Nous remercions Wendy Salmon et Nicki Watson de l&#39;installation Keck à l&#39;Institut Whitehead du MIT pour l&#39;imagerie.

1. Préparation de DC2.4 et RAW 264,7 lignées cellulaires NOTE: La lignée cellulaire macrophage RAW 264.7 et dendritique DC2.4 lignée cellulaire sont à la fois origine murine, et les conditions suivantes ont été utilisées pour cultiver les cellules. <ol><li> Cultiver des cellules RAW 264.7 dans du DMEM (milieu de Eagle minimal de Dulbecco) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal inactivé (FBS) à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2. </li><li> Cultiver les cellules DC2.4 dans des conditions similaires avec celle des cellules RAW 264.7, sauf l&#39;utilisation RPMI (Roswell Park Memorial Institute) supplémenté avec de la L-glutamine au lieu de DMEM. </li></ol> 2. Préparation des fluorescents Conjugués Particules: Perles C. albicans, zymosan, recouvertes d&#39; IgG <ol><li> Growing Candida albicans <ol><li> Inoculer souche C. albicans SC5314 à partir d&#39; un stock de glycérol congelé dans 25 ml de YPD supplémenté avec Uri (2% de Bacto-peptone, 1%extrait de levure, 2% de glucose et 80 pg / ml d&#39;uridine) pendant une nuit à 30 ° C. REMARQUE: Évitez de plus en plus la culture Candida plus d&#39;une DO 600 de 12. </li><li> Prendre 1 ml du C. albicans et de tourner vers le bas à 2000 xg pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot avec 1 ml de PBS. </li><li> Recueillir le culot par centrifugation à 2000 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.1.4. </li><li> Calculer la multiplicité d&#39;infection (MOI) de C. albicans par rapport au nombre de phagocytes et procéder à l&#39;essai de phagocytose telle que décrite dans la section 3. Une DO600 de 1 équivaut à 2,5 x 10 7 Candida albicans par 1 ml. NOTE: La génération de Candida-BFP est décrite dans la référence 13. </li></ol></li><li> Préparation de zymosan et perles recouvertes d&#39; IgG NOTE: zymosan est un contenant β-glucanepréparation d&#39; hydrate de carbone particulaire fongique qui provient de Saccharomyces cerevisiae. Zymosan est connu pour évoquer des signaux inflammatoires dans les macrophages et les cellules dendritiques, et il a été largement utilisé dans les études de phagocytose 13, 14, 15. <ol><li> En bref vortex le tube qui contient la matière particulaire et aliquoter une quantité suffisante pour une expérience dans un tube de 1,5 ml. NOTE: En règle générale, nous utilisons un rapport de 1:10 (pour une cellule, ajouter 10 particules de zymosan ou des billes recouvertes d&#39;IgG). </li><li> Ajouter 1 ml de PBS glacé, et collecter les particules par centrifugation pendant 1 min à 10 000 x g. </li><li> Aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans du PBS 1 ml glacée. </li><li> Répétez les étapes 2.2.2-2.2.3 REMARQUE: Passez à l&#39;étape 2.2.5 ou stocker le tube à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Soniquer les particules pendant 10 secondes en ultrasons sonicateur de bain (120 V, 50-60 kHz) afin d&#39;éviter unel&#39;agrégation des particules ny. </li></ol></li></ol> 3. phagocytose REMARQUE: La phagocytose est un processus complexe qui commence avec la fixation des particules sur la surface cellulaire des phagocytes par l&#39;interaction du SDRP avec des ligands sur la surface de la particule. La liaison est suivie par l&#39;assemblage de l&#39;actine et ses protéines associées au site de contact, et la formation d&#39;une tasse phagocytaire. Le démontage ultérieur a lieu à l&#39;actine phagosome et aboutit à l&#39;engloutissement complet de la matière particulaire. Ci-dessous, nous décrivons les différentes étapes de la phagocytose. <ol><li> Essai de liaison NOTE: Le but de cette expérience est de surveiller la première étape de la phagocytose qui implique l&#39;interaction entre les ligands sur les particules cibles et les récepteurs sur les phagocytes. <ol><li> Ensemencer environ 5 x 10 4 cellules dans une glissière de la chambre afin qu&#39;elles soient confluentes à 60 à 70% au moment de l&#39;expérience. Alterntivement, les cellules de la plaque sur les bordereaux de couverture (en 24- ou en format 12 puits) ou plaques à 96 puits à fond de verre. Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C incubateur humidifié avec 5% de CO 2. NOTE: Les cellules peuvent être comptées en utilisant un hémocytomètre ou une technique similaire. </li><li> Placer la lame de la chambre (ou une plaque) à 10 ° C pendant 10 min. </li><li> Retirez délicatement le milieu de chaque puits à l&#39;aide d&#39;une pipette ou aspirateur. ATTENTION: Effectuez cette étape soigneusement que chaque puits d&#39;un système de coverglass chambré est petit; il est facile de perturber les cellules avec la pointe d&#39;une pipette ou d&#39;un fort flux d&#39;air d&#39;un aspirateur. </li><li> Mélanger les particules marquées par fluorescence avec un milieu de culture cellulaire (préparée comme décrit ci-dessus). Ajouter Candida -BFP (à une MOI de 10), par fluorescence des perles-lapin conjugué-zymosan ou de latex IgG-FITC (10 particules par cellule) dans les cellules. Utiliser un volume final de 200 ul médias pour une chambre bien à assurer que toutes les cellules sont couvertes. </li><li> Isoler la glissière de chambre à 277xg pendant 3 min à 10 ° C. NOTE: Cette étape de centrifugation permet d&#39;augmenter le contact entre les particules et les cellules, et il synchronise le processus de liaison. </li><li> Transférer immédiatement le tiroir de la chambre à 37 ° C incubateur humidifié avec 5% de CO 2 pendant 5 min. </li><li> Retirer la lame de la chambre de l&#39;incubateur et aspirer les médias. </li><li> Laver les cellules 3x avec PBS glacé. NOTE: Vérifier la présence de particules non liées avec un microscope optique et laver plusieurs fois avec PBS si nécessaire. Il est essentiel d&#39;éliminer les particules non liées au puits pour minimiser le bruit de fond lors de l&#39;analyse. </li><li> Fixer les cellules par addition de 500 pi de paraformaldehyde à 4% (PFA) dilué dans du PBS par incubation pendant 30 min à température ambiante. ATTENTION: Cette étape nécessite l&#39;utilisation de 4% PFA qui est très toxique, corrosif et potentiellement cancérigène. la prudence appropriée devrait être prise lors de l&#39;utilisation de ce liquide. En outre, protéger les échantillons de la lumière. </li><li&gt; Laver les cellules en ajoutant 500 pi de PBS dans la chambre et aspirer doucement la solution. </li><li> Répétez 3.1.9 étape deux fois. NOTE: A cette étape, remplir chaque flacon immédiatement après avoir retiré la précédente PBS. </li><li> Arrêter la fixation par incubation avec 500 ul de 50 mM de NH 4 Cl dans du PBS pendant 10 min. </li><li> Laver les cellules deux fois avec du PBS comme décrit à l&#39;étape 3.1.10. </li><li> Perméabiliser les cellules par addition de 250 pi de tampon de liaison (0,1% de saponine, 0,2% de BSA dans du PBS) pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Stain F-actine en ajoutant phalloidin conjugué fluorescent (dilué 1: 500 dans du tampon de liaison). Incuber les cellules pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Laver les cellules trois fois avec du PBS comme décrit à l&#39;étape 3.1.10. </li><li> Capture d&#39; images à l&#39; aide d&#39; un microscope confocal (objectif 63X, et 402 nm et 488 nm laser) et d&#39; analyser des images en utilisant ImageJ 16. Remarque: Une particule réussie liaison est caractérisée par la présence d&#39;un cu phagocytairep à l&#39;endroit où le contact de particules , la cellule phagocytaire (figure 1). Voir l&#39;étape 3.2.5. </li></ol></li><li> Phagocytose Uptake Assay NOTE: Cette expérience est conçue pour surveiller l&#39;internalisation complète des particules marquées par fluorescence par les phagocytes en utilisant la microscopie confocale (figure 2). <ol><li> Ensemencer environ 5 x 10 4 cellules dans une glissière de la chambre afin qu&#39;elles soient confluentes à 60 à 70% au moment de l&#39;expérience. Alternativement, les cellules de la plaque sur les bordereaux de couverture (en 24- ou en format 12 puits) ou plaques à 96 puits à fond de verre. Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C incubateur humidifié avec 5% de CO 2. NOTE: Les cellules peuvent être comptées en utilisant un hémocytomètre ou une technique similaire. </li><li> Gardez les lames de la chambre (ou plaque) à 10 ° C pendant 10 min. REMARQUE: refroidissement est nécessaire afin de bloquer l&#39;endocytose, ainsi que la phagocytose non désirée, et par la suite d&#39;avoir une phagocytose synchronisée. </li><li> PerfORM étapes de 3.1.3 à 3.1.5 </li><li> Transférer le chariot de la chambre à 37 ° C , un incubateur humidifié avec 5% de CO 2, et laisser incuber pendant différents temps. Fixer les cellules après l&#39;infection 30, 60 et 90 min après. Observer C. albicans commencent à se former hyphes après l&#39;infection de 60 min; phagocytes commencent à montrer la mort cellulaire (pyroptosis) après 90 min 8. NOTE: Ceci est une recommandation, et l&#39;optimisation est essentielle en fonction du type cellulaire et les particules utilisées. </li><li> Effectuer les étapes de 3.1.7 à 3.1.15. Analyser les images en utilisant ImageJ 16. REMARQUE: une absorption réussie est caractérisée par une intériorisation complète d&#39;une matière particulaire à l&#39; intérieur du cytoplasme d&#39;un phagocyte (figure 2). Tacher les phagocytes avec le marqueur de surface cellulaire tels que la phalloïdine contribue à délimiter le contour des cellules. Il est également essentiel d&#39;effectuer z-piles afin de déterminer si les particules est lié à la surface cellulaire ou completely intériorisé. </li></ol></li><li> Imagerie en direct de phagocytose NOTE: Dans ce protocole, nous décrivons l&#39;utilisation de la microscopie confocale pour capturer les différentes étapes de la phagocytose en utilisant zymosan fluorescence conjugué. Nous utilisons la lignée cellulaire dendritique DC2.4 qui exprime de manière stable mCherry marqués F-actine 8, un biocapteur qui montre la distribution de l&#39; actine filamenteuse dans les cellules vivantes. Depuis phagocytose est un processus axé sur l&#39; actine l&#39;imagerie en direct dans cette cellule nous permet non seulement de capturer le mouvement et la dynamique du réseau F-actine, mais aussi de visualiser les différents événements phagocytaires dans les cellules vivantes (Figure 3, film 1). <ol><li> Ensemencer environ 5 x 10 4 cellules dans une lame de chambre à une concentration , de sorte qu&#39;ils sont 60 à 70% de confluence au moment de l&#39;expérience. Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C incubateur humidifié avec 5% de CO 2. NOTE: Les cellules peuvent être comptées en utilisant un hémocytomètre outechnique similaire. </li><li> Gardez les diapositives de la chambre sur la glace pendant 10 min. REMARQUE: refroidissement est nécessaire afin de bloquer l&#39;absorption non désirée, et d&#39;avoir une phagocytose synchronisée. </li><li> Effectuer les étapes de 3.1.3 à 3.1.5 </li><li> Préchauffer la platine du microscope à 37 ° C et à équilibrer la chambre avec 5% de CO 2. Attendre 30 à 45 min pour la température et le CO 2 se stabilise avant de commencer la formation d&#39; image. NOTE: Étant donné que les CO 2 et des niveaux de température sont critiques pour la phagocytose, il est important de se tourner sur le chauffe-microscope avant l&#39;expérience pour équilibrer la chambre environnementale. </li><li> Placer la lame de la chambre contenant les cellules dans l&#39;enceinte microscope incubateur équilibré à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Effectuer l&#39; imagerie en direct 17, 18. REMARQUE: Les paramètres de la puissance du laser (gain, sténopé, etc.) peuvent varier en fonction du type d&#39;ee microscope et sonde fluorescente utilisés. Par conséquent, nous vous recommandons de consulter le manuel du microscope pour connaître l&#39; état optimal pour votre imagerie en direct 17,18. <ol><li> Utiliser microscope confocal à balayage laser (et le logiciel associé) pour l&#39;imagerie en temps réel. Utilisez objectif d&#39;huile 63X 1.4NA avec un sténopé de 1-1,1 unités Airy. </li><li> Pour démarrer l&#39;imagerie, utilisé le champ lumineux pour trouver une région représentative sur la lame de la chambre. Ensuite, sélectionnez le champ en cliquant sur l&#39;option de position sur le logiciel. Pour détecter la GFP dans la voie 1 a utilisé le jeu de filtres pour 488 nm laser avec un diviseur de faisceau à 582 nm, pour détecter des longueurs d&#39;onde entre 488 et 582 nm. </li><li> Dans Track 2 sélectionner un filtre défini optimal pour mCherry (DP) en utilisant un diviseur de faisceau à 578 nm et la détection de longueurs d&#39;onde entre 578 et 600 nm. Utiliser 488 nm et 578 nm avec des lasers à 50% de la puissance laser et une sortie de gain de 600-700. Obtenir des images toutes les 30 secondes pour un total de 90 min. </li></ol></li></ol></li></ol>

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The authors declare no conflicts of interest.

phagocytes professionnels, tels que les macrophages et les cellules dendritiques, engloutir et d&#39;éliminer les pathogènes envahisseurs rendant ainsi la phagocytose une composante importante du système de défense de l&#39;hôte. Au cours de ce processus phagocytes subissent une réorganisation de la membrane et le réarrangement du cytosquelette à leur surface cellulaire 8, 19, 20. Pour mieux comprendre ce processus dyna...

En dépit de l&#39;exposition continue à des agents pathogènes tels que les bactéries, les virus et les champignons, notre corps est bien équipé avec un mécanisme immunitaire qui offrent une protection contre l&#39;infection. Le système immunitaire inné est la première ligne de défense contre les agents pathogènes envahisseurs et repose principalement sur les cellules phagocytaires qui reconnaissent et internalisent des cibles étrangères. La phagocytose est un processus cellulaire évolutivement conservée qui englobe l&#39;engloutissement de particules indésirables supérieures à 0,5 um. Les cellules phagocytaires expriment un large éventail de récepteurs immunitaires (également appelés récepteurs de reconnaissance des formes, PRR) à la surface des cellules qui leur permettent de reconnaître des modèles moléculaires associés à des pathogènes (PAMP) présents sur les agents pathogènes avant engloutissement 3. La liaison pathogène est suivie par le regroupement des récepteurs à la surface des cellules et provoque la formation d&#39;une coupelle phagocytaire. Cela se traduit par le remodelage de la membrane entraînée actine qui fait saillie versla cible, éventuellement enveloppant et pincer-off pour former un phagosome discret vacuole 2, 5. Phagosome et mûrit ensuite acidifie par fusion ultérieure avec les endosomes tardifs et les lysosomes qui forme phagolysosome 6. Bien que la phagocytose est décrite comme événement médié par le récepteur et entraîné actine, ce procédé repose également sur la modification spatio-temporelle des lipides composant la membrane plasmique, tels que les phosphoinositides (PI) et de sphingolipides 7, 8. Alors que la polymérisation de l&#39; actine est dictée par une accumulation locale de phosphoinositol-4,5-bisphosphate (PI (4,5) P2) à la base de la coupelle de phagocytose, l&#39; actine dépolymérisation dépend de la conversion de (PI (4,5) P 2 à phospho-3,4,5-biphosphate (PI (3,4,5) P 3) 3, 9. Les deux modificationssont essentiels comme les anciens conduit à l&#39; extension réussie de pseudopodes autour de la cible et celle - ci permet d&#39; amortissement de particules dans le cytosol du phagocyte 10. Les cellules qui ont la capacité de phagocytose sont soit des phagocytes professionnels, comme les macrophages / monocytes, les granulocytes neutrophiles et / cellules dendritiques (CD) ou les phagocytes non professionnels, tels que les fibroblastes et les cellules epitheliales 11. Phagocytose effectué par tous les phagocytes joue un rôle central dans l&#39;entretien des tissus et le remodelage, tandis que la phagocytose effectuée par phagocytes professionnels est responsable de la coordination de la réponse immunitaire innée et adaptative contre les pathogènes. phagocytes professionnels ne phagocytent pas seulement et tuer l&#39;agent pathogène, mais aussi des antigènes présents sur les cellules lymphoïdes du système immunitaire adaptatif. Cela contribue à la libération de cytokines pro-inflammatoires et à l&#39;engagement des cellules lymphoïdes, conduisant donc àle blocus succès de l&#39; infection 12. techniques biochimiques classiques ont contribué à l&#39;acquisition de connaissances en ce qui concerne le mécanisme moléculaire de différents processus cellulaires au cours de la phagocytose, telles que des modifications post-traductionnelles et diverses associations de haute affinité entre les protéines. Cependant, il est difficile d&#39;obtenir des informations sur la dynamique spatiale et temporelle des événements phagocytaires en utilisant les méthodes biochimiques classiques. imagerie cellulaire en direct non seulement nous permet de suivre les événements cellulaires d&#39;une manière sensible à la fois, mais aussi nous permet d&#39;obtenir de l&#39;information au niveau de la cellule unique. Ici, nous décrivons une méthode pour étudier les différents stades de la phagocytose, ainsi que d&#39;analyser l&#39;ensemble du processus spatio-temporelle en utilisant la microscopie confocale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="988">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:253px;">AppliChem</td>
			<td style="width:332px;">A1108</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Cell Signaling Technology&#160;</td>
			<td>9998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP-231-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">DMEM (Dulbecco&#8217;s Minimal Eagle&#8217;s medium)</td>
			<td style="width:253px;">Gibco</td>
			<td style="width:332px;">11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">PBS, 1X (Phosphate- Buffered Saline)</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fetal Bovine serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">FITC-coupled IgG-coated latex beads</td>
			<td style="width:253px;">Cayman</td>
			<td style="width:332px;">500290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">L-Glutamine 200mM (100X)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Paraformaldehyde Solution (4% in PBS)</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943 1 LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Penicillin-streptomycin (10&#39;000U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:332px;"><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-penicillin-streptomycin-10-000-u-ml-3/15140122">15-140-122</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Phalloidin-Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:253px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:332px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">RAW 264.7 cells</td>
			<td style="width:253px;">ATCC</td>
			<td style="width:332px;">TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">RPMI (Roswell Park Memorial Institute)</td>
			<td style="width:253px;">Gibco</td>
			<td style="width:332px;">61870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Saponin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS)</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>MT25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypsin-EDTA (1X) (0.05%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>&#160;85114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Zymosan-Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:253px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:332px;">Z23374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:315px;">Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>155361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glasstic slide 10 with grids</td>
			<td>Hycor</td>
			<td>87144</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the early stages of phagocytosis

Le corps d&#39;un mammifère est équipé de diverses couches de mécanismes qui aident à se défendre contre les invasions de pathogènes. Phagocytes professionnels du système immunitaire - telles que les neutrophiles, les cellules dendritiques et les macrophages - conservent la capacité innée à détecter et à éliminer les pathogènes envahissants par phagocytose 1. Phagocytose implique des événements chorégraphiés de réorganisation de la membrane et l&#39; actine remodelage à la surface des cellules 2, 3. Phagocytes internaliser avec succès et éliminer les molécules étrangères que lorsque toutes les étapes de la phagocytose sont remplies. Ces étapes comprennent la reconnaissance et la liaison de l&#39;agent pathogène par les récepteurs de reconnaissance des formes (PRR) demeurant à la surface cellulaire, la formation de la coupe phagocytaire par actine enrichi protubérances membranaires (de pseudopodes) pour entourer les particules, et la scission du phagosome suivie par phagolysosome maturation qui les résultats dans letuant de l&#39;agent pathogène 3, 4. L&#39;imagerie et la quantification des différentes étapes de la phagocytose joue un rôle déterminant pour l&#39;élucidation des mécanismes moléculaires de ce processus cellulaire. Le présent manuscrit rapporte des méthodes pour étudier les différentes phases de la phagocytose. Nous décrivons une approche basée sur un microscope à visualiser et de quantifier la liaison, la formation de tasse phagocytaire, et l&#39;internalisation des particules par les phagocytes. Phagocytose se produit lorsque les récepteurs des cellules phagocytaires innées rencontrent des ligands sur une particule cible supérieure à 0,5 um, les essais présentés ici comprennent l&#39;utilisation de champignons pathogènes de Candida albicans et d&#39; autres particules telles que des billes zymosan et recouvertes d&#39; IgG.

Procédé à base de microscope pour contrôler les différentes étapes de la phagocytose est présentée. Les différents événements au cours de la phagocytose des diverses particules fluorescentes par des cellules DC2.4 sont présentés. En utilisant les techniques décrites ici, nous avons étudié le rôle des sphingolipides dans les premiers stades de la phagocytose. A cet effet, DC2.4 cellules dendritiques génétiquement déficientes en Sptlc2, l&#39;enzyme qui catalyse la première et l&#39;étape limitant la...

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Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 &#181;m including zymosan and IgG-coated beads.

Visualiser les premiers stades de la phagocytose

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.5K vues.  Oregon Health & Science University. Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 µm including zymosan and IgG-coated beads.

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Layers of Symbiosis - Visualizing the Termite Hindgut Microbial Community

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth.  Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth. Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

Couches de Symbiose - Visualisation de la communauté microbienne Termite Intestin postérieur

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different ...

Recherche

Biologie

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

Visualiser le Live Drosophile Gliales-jonction neuromusculaire avec des colorants fluorescents

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Visualiser le cœur battant Drosophile</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualisation de localisation de l&#39;ARN Xenopus Les ovocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. Tracking fiducial markers on the surfaces of these cellular sheets is a well-established method for estimating morphogenetic quantities such as growth, contraction, and shear. However, not all surface labeling techniques are readily adaptable to conventional imaging modalities and possess different advantages and limitations. Here, we describe two labeling methods and illustrate the utility of each technique. In the first method, hundreds of fluorescent labels are applied simultaneously to the embryo using magnetic iron particles. These labels are then used to quantity 2-D tissue deformations during morphogenesis. In the second method, polystyrene microspheres are used as contrast agents in non-invasive optical coherence tomography (OCT) imaging to track 3-D tissue deformations. These techniques have been successfully implemented in our lab to studythe physical mechanisms of early head fold, heart, and brain development, and should be adaptable to a wide range morphogenetic processes.

This article describes surface labeling and ex ovo tissue culture in the early chick embryo. Techniques amenable to time-lapse bright field, fluorescence, and optical coherence tomography imaging are presented. Tracking surface labels with high spatiotemporal resolution enables kinematic quantities such as morphogenetic strains (deformations) to be calculated in both two and three dimensions.

Suivi des déformations des tissus morphogénétiques dans l&#39;embryon de poulet Early

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Vivre imagerie cellulaire de l&#39;autophagie premiers événements: Omegasomes et au-delà

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and memory and learning4,5,6. As the only songbird with a sequenced genome, the zebra finch has great potential for use in developmental studies; however, the early stages of zebra finch development have not been well studied. Lack of research in zebra finch development can be attributed to the difficulty of dissecting the small egg and embryo. The following dissection method minimizes embryonic tissue damage, which allows for investigation of morphology and gene expression at all stages of embryonic development. This permits both bright field and fluorescence quality imaging of embryos, use in molecular procedures such as in situ hybridization (ISH), cell proliferation assays, and RNA extraction for quantitative assays such as quantitative real-time PCR (qtRT-PCR).&#160;This technique allows investigators to study early stages of development that were previously difficult to access.

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications.

Dissection et analyse en aval de Zebra Finch embryons aux premiers stades de développement

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis comme un modèle pour identifier traduction Dépréciation

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments for T2D, more physiologically relevant in vitro adipocyte models are required. This study describes a new technique to isolate and culture mature human adipocytes. This method is entitled MAAC (membrane mature adipocyte aggregate culture), and compared to other adipocyte in vitro models, MAAC possesses an adipogenic gene signature that is the closest to freshly isolated mature adipocytes. Using MAAC, adipocytes can be cultured from lean and obese patients, different adipose depots, co-cultured with different cell types, and importantly, can be kept in culture for 2 weeks. Functional experiments can also be performed on MAAC including glucose uptake, lipogenesis, and lipolysis. Moreover, MAAC responds robustly to diverse pharmacological agonism and can be used to study adipocyte phenotypic changes, including the transdifferentiation of white adipocytes into brown-like fat cells.

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC

Membrane mature adipocyte aggregate culture (MAAC) is a new method to culture mature human adipocytes. Here we detail how to isolate adipocytes from human adipose and how to set up MAAC.

Isolement et culture des adipocytes matures humains utilisant les cultures agrégées d’adipocytemûr mûr de membrane (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...

A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution of specific genes to brain development and function increases. Relying on mouse models to study the role of specific genetic manipulations is not always feasible since transgenic mouse lines are quite costly and many novel disease-associated genes do not yet have commercially available genetic lines. Additionally, it can take years of development and validation to create a mouse line. In utero electroporation offers a relatively quick and easy method to manipulate gene expression in a cell-type specific manner in vivo that only requires developing a DNA plasmid to achieve a particular genetic manipulation. Bilateral in utero electroporation can be used to target large populations of frontal cortex pyramidal neurons. Combining this gene transfer method with behavioral approaches allows one to study the effects of genetic manipulations on the function of prefrontal cortex networks and the social behavior of juvenile and adult mice.

The role of recently discovered disease-associated genes in the pathogenesis of neuropsychiatric disorders remains obscure. A modified bilateral in utero electroporation technique allows for the gene transfer in large populations of neurons and examination of the causative effects of gene expression changes on social behavior.

Un pipeline utilisant l’électroporation bilatérale in utero pour interroger les influences génétiques sur le comportement des rongeurs

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution ...