cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>FITC-coupled IgG-coated latex beads</td><td>Cayman</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Solution (4% in PBS)</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-penicillin-streptomycin-10-000-u-ml-3/15140122&quot;&gt;15-140-122&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 cells</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (Roswell Park Memorial Institute)</td><td>Gibco</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS)</td><td>Corning cellgro</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (1x) (0.05%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>&amp;nbsp;85114</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan-Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>Z23374</td><td></td></tr><tr><td>Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers)</td><td>ThermoFisher</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Glasstic slide 10 with grids</td><td>Hycor</td><td>87144</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing the early stages of phagocytosis

Der Säugetierkörper ist mit verschiedenen Schichten von Mechanismen ausgestattet, die sich von Erreger Invasionen zu verteidigen helfen. Professionelle Phagozyten des Immunsystems - wie Neutrophile, dendritische Zellen und Makrophagen - behalten die angeborene Fähigkeit , solche eindringende Krankheitserreger durch Phagozytose 1 zu erkennen und zu löschen. Phagozytose beinhaltet choreografierter Ereignisse von Membran Reorganisation und Aktin - Umbildung an der Zelloberfläche 2, 3. Phagozyten erfolgreich internalisieren und fremde Moleküle nur auszurotten, wenn alle Stufen der Phagozytose erfüllt sind. Diese Schritte umfassen die Erkennung und Bindung des Erregers durch Mustererkennungsrezeptoren (PRRS) an der Zelloberfläche aufhalten, die Bildung von phagozytischen cup durch Actin angereicherte membranöse Vorsprünge (Pseudopodien) das teilchenförmige zu umgeben, und Spaltung der phagosome durch Phagolysosom Reifung dass Ergebnisse in derTöten des Erregers 3, 4. Bildgebung und Quantifizierung der verschiedenen Stadien der Phagozytose ist maßgeblich für die molekularen Mechanismen dieser zellulären Prozess Aufklären. Die vorliegende Manuskript berichtet Methoden, um die verschiedenen Phasen der Phagozytose zu studieren. Wir beschreiben ein Mikroskop-basierten Ansatz zu visualisieren und die Bindung, phagozytische Tasse Bildung quantifizieren und die Internalisierung von partikulären von Phagozyten. Wie Phagozytose auftritt , wenn angeborenen Rezeptoren auf phagozytischen Zellen Liganden auf einem Zielpartikel auftreten größer als 0,5 um ist , die Assays wir die Verwendung von pathogenen Pilzen Candida albicans und andere Teilchen , wie beispielsweise Zymosan und IgG beschichteten Kügelchen umfassen hier präsentieren.

Mikroskopbasierten Verfahren die verschiedenen Phasen der Phagozytose zu überwachen dargestellt. Die verschiedenen Veranstaltungen während der Phagozytose von verschiedenen fluoreszierenden Partikeln durch DC2.4 Zellen gezeigt. Unter Verwendung der Techniken, die hier beschrieben ist, untersuchten wir die Rolle von Sphingolipiden in den frühen Stadien der Phagozytose. Hierzu DC2.4 dendritischen Zellen genetisch defizient in Sptlc2, das Enzym, das den ersten und geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt in dem Sphingolipid...

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Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 &#181;m including zymosan and IgG-coated beads.

Visualisierung der frühen Phasen der Phagozytose

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

visualizing-the-early-stages-of-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Biology

16.6K Aufrufe.  Oregon Health & Science University. Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 µm including zymosan and IgG-coated beads.

Serie: Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Studium der Biogenese Phagolysosom im Live-Makrophagen

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

High Throughput Fluorometric Technik zur Bewertung der Makrophagen-Phagozytose und Aktinpolymerisation

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Mess Phagosomen pH durch ratiometrische Fluoreszenzmikroskopie

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation. 
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

&quot;Phagosomen Closure Assay&quot; zu visualisieren Phagosomen Formation in drei Dimensionen Mit Total Internal Reflection Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular compartment where the killing and digestion of engulfed particles take place, is the main arena for neutrophil pathogen killing that requires tight regulation. Phagosomal pH is one aspect that is carefully controlled, in turn regulating antimicrobial protease activity. Many fluorescent pH-sensitive dyes have been used to visualize the phagosomal environment. S-1 has several advantages over other pH-sensitive dyes, including its dual emission spectra, its resistance to photo-bleaching, and its high pKa. Using this method, we have demonstrated that the neutrophil phagosome is unusually alkaline in comparison to other phagocytes. By using different biochemical conjugations of the dye, the phagosome can be delineated from the cytoplasm so that changes in the size and shape of the phagosome can be assessed. This allows for further monitoring of ionic movement.

This manuscript describes a simple method to measure the phagosomal pH and area as well as the cytoplasmic pH of human and mouse neutrophils using the ratiometric indicator seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, or S-1. This is achieved using live-cell confocal fluorescence microscopy and image analysis.

Abbilden der Neutrophilen Phagosomen und Zytoplasma Mit einem Ratiometrisch pH-Indikator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Time-Lapse 3D-Bildgebung der Phagozytose durch Makrophagen der Maus

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up Leishmania parasites by phagocytosis, consisting of recognizing ligands on parasite surfaces by multiple host cell receptors. Binding of Leishmania to macrophage membranes occurs through complement receptor type 1 (CR1) and complement receptor type 3 (CR3) and Pattern Recognition Receptors. Lipophosphoglycan (LPG) and 63 kDa glycoprotein (gp63) are the main ligands involved in macrophage-Leishmania interactions. Following the initial recognition of parasite ligands by host cell receptors, parasites become internalized, survive, and multiply within parasitophorous vacuoles. The maturation process of Leishmania-induced vacuoles involves the acquisition of molecules from intracellular vesicles, including monomeric G protein Rab 5 and Rab 7, lysosomal associated membrane protein 1 (LAMP-1), lysosomal associated membrane protein 2 (LAMP-2), and microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3).
Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells using confocal microscopy, including (i) binding (ii) internalization, and (iii) phagosome maturation. By adding to the body of knowledge surrounding these determinants of infection outcome, we hope to improve the understanding of the pathogenesis of Leishmania infection and support the eventual search for novel chemotherapeutic targets.

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

The mechanism associated with phagocytosis in Leishmania infection remains poorly understood. Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells.

Untersuchung der Phagozytose der Leishmanie mittels konfokaler Mikroskopie

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up ...

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics have been at the forefront. They interact with and regulate immune cell activity. The focus of this study is the MSC regulation of macrophage phagocytic activity. Macrophage (M&#934;) phagocytosis is an important part of the innate immune system response to infection, and the mechanisms through which MSC modulate this response are under active investigation. Presented here is a method to study M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan particles conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule while in co-culture with MSC. As phagocytic activity increases and the labeled zymosan particles are enclosed within the acidic environment of the phagolysosome, the fluorescence intensity of the pH-sensitive molecule increases. With the appropriate excitation and emission wavelengths, phagocytic activity is measured using a fluorescent spectrophotometer and kinetic data is presented as changes in relative fluorescent units over a 70 min period. To support this quantitative data, the change in the phagocytic activity is visualized using dynamic imaging. Results using this method demonstrate that when in co-culture, MSC enhance M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan of both naive and IFN-&#947; treated M&#934;. These data add to the current knowledge of MSC regulation of the innate immune system. This method can be applied in future investigations to fully delineate the underlying cellular and molecular mechanisms.

Presented here is a protocol to quantify and produce dynamic images of mesenchymal stem cell (MSC) mediated regulation of macrophage (M&#934;) phagocytosis of non-opsonized yeast (zymosan) particles that are conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule.

Mesenchymale Stammzellregulation der Makrophagen-Phagozytose; Quantifizierung und Bildgebung

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

Real-Time Imaging of Macrophage Phagocytosis of IgG-Opsonized Red Blood Cells

Source: Horsthemke, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/57566">Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates an assay to monitor independent macrophage-mediated red blood cell (RBC) phagocytosis events. Mouse immunoglobulin G (IgG)-opsonized human RBCs are incubated with mouse macrophages and observed under a confocal microscope. The RBCs are engulfed by macrophages via a phagocytic cup formation and targeted for lysosomal degradation.

Echtzeit-Bildgebung der Makrophagen-Phagozytose von IgG-opsonisierten roten Blutkörperchen

Source: Horsthemke, M., et al. Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages. J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates an assay to monitor ...