Wir danken Wendy Lachs und Nicki Watson von der Keck-Anlage am Whitehead Institute des MIT für die Bildgebung.

1. Herstellung von DC2.4 und RAW 264.7-Zelllinien HINWEIS: Die Makrophagen-Zelllinie RAW 264.7 und die dendritische Zelllinie DC2.4 sind sowohl murinen Ursprungs, und die folgenden Bedingungen wurden verwendet, um die Zellen zu wachsen. <ol><li> Wachsen RAW 264.7 - Zellen in DMEM (Dulbeccos Minimal Eagle-Medium) , ergänzt mit 10% inaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. </li><li> Wachsen DC2.4 Zellen unter ähnlichen Bedingungen mit der RAW 264.7-Zellen, mit der Ausnahme Gebrauch RPMI (Roswell Park Memorial Institute) Medium, das mit L-Glutamin anstelle von DMEM. </li></ol> 2. Herstellung von Fluorescent Konjugierte Partikel: C. albicans, Zymosan, IgG-beschichtete Beads <ol><li> Wachsende Candida albicans <ol><li> Impfen SC5314 C. albicans Stamm aus einem gefrorenen Glycerolstammlösung in 25 ml YPD mit Uri ergänzt (2% Bacto-Pepton, 1%Hefeextrakt, 2% Glucose und 80 ug / ml Uridin) über Nacht bei 30 ° C. HINWEIS: Vermeiden Sie die Candida - Kultur wachsen mehr als einer OD 600 von 12. </li><li> Nehmen Sie 1 ml der C. albicans und Spin es bei 2.000 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur nach unten. </li><li> Aspirieren den Überstand und resuspendiere das Pellet mit 1 ml PBS. </li><li> Sammle das Pellet durch Zentrifugation bei 2.000 xg für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.1.4. </li><li> Berechne die Multiplizität der Infektion (MOI) von C. albicans in Bezug auf die Anzahl von Phagozyten und fahren mit der Phagocytose - Assay , wie in Kapitel 3 beschrieben eine OD 600 von 1 bis 2,5 x 10 7 Candida albicans pro 1 ml entspricht. HINWEIS: Die Erzeugung von Candida-BFP in Bezug 13 beschrieben. </li></ol></li><li> Herstellung von Zymosan und IgG beschichteten Beads HINWEIS: Zymosan ist ein β-Glucan enthaltendePilz-Kohlenhydrat - Partikelpräparat , das aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet. Zymosan ist bekannt Entzündungssignale in Makrophagen und dendritischen Zellen hervorzurufen, und es wurde 13 extensiv in Phagozytose Studien verwendet wurden, 14, 15. <ol><li> Kurz das Rohr Wirbel, der die Partikel enthält, und eine Menge für ein Experiment in ein 1,5-ml-Röhrchen ausreichend aliquotieren. HINWEIS: In der Regel verwenden wir im Verhältnis 1:10 (für eine Zelle, mit 10 zymosan Partikel oder IgG-beschichtete Beads). </li><li> 1 ml eiskaltem PBS, und sammelt die Partikel durch bei 10.000 x g für 1 min zentrifugiert. </li><li> Den Überstand aspirieren und das Pellet in 1 ml eiskaltem PBS. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2-2.2.3 HINWEIS: Gehen Sie 2.2.5 zu Schritt oder lagern Sie das Röhrchen bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Beschallen die Partikel für 10 Sekunden in Ultraschall-Ultraschallbad (120 V, 50-60 kHz), um eine zu vermeidenny Partikelaggregation. </li></ol></li></ol> 3. Phagozytose HINWEIS: Die Phagozytose ist ein komplexer Prozess, der mit der Bindung der Partikel auf der Zelloberfläche der Phagozyten durch Wechselwirkung von PRRs mit Liganden auf der Oberfläche des Partikels beginnt. Bindung wird durch die Montage von Aktin und seine zugehörigen Proteine ​​an der Stelle des Kontakts und die Bildung eines phagozytischen cup gefolgt. Die anschließende Aktin Demontage erfolgt auf phagosome und führt zur vollständigen engulfment des partikulären. Im Folgenden die verschiedenen Phasen der Phagozytose zu beschreiben. <ol><li> Bindungsassay HINWEIS: Der Zweck dieses Experiments ist es, die erste Stufe der Phagozytose zu überwachen, die die Wechselwirkung zwischen den Liganden auf den Zielpartikeln und den Rezeptoren auf den Phagozyten beinhaltet. <ol><li> Samen etwa 5 x 10 4 Zellen in einer Kammer gleiten , so dass sie 60-70% konfluent zu der Zeit des Experiments sind. Alterntiv, Platten Zellen auf Deckgläser (in 24- oder 12-Well-Format) oder Glasboden-96-Well-Platten. Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. HINWEIS: Die Zellen können unter Verwendung von Hämozytometer oder eine ähnliche Technik gezählt werden. </li><li> Legen Sie die Kammer Schieber (oder Platte) bei 10 ° C für 10 min. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Medium aus jedem Well einer Pipette oder Absauger verwenden. ACHTUNG: Führen Sie diesen Schritt sorgfältig wie jede Vertiefung von einem Kammerschalennautilus Abdeckglas System ist klein; es ist leicht, Zellen mit der Spitze einer Pipette oder einer starken Luftstrom von einem Absauggerät zu stören. </li><li> Mischen Sie die fluoreszenzmarkierte Partikel mit einem Zellkulturmedium (hergestellt wie oben beschrieben). Hinzufügen Candida -BFP (bei einer MOI von 10), fluoreszenz konjugiert-Zymosan oder Latexkügelchen-Kaninchen - IgG-FITC (10 Partikel pro Zelle) auf die Zellen. Verwenden, um ein Endvolumen von 200 &amp; mgr; l Medium für eine Kammer auch alle Zellen, um sicherzustellen, abgedeckt sind. </li><li> Spin down die Kammer Schieber bei 277xg für 3 min bei 10 ° C. Hinweis: dieser Zentrifugationsschritt hilft, den Kontakt zwischen den Teilchen und den Zellen zu erhöhen, und es synchronisiert den Bindevorgang. </li><li> Sofort übertragen die Kammer Folie zu einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für 5 min. </li><li> Entfernen Sie die Kammer Schlitten aus dem Inkubator und die Medien ansaugen. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit eiskaltem PBS 3x. HINWEIS: Überprüfen Sie das Vorhandensein von nicht gebundenen Partikel mit einem Lichtmikroskop und mehrmals mit PBS waschen, wenn nötig. Es ist wesentlich, ungebundene Partikel aus dem Bohrloch zu entfernen, Hintergrundrauschen während der Analyse zu minimieren. </li><li> Fix-Zellen durch Zugabe von 500 ul 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS verdünnt, für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. VORSICHT: Dieser Schritt erfordert die Verwendung von 4% PFA, die hoch toxisch, korrosiv ist und potentiell karzinogen. Die richtige Vorsicht ist geboten, wenn diese Flüssigkeit verwendet wird. Außerdem schützen Proben aus Licht. </li><li&gt; Die Zellen waschen von 500 ul PBS in die Kammer das Hinzufügen und die Lösung vorsichtig absaugen. </li><li> Zweimal wiederholen 3.1.9 Schritt. HINWEIS: Bei diesem Schritt füllen jedes Fläschchen unmittelbar nach dem vorherigen PBS zu entfernen. </li><li> Stoppen Sie die Fixierung von 10 min mit 500 &amp; mgr; l von 50 mM NH 4 Cl in PBS inkubiert. </li><li> Wasche die Zellen zweimal mit PBS wie in Schritt 3.1.10 beschrieben. </li><li> Permeabilisieren Zellen durch Zugabe von 250 &amp; mgr; l Bindungspuffer (0,1% Saponin, 0,2% BSA in PBS) für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Stain F-Aktin durch fluoreszenz konjugiertes Phalloidin Zugabe von (1: 500 verdünnt in Bindungspuffer). Inkubiere Zellen für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Wasche die Zellen dreimal mit PBS wie in Schritt 3.1.10 beschrieben. </li><li> Zum Aufzeichnen von Bildern mit einem konfokalen Mikroskop (63X Ziel, und 402 nm und 488 nm Laser) unter Verwendung von und zu analysieren , Bilder mit ImageJ 16. HINWEIS: Eine erfolgreiche Partikelbindung durch das Vorhandensein einer Phagozyten cu gekennzeichnet istp an der Stelle , wo das partikuläre Kontakt die phagozytische Zelle (Abbildung 1). Siehe Schritt 3.2.5. </li></ol></li><li> Phagozytose Uptake Assay Hinweis: Dieses Experiment wurde entwickelt , die vollständige Internalisierung von fluoreszent markierten Partikel durch Phagozyten Mikroskopie mittels konfokaler zu überwachen (Abbildung 2). <ol><li> Samen etwa 5 x 10 4 Zellen in einer Kammer gleiten , so dass sie 60-70% konfluent zu der Zeit des Experiments sind. Alternativ Platte Zellen auf Deckgläser (in 24- oder 12-Well-Format) oder Glasboden-96-Well-Platten. Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. HINWEIS: Die Zellen können unter Verwendung von Hämozytometer oder eine ähnliche Technik gezählt werden. </li><li> Halten Sie die Kammer gleitet (oder Platte) bei 10 ° C für 10 min. HINWEIS: Die Kühlung ist erforderlich, um Endozytose sowie unerwünschte Phagozytose zu blockieren, und anschließend einen synchronisierten Phagozytose haben. </li><li> PerfORM Schritte von 3.1.3 bis 3.1.5 </li><li> Übertragen , um die Kammer auf einen Objektträger 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2, und inkubiere für verschiedene Zeitpunkte. Fix-Zellen nach 30, 60 und 90 Minuten nach der Infektion. Beobachten Sie C. albicans beginnen Hyphen bei 60 min nach der Infektion zu bilden; Phagozyten beginnen nach 90 min 8 Zelltod (pyroptosis) zu zeigen. ANMERKUNG: Dies ist eine Empfehlung und Optimierung ist wesentlich abhängig von dem Zelltyp und dem partikulären verwendet. </li><li> Führen Sie die Schritte von 3.1.7 bis 3.1.15. Analysieren von Bildern mit ImageJ 16. HINWEIS: eine erfolgreiche Aufnahme durch eine vollständige Internalisierung eines partikulären innerhalb des Zytoplasmas einer Phagozyten (Abbildung 2) gekennzeichnet ist. Die Färbung der Phagozyten mit Zelloberflächenmarker wie phalloidin hilft, die Form von Zellen zu beschreiben. Es ist auch wichtig, z-Stacks, um zu bestimmen, ob die teilchenförmige ist gebunden an der Zelloberfläche oder kompl auszuführenetely verinnerlicht. </li></ol></li><li> Live - Imaging von Phagozytose HINWEIS: In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung von Konfokalmikroskopie die verschiedenen Stadien der Phagozytose mittels fluoreszenz konjugiert Zymosan zu erfassen. Wir verwenden die dendritischen Zelllinie DC2.4 , die stabil exprimiert mCherry-markierten F-Actin - 8, einen Biosensor, der die Verteilung von fadenförmigen Aktin in lebenden Zellen zeigt. Da Phagozytose ein Aktin-gesteuerter Prozess ist ermöglicht die Live - Bildgebung in dieser Zelle nicht nur uns , die Bewegung und Dynamik von F-Actin - Netzwerk zu erfassen, sondern auch die verschiedenen phagozytischen Ereignisse innerhalb der lebenden Zellen (Abbildung 3, Film 1) zu visualisieren. <ol><li> Samen etwa 5 x 10 4 Zellen in einer Kammer Schieber in einer Konzentration , so dass sie 60-70% konfluent zu der Zeit des Experiments sind. Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. HINWEIS: Die Zellen können mit Hämozytometer oder ein gezählt werdenähnliche Technik. </li><li> Halten Sie die Kammer gleitet auf Eis für 10 min. HINWEIS: Die Kühlung ist erforderlich, um unerwünschte Aufnahme zu blockieren, und ein synchronisiertes Phagozytose haben. </li><li> Führen Sie die Schritte von 3.1.3 bis 3.1.5 </li><li> Pre-warm das Mikroskoptisch bis 37 ° C und die Kammer mit 5% CO 2 ins Gleichgewicht. Warten 30-45 min für die Temperatur und das CO 2 zu stabilisieren , bevor die Abbildungs beginnen. Hinweis: Da der CO 2 und Temperaturniveaus für die Phagozytose kritisch sind, ist es wichtig , auf dem Mikroskop Erhitzer dem Experiment vor , um den Umgebungsraum äquilibrieren. </li><li> Legen Sie die Kammer schieben Sie die Zellen im Mikroskop - Inkubator - Gehäuse ins Gleichgewicht gebracht bei 37 ° C und 5% CO 2 enthält. </li><li> Führen Sie die Live - Darstellung 17, 18. HINWEIS: Die Einstellungen für die Laserleistung (Verstärkung, pinhole, etc.) kann in Abhängigkeit von der Art der th variierene Mikroskop und Fluoreszenzsonde verwendet. Daher empfehlen wir die Beratung in der Bedienungsanleitung des Mikroskops für eine optimale Voraussetzung für Ihre Live - Bildgebung 17,18. <ol><li> Verwenden der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (und die dazugehörige Software) für die Live-Darstellung. Verwenden Sie 63X 1.4NA Öl-Objektiv mit einer Loch von 1-1,1 Airy-Einheiten. </li><li> Um die Bildgebung zu starten, verwendet, um das Hellfeld einen repräsentativen Bereich auf der Kammer Folie zu finden. Als nächstes wählen Sie das Feld, indem Sie auf die Software, um die Option für die Position klicken. Zum Nachweis von GFP in Spur 1 der Filtersatz bei 582 nm für 488-nm-Laser mit einem Strahlteiler verwendet, zu erfassen, Wellenlängen zwischen 488 und 582 nm. </li><li> In Track 2 wählen einen Filter optimal für mCherry (RFP) einen Strahlteiler bei 578 nm und Wellenlängen zwischen 578 und 600 nm zu erkennen. Verwenden 488 nm und 578 nm-Laser mit 50% Laserleistung und einem Verstärkungsleistung von 600-700. Erhalten Sie Bilder alle 30 Sekunden für insgesamt 90 min. </li></ol></li></ol></li></ol>

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The authors declare no conflicts of interest.

Professionelle Phagozyten, wie Makrophagen und dendritischen Zellen, verschlingen und zu beseitigen Krankheitserreger daher macht Phagozytose ein wichtiger Bestandteil des Abwehrsystems eindringen. Während dieses Prozesses durchlaufen Phagozyten umfangreiche Membran Reorganisation und Zytoskelett Umlagerung an ihrer Zelloberfläche 8, 19, 20. Um diesem dynamischen Prozess zu verstehen, die Visualisierung der verschiedenen Phas...

Trotz der kontinuierlichen Exposition gegenüber Krankheitserregern wie Bakterien, Viren und Pilze, ist unser Körper gut mit Immun-Mechanismus ausgestattet, der Schutz gegen eine Infektion bieten. Das angeborene Immunsystem ist die erste Verteidigungslinie gegen eindringende Krankheitserreger und stützt sich hauptsächlich auf Phagozyten, die erkennen und ausländische Ziele verinnerlichen. Phagozytose ist ein evolutionär konserviert zellulären Prozess, der die Phagozytose von unerwünschten Partikeln größer als 0,5 &amp; mgr; m umfasst. Phagozytische Zellen exprimieren eine Vielzahl von Immunrezeptoren auf der Zelloberfläche (auch als pattern recognition receptors, PRR bekannt) , die es ihnen ermöglichen , 3 pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) , die auf Krankheitserreger vor engulfment zu erkennen. Pathogen-Bindung wird durch Rezeptor clustering an der Zelloberfläche folgt und löst die Bildung einer phagozytischen Tasse. Dies führt zu einer Membran Remodeling Aktin-angetrieben, ragt runddas Ziel ist , umhüllen sie schließlich und Abklemmen eines diskreten phagosomalen Vakuole 2, 5 zu bilden. Die phagosome reift dann und säuert durch anschließende Fusion mit späten Endosomen und Lysosomen , die Phagolysosom 6 bildet. Obwohl die Phagozytose als rezeptorvermittelte und Aktin-driven Ereignis beschrieben wird, stützt sich dieses Verfahren auch auf räumlich-zeitlichen Modifikation von Lipiden, die die Plasmamembran, wie Phosphoinositiden (PIs) und Sphingolipide 7, 8 zusammenzusetzen . Während Aktin - Polymerisation durch eine lokale Ansammlung von Phosphoinositol-4,5-bisphosphat (PI (4,5) P 2) an der Basis des phagozytischen cup diktiert wird, hängt Aktin Depolymerisation auf der Umwandlung von (PI (4,5) P 2 bis Phosphoinosit-3,4,5-bisphosphat (PI (3,4,5) P 3) 3, 9. Beide Änderungensind wichtig , da Ersteres führt zu einer erfolgreichen Verlängerung der Pseudopodien um das Ziel und die letztere ermöglicht 10 von Teilchen in das Cytosol der Phagozyten sinkt. Die Zellen, die die Fähigkeit zu phagozytieren haben , sind entweder professionelle Phagozyten, wie Makrophagen / Monozyten, Granulozyten / Neutrophilen und dendritischen Zellen (DCs) oder nicht - professionellen Phagozyten, wie Fibroblasten und Epithelzellen 11. Die Phagozytose von allen Phagozyten ausgeführt spielt eine zentrale Rolle bei der Gewebe Wartung und Umbau, während der Phagozytose von professionellen Phagozyten durchgeführt, um die Koordination der angeborenen und adaptiven Immunantwort gegen Krankheitserreger verantwortlich ist. Professionelle Phagozyten nicht nur überfluten und den Erreger zu töten, sondern auch Antigene zu den lymphatischen Zellen des adaptiven Immunsystems. Dies trägt zur Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen und den Eingriff von lymphoiden Zellen, daher führt zudie erfolgreiche Blockade der Infektion 12. Herkömmliche biochemische Techniken haben dazu beigetragen, Wissen zu gewinnen über die molekularen Mechanismen der verschiedenen zellulären Prozessen während der Phagozytose, wie post-translationale Modifikationen und verschiedene hochaffinen Assoziation zwischen Proteinen. mit den üblichen biochemischen Methoden ist es jedoch schwierig, Informationen über die räumlichen und zeitlichen Dynamik der phagozytischen Ereignisse zu erhalten. Live-Cell-Imaging ermöglicht uns nicht nur zelluläre Ereignisse in einer Zeit, sensible Art und Weise zu überwachen, sondern auch ermöglicht es uns, Informationen auf Einzelzellebene zu gewinnen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um die verschiedenen Stadien der Phagozytose zu untersuchen, sowie den gesamten Prozess zu analysieren raumzeitlich konfokalen Mikroskopie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="988">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:253px;">AppliChem</td>
			<td style="width:332px;">A1108</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Cell Signaling Technology&#160;</td>
			<td>9998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP-231-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">DMEM (Dulbecco&#8217;s Minimal Eagle&#8217;s medium)</td>
			<td style="width:253px;">Gibco</td>
			<td style="width:332px;">11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">PBS, 1X (Phosphate- Buffered Saline)</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fetal Bovine serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">FITC-coupled IgG-coated latex beads</td>
			<td style="width:253px;">Cayman</td>
			<td style="width:332px;">500290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">L-Glutamine 200mM (100X)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Paraformaldehyde Solution (4% in PBS)</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943 1 LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Penicillin-streptomycin (10&#39;000U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:332px;"><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-penicillin-streptomycin-10-000-u-ml-3/15140122">15-140-122</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Phalloidin-Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:253px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:332px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">RAW 264.7 cells</td>
			<td style="width:253px;">ATCC</td>
			<td style="width:332px;">TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">RPMI (Roswell Park Memorial Institute)</td>
			<td style="width:253px;">Gibco</td>
			<td style="width:332px;">61870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Saponin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS)</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>MT25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypsin-EDTA (1X) (0.05%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>&#160;85114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Zymosan-Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:253px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:332px;">Z23374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:315px;">Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>155361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glasstic slide 10 with grids</td>
			<td>Hycor</td>
			<td>87144</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the early stages of phagocytosis

Der Säugetierkörper ist mit verschiedenen Schichten von Mechanismen ausgestattet, die sich von Erreger Invasionen zu verteidigen helfen. Professionelle Phagozyten des Immunsystems - wie Neutrophile, dendritische Zellen und Makrophagen - behalten die angeborene Fähigkeit , solche eindringende Krankheitserreger durch Phagozytose 1 zu erkennen und zu löschen. Phagozytose beinhaltet choreografierter Ereignisse von Membran Reorganisation und Aktin - Umbildung an der Zelloberfläche 2, 3. Phagozyten erfolgreich internalisieren und fremde Moleküle nur auszurotten, wenn alle Stufen der Phagozytose erfüllt sind. Diese Schritte umfassen die Erkennung und Bindung des Erregers durch Mustererkennungsrezeptoren (PRRS) an der Zelloberfläche aufhalten, die Bildung von phagozytischen cup durch Actin angereicherte membranöse Vorsprünge (Pseudopodien) das teilchenförmige zu umgeben, und Spaltung der phagosome durch Phagolysosom Reifung dass Ergebnisse in derTöten des Erregers 3, 4. Bildgebung und Quantifizierung der verschiedenen Stadien der Phagozytose ist maßgeblich für die molekularen Mechanismen dieser zellulären Prozess Aufklären. Die vorliegende Manuskript berichtet Methoden, um die verschiedenen Phasen der Phagozytose zu studieren. Wir beschreiben ein Mikroskop-basierten Ansatz zu visualisieren und die Bindung, phagozytische Tasse Bildung quantifizieren und die Internalisierung von partikulären von Phagozyten. Wie Phagozytose auftritt , wenn angeborenen Rezeptoren auf phagozytischen Zellen Liganden auf einem Zielpartikel auftreten größer als 0,5 um ist , die Assays wir die Verwendung von pathogenen Pilzen Candida albicans und andere Teilchen , wie beispielsweise Zymosan und IgG beschichteten Kügelchen umfassen hier präsentieren.

Mikroskopbasierten Verfahren die verschiedenen Phasen der Phagozytose zu überwachen dargestellt. Die verschiedenen Veranstaltungen während der Phagozytose von verschiedenen fluoreszierenden Partikeln durch DC2.4 Zellen gezeigt. Unter Verwendung der Techniken, die hier beschrieben ist, untersuchten wir die Rolle von Sphingolipiden in den frühen Stadien der Phagozytose. Hierzu DC2.4 dendritischen Zellen genetisch defizient in Sptlc2, das Enzym, das den ersten und geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt in dem Sphingolipid...

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Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 &#181;m including zymosan and IgG-coated beads.

Visualisierung der frühen Phasen der Phagozytose

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

visualizing-the-early-stages-of-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Biology

16.5K Aufrufe.  Oregon Health & Science University. Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 µm including zymosan and IgG-coated beads.

Serie: Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

Layers of Symbiosis - Visualizing the Termite Hindgut Microbial Community

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth.  Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth. Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

Schichten von Symbiosis - Visualisierung der Termite Enddarm mikrobiellen Gemeinschaft

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different ...

Forschung

Biologie

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

Visualisierung der Live- Drosophila Glial-neuromuskulären Synapse mit Fluoreszenzfarbstoffen

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Visualisierung des schlagenden Herzens in Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oozyten

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. Tracking fiducial markers on the surfaces of these cellular sheets is a well-established method for estimating morphogenetic quantities such as growth, contraction, and shear. However, not all surface labeling techniques are readily adaptable to conventional imaging modalities and possess different advantages and limitations. Here, we describe two labeling methods and illustrate the utility of each technique. In the first method, hundreds of fluorescent labels are applied simultaneously to the embryo using magnetic iron particles. These labels are then used to quantity 2-D tissue deformations during morphogenesis. In the second method, polystyrene microspheres are used as contrast agents in non-invasive optical coherence tomography (OCT) imaging to track 3-D tissue deformations. These techniques have been successfully implemented in our lab to studythe physical mechanisms of early head fold, heart, and brain development, and should be adaptable to a wide range morphogenetic processes.

This article describes surface labeling and ex ovo tissue culture in the early chick embryo. Techniques amenable to time-lapse bright field, fluorescence, and optical coherence tomography imaging are presented. Tracking surface labels with high spatiotemporal resolution enables kinematic quantities such as morphogenetic strains (deformations) to be calculated in both two and three dimensions.

Tracking Morphogenetic Tissue Verformungen in der frühen Hühnerembryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and memory and learning4,5,6. As the only songbird with a sequenced genome, the zebra finch has great potential for use in developmental studies; however, the early stages of zebra finch development have not been well studied. Lack of research in zebra finch development can be attributed to the difficulty of dissecting the small egg and embryo. The following dissection method minimizes embryonic tissue damage, which allows for investigation of morphology and gene expression at all stages of embryonic development. This permits both bright field and fluorescence quality imaging of embryos, use in molecular procedures such as in situ hybridization (ISH), cell proliferation assays, and RNA extraction for quantitative assays such as quantitative real-time PCR (qtRT-PCR).&#160;This technique allows investigators to study early stages of development that were previously difficult to access.

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications.

Dissection und Downstream-Analyse von Zebra Finch Embryos in frühen Stadien der Entwicklung

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis als Modell zur Übersetzung Impairment Identifizieren

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments for T2D, more physiologically relevant in vitro adipocyte models are required. This study describes a new technique to isolate and culture mature human adipocytes. This method is entitled MAAC (membrane mature adipocyte aggregate culture), and compared to other adipocyte in vitro models, MAAC possesses an adipogenic gene signature that is the closest to freshly isolated mature adipocytes. Using MAAC, adipocytes can be cultured from lean and obese patients, different adipose depots, co-cultured with different cell types, and importantly, can be kept in culture for 2 weeks. Functional experiments can also be performed on MAAC including glucose uptake, lipogenesis, and lipolysis. Moreover, MAAC responds robustly to diverse pharmacological agonism and can be used to study adipocyte phenotypic changes, including the transdifferentiation of white adipocytes into brown-like fat cells.

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC

Membrane mature adipocyte aggregate culture (MAAC) is a new method to culture mature human adipocytes. Here we detail how to isolate adipocytes from human adipose and how to set up MAAC.

Isolation und Kultur der menschlichen Reife Adipozyten mit Membran Reife Adipozyten Aggregatkulturen (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...

A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution of specific genes to brain development and function increases. Relying on mouse models to study the role of specific genetic manipulations is not always feasible since transgenic mouse lines are quite costly and many novel disease-associated genes do not yet have commercially available genetic lines. Additionally, it can take years of development and validation to create a mouse line. In utero electroporation offers a relatively quick and easy method to manipulate gene expression in a cell-type specific manner in vivo that only requires developing a DNA plasmid to achieve a particular genetic manipulation. Bilateral in utero electroporation can be used to target large populations of frontal cortex pyramidal neurons. Combining this gene transfer method with behavioral approaches allows one to study the effects of genetic manipulations on the function of prefrontal cortex networks and the social behavior of juvenile and adult mice.

The role of recently discovered disease-associated genes in the pathogenesis of neuropsychiatric disorders remains obscure. A modified bilateral in utero electroporation technique allows for the gene transfer in large populations of neurons and examination of the causative effects of gene expression changes on social behavior.

Eine Pipeline mit bilateraler Utero-Elektroporation zur Vernehmung genetischer Einflüsse auf das Nagetierverhalten

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution ...