La principal ventaja de esta técnica es que permite distinguir proteínas de actividades similares que tienen diferentes roles, dependiendo de la localización en sobre, estroma, o membranas tilakoide. Generalmente, los individuos nuevos en este método lucharán, porque utilizarán plantas que son demasiado viejas, mezclarán la hoja durante demasiado tiempo, o no tendrán cuidado al volver a suspender los pellets de cloroplasto intacto, pero frágil. La demostración visual de este método es crítica, ya que la carga o recuperación de fracción de percoll o en los pasos de gradiente de sacarosa son difíciles de aprender.
Debido al riesgo de mezcla de los gradientes y por lo tanto de contaminación cruzada de las diversas subcá fracciones de cloroplasto. Demostrando el procedimiento será por Imen Bouchnak, un estudiante de doctorado de nuestro laboratorio y Lucas Moyet, un ingeniero de interior. Para empezar, cultivar plantas de arabidopsis durante cinco semanas con un ciclo de luz de 12 horas a 23 grados centígrados en el día y 18 grados centígrados en la noche, con una intensidad de luz de 150 micromoler por metro cuadrado por segundo.
Al día siguiente, pre-pesar un vaso de precipitados de cinco litros y luego colocarlo en hielo. Cosecha las hojas de arabidopsis, asegurándote de evitar recoger cualquier suelo. Vuelva a pesar el vaso de precipitados y registre el peso tisular.
Transfiera las hojas cosechadas a una sala fría. Colocar las hojas en una licuadora que contenga dos litros de tampón de molienda y homogeneizarlas mezclando a alta velocidad tres veces durante una duración de dos segundos cada vez. Coloque cuatro capas de muselina y una capa de tex azul de nylon en un colador y esto para filtrar el homogeneizar.
Apriete suavemente las hojas mezcladas dentro de la muselina y el tex azul para extraer todo el líquido. Recuperar el tejido restante en la taza de la licuadora y repetir el proceso de homogeneización utilizando un tampón de molienda fresca. Utilice de cuatro a cinco capas de muselina nueva para filtrar este nuevo homogeneizado en un nuevo vaso de precipitados como se describió anteriormente.
Distribuya el extracto de célula bruta por igual en seis botellas de 500 mililitros. Coloque las botellas sobre hielo. Centrifugar las botellas refrigeradas a 2070 G y cuatro grados centígrados durante dos minutos.
Después de esto, deseche suavemente el sobrenadante. Utilice una bomba de agua para aspirar cualquier sobrenadante restante y mantener los pellets, que contienen cloroplasto crudo concentrado, sobre hielo. Con una pipeta de 10 mililitros, agregue tres mililitros de medio de lavado a cada botella, asegurándose de no utilizar puntas de pipeta finas para evitar romper los cloroplastos.
Luego, usa un pincel de pintura o una espátula de plástico curva para reabrir suavemente los pellets. Con una pipeta de 10 mililitros, recoja los cloroplastos re-suspendidos en un solo tubo. Invierta suavemente el tubo para obtener una suspensión homogénea de cloroplasto.
Para comenzar, utilice una pipeta de 10 mililitros para cargar lentamente seis mililitros de la suspensión de cloroplasto encima de cada uno de los seis gradientes de percoll preparados. Usando un rotor de cubo oscilante, centrifugar los gradientes a 13, 300 G y cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Utilice una bomba de agua para aspirar la fase superior, que contiene cloroplastos rotos y mitocondrias intactas.
Luego, utilice una pipeta de 10 mililitros para recuperar los cloroplastos intactos presentes en la fase inferior, teniendo cuidado de no aspirar los núcleos y los desechos celulares encontrados en la parte inferior del tubo junto con los cloroplastos intactos. Diluir la suspensión de cloroplasto intacta de tres a cuatro veces con medio de lavado. Conservar aproximadamente 10 mililitros de una alícuota de fracción de cloroplasto intacta para su posterior análisis por SDS-Page e hinchazón occidental.
Centrífuga a 2070 G y cuatro grados centígrados durante dos minutos. Después de esto, deseche suavemente el sobrenadante. Utilice una bomba de agua para aspirar cualquier sobrenadante restante y mantener el pellet, que contiene cloroplastos crudos concentrados, sobre hielo.
Para anide los cloroplastos intactos purificados, vuelva a suspender el pellet en un medio hipotónico que contenga inhibidores de la proteasa. Transfiera los cloroplastos re-suspendidos a un tubo de halcón de 10 mililitros. Prepare el degradado de sacarosa como se describe en el protocolo de texto.
Usando una bomba peristáltica, cargue lentamente tres mililitros de los cloroplastos de lesed en la parte superior de cada uno de los gradientes de sacarosa preformados. Utilice el tampón medio hipotónico para equilibrar pares de tubos, y luego ultra-centrifugar el gradiente a 70.000 G y cuatro grados Celsius durante una hora. Tomar una alícuota de las proteínas estromales solubles que se utilizarán en la determinación de la concentración de proteínas.
A continuación, utilice una bomba de agua para aspirar la fase superior restante del gradiente hasta la banda amarilla. Usando una pipeta, recupere la banda amarilla, que es el sobre. Tire de los sobres en un tubo.
A continuación, retire la fase restante del degradado hasta el pellet tilakoide. Re-suspender los pellets tilakoid en tampón de lavado de membrana con inhibidores de la proteasa. Diluir la suspensión tilakoide y sobre tres a cuatro veces con medio de lavado, ajustando el volumen final a 10 mililitros.
Equilibre los pares de tubos con tampón de lavado de membrana y los centrifuga a 110.000 G y cuatro grados Centígrados durante una hora. Después de esto, utilice una bomba de agua para aspirar cuidadosamente el sobrenadante. Añadir aproximadamente 100 microlitros de tampón de lavado de membrana al pellet de sobre.
Entonces, aspira el sobrenadante del tubo tilakoide. Vuelva a suspender los pellets tilakoide en tres mililitros de tampón de lavado por membrana. Almacene los tres subconte compartimentos purificados en nitrógeno líquido para su uso en experimentos posteriores.
Después de que las fracciones de membrana se recuperan, se lavan y se concentran, SDS-Page se utiliza para cuantificar las proteínas y analizar la composición de las cuatro fracciones. La proteína más abundante del estroma es RBCL, y los resultados representativos muestran el resultado esperado, que muy poco de la gran subunidad de esta proteína está contenida en las fracciones de tilakoide y membrana de sobre. Las proteínas complejas de recolección ligera son abundantes componentes tilakoide que apenas deben contaminar las membranas envolventes.
Por último, el translocador de fosfato de trío de fosfato sólo es visible en la fracción de envolvente purificada, debido a su fuerte enriquecimiento en la fracción del sobre en comparación con todos los extractos de cloroplasto. La contaminación cruzada de los tres subcompartimentos, la reductoisomerasa soluble de ketol-ácido del estroma, la envolvente de cloroplasto ATPase y la ligera cosecha de proteínas complejas de las membranas tilakoide se pueden cuantificar mediante el uso de análisis de inmunoblotting y espectrometría de masas. Mientras que el estroma no suele estar contaminado por fracciones de sobre o tilakoide, las fracciones de envolvente purificadas contienen 3%proteínas tilakoide y hasta un 10% de proteínas del estroma.
Los tilakoids están mal contaminados por proteínas del estroma, pero contienen hasta el 3% de las proteínas de la membrana del sobre. Los cloroplastos realizan muchas funciones cruciales como la asimilación de carbono, azufre y nitrógeno, así como la síntesis de metabolitos esenciales. Con el fin de descifrar nuevos mecanismos reguladores que controlan la fisiología del cloroplasto, definir la localización de la surplastia de las proteínas de cloroplasto es fundamental para los estudios super-dirigidos.
Los cloroplastos contienen varios subconterinos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cloroplasto, como donde se encuentra una proteína de cloroplasto específica dentro del orgánulo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar conducir todos los pasos de aislamiento de cloroplasto a cuatro grados para remitir la resistencia protea en fracciones purificadas.
Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como los enfoques proteómicos de lascare para responder a preguntas adicionales como la composición y la dinámica del proteomo de los valores subcontenedores de plastid. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la fisiología vegetal exploraran muchos aspectos diferentes de la biogénesis del cloroplasto y funcionaran utilizando el análisis específico de las proteínas candidatas identificadas dentro de los subcontenedores de plastid. No olvides que trabajar con licuadora de volumen, nitrógeno líquido, en compuestos específicos como inhibidores de la proteasa, requiere un cuidado especial.
Precauciones como usar guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad siempre deben tomarse durante el procedimiento.
