Name: studying the protein quality control system of d. discoideum using temperature-controlled live cell imaging
Uploaded: 2016-12-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
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1. Preparación de la célula <ol><li> Las células que crecen <ol><li> Crecer D. discoideum células en medio AX a 23 ° C bajo luz en placas de cultivo de tejidos. Evitar mantener las células a altas densidades superiores a 75% de confluencia. NOTA: Para obtener una respuesta óptima al estrés térmico, las células necesitan estar en la fase de crecimiento exponencial y no deberían haber alcanzado la fase estacionaria. </li><li> El día antes de exponer, las células se dividieron en medio de fluorescencia baja (LFM) a 1 x 10 4 células / ml. NOTA: Este paso es necesario para reducir la fluorescencia de fondo causado por el medio de AX. El tiempo de incubación puede ser reducido a un mínimo de 2 horas. Sin embargo, las vesículas se recogió en medio AX todavía puede generar un poco de señal de fondo después de 2 horas. </li></ol></li><li> Las células se preparan para la microscopía <ol><li> Antes de imágenes, las células de la cosecha de la placa en el tejido LFM y la transferencia de un número adecuado de células en placas de fondo de cristal. NOTA: Por lo general,1 x 10 5 células / ml es suficiente; Sin embargo, si la configuración experimental requiere periodos largos de formación de imágenes (más de 8 horas), el número de células necesitan ser ajustados cuidadosamente, como D. discoideum células pasará al ciclo de desarrollo y empezar a transmitir y global si el número de células son altos mientras que los nutrientes son bajos. </li><li> Permitir que las células se asienten durante 20 minutos. Eliminar las células no resueltos por la sustitución con cuidado el medio utilizado con medio fresco. </li></ol></li></ol> 2. Imaging NOTA: El protocolo se puede utilizar en sistemas de gran campo, así como en las configuraciones de microscopía confocal. El uso de una caja de incubación de temperatura controlada que cubre los objetivos y la platina del microscopio es útil, sin embargo, no es esencial para el control de la temperatura. La temperatura de la caja de incubación se ajusta a la temperatura más alta utilizada en el experimento, por ejemplo, a 40 ° C si no se realiza el estrés por calor. De lo contrario, la temperatura se establece en 256; C. Los cambios de temperatura deben hacerse con anticipación para permitir que el sistema se adapte, como los cambios de temperatura durante la exploración pueden afectar el enfoque. NOTA: Durante la formación de imágenes, la temperatura se controla mediante una cámara de enfriamiento. La temperatura predeterminada para obtener imágenes de células no estresado es de 23 ° C. Para las condiciones de estrés por calor, la temperatura se aumenta en consecuencia al nivel deseado. El elemento piezoeléctrico en la cámara de enfriamiento puede responder muy rápidamente a la cambio de temperatura. Sin embargo, el enfoque de las imágenes va a cambiar ligeramente (que puede desviarse a un máximo de 20 micras dependiendo del cambio de temperatura). Por lo tanto se requiere reorientación manual de dentro de los primeros minutos de adquisición de imágenes, a menos que el microscopio usado está equipado con un hardware de enfoque automático. <ol><li> La adquisición de imágenes en condiciones no estresadas <ol><li> celdas de imagen en condiciones sin estrés a 23 ° C, adquieren un mínimo de 6 campos de visión (FOV). NOTA: condición no el estrés puede ser visualized mediante la grabación de un corto lapso de tiempo (5-30 min) o la adquisición de imágenes fijas representativas. Para cada línea celular condición o adquirir un mínimo de 6 campos de visión (FOV). NOTA: En el caso de las células individuales son de interés, la posición de las respectivas células en el medio de la FOV y grabar una serie de baldosas 3 x 3 con el campo de visión que contiene las células de interés en el medio D.. discoideum células son móviles y pueden migrar fuera del campo de visión. Sin embargo, la serie de baldosas de 3 x 3 aumenta el área potencialmente explorado por la célula de interés y sigue siendo detectable por períodos de lapso de tiempo de ~ 6 horas. </li><li> Adquirir z-pilas de máximo 7 micras de 1-0.25 m pasos para capturar todo el volumen de la célula. </li><li> Adquirir una imagen de referencia de campo claro para evaluar el número total de células. </li></ol></li><li> La adquisición de imágenes de estrés por calor <ol><li> Ajustar la temperatura de la cámara de enfriamiento a 30 ° C de acuerdo con las instrucciones del fabricante. &lt;/ Li&gt; <li> Después de la exhibición de la temperatura ha alcanzado el valor deseado, vuelva a enfocar manualmente en el canal de campo claro y se les presentarán todas las FOV registrados antes de iniciar el lapso de tiempo. </li><li> Iniciar un lapso de tiempo de 4 horas de estrés por calor con un intervalo de tiempo de 5-10 minutos entre los puntos de tiempo. Compruebe el correcto enfoque durante la adquisición de los dos primeros puntos de tiempo. </li></ol></li><li> La adquisición de imágenes durante la recuperación <ol><li> Después de estrés por calor, reducir la temperatura de nuevo a 23 ° C, esperar a que el indicador de temperatura para ajustar y reorientar manualmente. </li><li> Grabar películas a intervalos en la fase de recuperación de 8-10 horas en intervalos de tiempo de 10-20 min. Compruebe el correcto enfoque durante la adquisición del primer punto de tiempo. </li></ol></li></ol> Análisis 3. Imagen NOTA: Para cuantificar el número de células que albergan focos citosólica, evaluar el número total de células y el número de células con focos citosólica en cada momentomarco. Debido a la dificultad de la segmentación de las células a partir de imágenes de campo claro, la cuantificación que hay que hacer manualmente. En lo que sigue, se describe el análisis de datos para el paquete libre de procesamiento de imagen ((http://fiji.sc/Fiji). Se requiere el plugin &quot;Cell Counter&quot; (http://fiji.sc/Cell_Counter). <ol><li> Evaluar número total de células <ol><li> Cargar la pila brillante imagen de campo (XYT) haciendo clic en &quot;Archivo&quot; y &quot;Abrir&quot;. </li><li> Abra el &quot;Cell Counter&quot; plug-in ( &quot;plugins&quot; - &quot;Cell Counter&quot;). Cargar la pila de la imagen haciendo clic en &quot;Inicializar&quot;. </li><li> Elegir el tipo adecuado de contadores, marcando la casilla correspondiente. NOTA: El uso de tipo 1 como contador para el número total de células y tipo 2 como contador de células con focos citosólica. Contar todas las células. </li><li> Guardar los marcadores haciendo clic en &quot;Guardar&quot; marcadores. </li></ol></li><li> Evaluar el número de células con focos citosólica <ol> &lt;li&gt; Carga la HyperStack imagen de fluorescencia (XZYT) ( &quot;Archivo&quot; - &quot;Open&quot;) y hacer una proyección de intensidad máxima con el &quot;Z-proyector&quot; (Imagen / Pilas). </li><li> Abrir el plugin &quot;Cell Counter&quot;. Cargar la pila de la imagen resultante (XYT) haciendo clic en &quot;Inicializar&quot;. </li><li> Cargar los marcadores haciendo clic en &quot;Marcadores de carga&quot;. PRECAUCIÓN: Los nombres de archivo de la imagen de referencia y la pila de fluorescencia deben ser idénticos. Si es necesario, cambiar el nombre en consecuencia antes de inicializar la pila de imágenes. </li><li> Elegir el tipo de marcador apropiado (véase 3.1.3) y contar las células con focos citosólica. Los marcadores existentes se pueden utilizar como guía para la posición de las células individuales. </li><li> Recuperar el número de cuentas por rebanada haciendo clic en &quot;Resultados&quot; y guardar los recuentos en otro lugar para otros cálculos. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

El protocolo descrito aquí se puede utilizar para estudiar el comportamiento de una proteína particular de interés en respuesta al estrés inducida por calor. Aumento de la temperatura a 30 ° C ha sido reportado para desencadenar la respuesta de estrés de calor y bajo estas condiciones, la viabilidad de D. discoideum se reduce notablemente. modificaciones El protocolo puede ser modificado para comparar el comportamiento de diferentes proteínas en las mismas condiciones de estrés. Para esto, las células que expresan diferentes proteínas con la misma etiqueta fluorescente se transfieren en placas de múltiples pocillos, tal como cuatro platos de cámara (sección 1.3.1). El protocolo también se puede aplicar sobre las células proteínas con diferentes marcadores, tales como GFP o RFP co-expresan. Esto puede ser por ejemplo utilizado para monitorear el comportamiento de los diferentes componentes del sistema de control de calidad de la proteína (PQC). Las células que expresan el marcador agregación BPA de etiquetado y diferentes componentes PCQ RFP-etiquetados se pueden observar utilizando múltiples pocillosen forma de plato para la imagen. Esto asegura las mismas condiciones de estrés (velocidad de aumento de la temperatura / disminución, la duración de la temperatura de aumento / disminución) y permite estudios comparativos. Además, el protocolo se puede utilizar para estudiar la influencia del sistema de PQC en la respuesta al estrés de calor. La actividad de los componentes puede ser modulado por cambios en los niveles de expresión utilizando herramientas genéticas tales como knock-out o sobreexpresión o mediante el uso de inhibidores específicos disponibles en el mercado 6. El proteasoma puede ser inhibida por la adición de MG132 (100 M) o lactacistina (10 M) al medio de crecimiento. La chaperona Hsp90 puede ser inhibida usando geldanamicina (6 M) o radicicol (10 M). La chaperona Hsp70 puede inhibirse con VER-155 088, aunque no pudimos confirmar la eficacia de la inhibición en nuestras condiciones experimentales hasta ahora. Los inhibidores se deben añadir un día antes de formación de imágenes y las células se incuban durante 14 hr. Criti<html> Cal pasos dentro del Protocolo El paso crítico para la evaluación de la perturbación inducida por calor es el estado de las células antes del experimento de formación de imágenes. Los estudios en levadura mostraron que las células adquieren resistencia a una variedad de problemas ambientales durante la fase estacionaria 13. También se observó la capacidad de respuesta mínima al estrés térmico aplicado si D. discoideum células habían alcanzado la fase estacionaria antes de la imagen. Por lo tanto, el mantenimiento de un número constante de celda &lt;5 x 10 5 células / ml es crítica. Por otra parte, el número de células altas pueden inducir la transición del ciclo vegetativo de D. discoideum con el ciclo de desarrollo, lo que desencadena vías de hambre, lo que podría dar lugar a una respuesta diferente al estrés por calor. Si se alcanzan altos números de células en la fase de recuperación después de estrés por calor, streaming y células de agregación pueden interferir con el análisis de datos como las células se mueven fuera de foco (véase la Figura 4). contenido &quot;&gt; limitación de la técnica La pérdida de enfoque es el cuello de botella del protocolo. Durante los cambios de temperatura, el plano focal puede cambiar drásticamente, lo que requiere reorientación manual en un período de tiempo inmediatamente después de cambiar la temperatura. El salto en el enfoque a veces puede ser demasiado extrema para ser vencido por el enfoque automático de software, especialmente si el tiempo entre los puntos de tiempo es alta. Sin embargo, si el microscopio usado está equipado con un enfoque automático hardware, este cuello de botella puede ser evitado. Importancia de la técnica con respecto a los métodos existentes En comparación con las configuraciones existentes, tales como el uso de habitaciones con aire acondicionado, cajas de incubación a temperatura controlada relativas a los objetivos y las etapas platina del microscopio o con control de temperatura y collares objetivos, el uso de una cámara de enfriamiento proporciona un control más preciso del ambiente temperatura. El elemento Peltier en la cámara de refrigeración puede mantener una tem constante y uniformetura a lo largo de la configuración experimental. En configuraciones clásicas, las diferencias de temperatura locales podrían dar lugar a resultados diferentes de observación. Además, se puede responder de forma rápida y rápidamente a los cambios inducidos en la temperatura, mientras que las configuraciones clásicas se adaptan muy lentamente a los cambios inducidos por la temperatura, especialmente la reducción de la temperatura. El elemento Peltier en la cámara de enfriamiento también puede cubrir una gama más amplia de temperatura (15-40 ° C) que las configuraciones clásicas, con el que las temperaturas que alcanzan tales como 15 ° C o 40 ° C es muy difícil. Dictyostelium discoideum es particularmente sensible a la foto-toxicidad. Estudios previos han usado ascorbato como eliminador para reducir la fototoxicidad. Sin embargo, los períodos de formación de imágenes largas requieren suplementos adicionales. Por otra parte, el uso de ascorbato se limita a estudios en los que el mecanismo de interés no se ve afectada por el suplemento antioxidante. Proponemos que la imagen de temperatura controlada se puede utilizar como una alternativa aproxoach para minimizar foto-toxicidad y se podría combinar con la adición de ascorbato para disminuir aún más la toxicidad. efectos fototóxicas pueden minimizarse proporcionando una temperatura constante y uniforme de 23 ° C usando una cámara de enfriamiento. Las células imágenes utilizando el control de temperatura muestran menos signos de foto-toxicidad, tal redondeo celular, por un período de tiempo más largo. Esto también permite obtener imágenes con intensidades más altas, intervalos de tiempo más cortos o más campos de visión (FOV). Aplicacion General El estrés por calor a temperaturas más altas se ha demostrado para desencadenar una respuesta de estrés diferente de calor 14. Por lo tanto, aumentando la temperatura hasta 34 ° C o 37 ° C podría inducir una respuesta diferente. Además del estrés temperatura aplicada, la duración de una situación de estrés en particular puede ser modificado para estudiar la respuesta inmediata o adaptación a largo plazo al estrés por calor. En general, el protocolo descrito puede serexpandido a una amplia gama de aplicaciones. Dado que el control preciso de la temperatura reduce considerablemente efectos de foto-tóxico, el protocolo se puede utilizar en entornos que requieren altos tiempos de exposición y / o intensidades de luz de excitación más altos, por ejemplo, para la visualización de las proteínas con un bajo nivel de expresión, o en combinación con intervalos de tiempo cortos entre las imágenes, por ejemplo, cuando se toman imágenes de lapso de tiempo. También puede ser ventajoso para obtener imágenes de objetos que abarcan toda la célula, por ejemplo, los microtúbulos, ya que estos ajustes requieren un alto número de z secciones ópticas.

Dictyostelium discoideum amebas son solitarios la vida del suelo que se alimentan de bacterias y otros microorganismos, que son absorbidos por fagocitosis. Tiene un ciclo de vida única y singular que ha sido un área importante de la investigación desde su descubrimiento 1. El interés en el desarrollo temprano multicelular 2 y la base molecular de la quimiotaxis 3 pronto se complementa con estudios centrados en la motilidad celular, la polaridad celular, la inmunidad innata. Además, D. discoideum se introdujo como un sistema modelo para la investigación biomédica 4,5. Recientemente, hemos establecido D. discoideum como un nuevo sistema para estudiar el sistema de control de 6,7 calidad de la proteína (PQC). Su proteoma está enriquecida en proteínas priónicas-como agregación propensos, lo que plantea un reto al control de calidad de las proteínas 8. Para investigar si D. discoideum ha desarrollado mecanismos moleculares especiales para controlar su muy agproteoma congregación propensas, se estudió el comportamiento de las proteínas marcadoras agregación propensos tanto en condiciones de crecimiento normales y durante el estrés. Condiciones de estrés, tales como el estrés por calor, se pueden utilizar para aumentar la tasa de proteínas misfolding 9. Por lo tanto, se buscó un sistema en el que podríamos inducir cambios de temperatura y al mismo tiempo seguir el comportamiento de las proteínas marcadoras. Para este propósito, se combinaron imágenes de células vivas con calefacción controlada por sistema Peltier utilizando una (cámara de enfriamiento) inserto etapa térmica. Este método nos permitió mantener una temperatura constante y uniforme, así como para inducir un cambio rápido, pero precisa de la temperatura. Imágenes de células vivas se utiliza para estudiar una variedad de procesos biológicos en D. discoideum. Sin embargo, este enfoque se enfrenta a dos limitaciones importantes. En primer lugar, las células muestran un alto motilidad y tienden a migrar fuera del campo de visión, el seguimiento tanto de las células individuales a menudo requiere de formación de imágenes de un área grande. La movilidad celular puedereducirse en agar de recubrimiento 10, sin embargo, estas condiciones no son adecuadas para formación de imágenes a largo plazo debido a una disminución de la viabilidad. En segundo lugar, D. discoideum células muestran una particularmente alta sensibilidad a la foto-toxicidad, lo que resulta en el redondeo celular y detención mitótica 11. Protocolos anteriores abordan este problema mediante la adición de ascorbato como un eliminador de radicales y reducción de los tiempos de exposición 12. Este último puede ser crítica si la proteína de interés se expresa en niveles bajos y muestra una señal de fluorescencia débil. Los autores también sugieren para proporcionar una temperatura constante de 21 ° C, ya sea por formación de imágenes en una habitación con aire acondicionado o mediante el uso de cajas de incubación a temperatura controlada, que cubren la etapa objetiva y microscopio 12. A continuación, describimos un método con control de temperatura mejorado mediante el uso de una cámara de enfriamiento ajustado a 23 ° C. Durante una imagen nuestra puesta a punto mejora significativamente la resistencia a la fototoxicidad. Esopermite el uso de los tiempos de exposición superiores e intensidades de luz de excitación más altos. Esto es de particular importancia cuando se toman imágenes de lapso de tiempo, ya que los intervalos de tiempo tienen que ser sopesado frente a la cantidad de puestos fotografiados y el tiempo de exposición utilizado. La posibilidad de aumentar el número de posiciones fotografiadas también permite la cobertura de un área de imagen más ancho y facilita el seguimiento de las células individuales en un periodo de tiempo más largo.

<table><tbody><tr><td>AX Medium</td><td>ForMedium</td><td>AXM0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo medium</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma</td><td>C2211</td><td></td></tr><tr><td>Lactacystin</td><td>Sigma</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Geldanamycin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200617</td><td></td></tr><tr><td>Radicicol</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200620</td><td></td></tr><tr><td>MatTek disch 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>glass bottom imaging dish</td></tr><tr><td>CellViell cell culture dish</td><td>Greiner</td><td>627870</td><td>4-compartment glass-bottom imaging dish</td></tr><tr><td>Thermal Stage Heater/Cooler Insert</td><td>Warner Istruments</td><td>TB-3/CCD</td><td></td></tr><tr><td>Bipolar temperature controller</td><td>Warner Istruments</td><td>CL-100</td><td></td></tr><tr><td>Liquid cooling System</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td></td></tr></tbody></table>

studying the protein quality control system of d. discoideum using temperature-controlled live cell imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

El protocolo de formación de imágenes descrito se puede utilizar para analizar el comportamiento de las proteínas priónicas como agregación propensos en la ameba D. discoideum durante el estrés por calor. La Figura 1 muestra la distribución de poliglutamina Q103 proteína GFP-etiquetado en las células en condiciones de crecimiento normales (Figura 1A), después de 2 horas de estrés por calor a 30 ° C (Figura 1B) y después de 6 horas de recuperación estrés y crecimiento en condiciones de crecimiento normales (Figura 1C). Al aumento de la temperatura desde 23 ° C a 30 ° C, el marcador Q103-GFP se une de una distribución difusa a punctata estructuras. Tras la liberación del estrés y el crecimiento a temperatura normal, estas estructuras se disuelven. La redistribución de Q103-GFP y la formación de estrés inducido por calor focos citosólica se pueden cuantificar usando análisis de imágenes. La figura 2A muestra el análisis de FOV individuales utilizando Fiji y el plugin &quot;Cell mostrador &quot;. La figura 2B muestra la cuantificación de la respuesta al estrés de calor. Esto demuestra que el aumento de focos Q103-GFP citosólico en serie con la continuación de estrés por calor. Durante el estrés por calor, el sistema (CMC) de control de calidad de la proteína es abrumado, por tanto, agregación- proteínas propensas como el Q103 proteína prión-como no se pueden mantener en un estado soluble y cada vez agregada en focos citosólica. las células también muestran un redondeo característica, como se muestra en la Figura 1B. la reducción de focos citosólica después de la eliminación del estrés sugiere que el agregado proteínas se disuelven. La calidad de la imagen es sensible a la densidad celular inicial. Figura 3 muestra un ejemplo de las células después de la recuperación de estrés, la comparación de la densidad adecuada inicial de células (Figura 3A) y la densidad celular inicial alta (Figura 3B). Si la densidad celular inicial era demasiado alto, las células estrellated para formar corrientes como se muestra en la Figura 3b. Este que impone dificultades en la posterior cuantificación medida que las células se han trasladado fuera del plano focal. El método descrito se puede utilizar para controlar los cambios inducidos por la temperatura como se describe anteriormente. También se puede utilizar para reducir la foto-toxicidad cuando la formación de imágenes a temperatura crecimiento fisiológico. Figura 4 muestra una comparación de células fotografiado a 23 ° C en una cámara (Figura 4A) enfriar y células fotografiado sin control de temperatura en una habitación con aire acondicionado, establece a 25 ° C (Figura 4B). Tras la exposición constante a la luz de excitación, las células completan cuando no está reflejado en las condiciones de temperatura controlada. Este cambio en la forma de la célula es lo que indica el estrés. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig1.jpg" /> Figura 1: <strong&gt; proteínas priónicas-como agregación propensos a cambiar su distribución celular durante el estrés por calor. GFP-etiquetados poliglutamina ricos huntingtina exón 1 (Q103) se expresa constitutivamente en AX2-214 D. discoideum células (señal de GFP se muestra en la tabla de búsqueda de escala de grises invertida). (A) En condiciones normales de crecimiento a 23 ° C, Q103-GFP se distribuye de manera difusa en el citoplasma. (B) Después de 2 horas de estrés por calor a 30 ° C, Q103-GFP se une en focos citosólica (flechas rojas). Las células muestran un cambio de forma característica y completan. (C) Después de la liberación del estrés y el crecimiento a 23 ° C, los focos citosólica se disuelven. Después de 6 horas, se puede observar no focos citosólica. Barra de escala = 10 micras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 2: Cuantificación de la formación de focos citosólico inducida por calor (A) Análisis de las células utilizando el paquete de procesamiento de imágenes libre de Fiji y el &quot;Cell Counter&quot; plug-in.. La cantidad total de células (tipo 1, marcadores contador azul) se determina la imagen de campo claro en. Los marcadores son cargados en el GFP-canal y el número de células con focos citosólica (tipo 2, los marcadores de contador rojo) se determina. (B) Cuantificación de los focos después de 3 h de estrés por calor a 30 ° C y 3 horas de recuperación de estrés a 23 ° C (n = 4 campos de visión, el error bar = SD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig3.jpg" /> <stron<html> g&gt; Figura 3: Efecto de la densidad celular en las imágenes de lapso de tiempo a largo plazo Las células (A) fotografiados en densidades celulares iniciales &lt;10 5 células / ml.. Después de 3 horas de estrés por calor a 30 ° C y 6 h de recuperación de la tensión a 23 ° C, las células todavía permanecen en el ciclo vegetativo y se dividen. Sólo pocas células salen del plano focal. (B) Las células de captación de imagen a densidades celulares iniciales&gt; 10 6 células / ml. Después de 9 horas de formación de imágenes (ajustes como en a), las células han entrado en el ciclo de desarrollo y comenzó el streaming y la agregación. Las células en los agregados no pueden distinguirse claramente. Una gran parte de las células sale del plano focal y no puede ser analizada. Barra de escala = 10 micras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <html> .jpg &quot;/&gt; Figura 4:. Efecto de control de la temperatura sobre los efectos fototóxicas células (A) de captación de imagen para 10 min con control de temperatura a 23 ° C: 6 campos de visión, z-stack (espaciado de 0,5 M, espesor de la muestra 8 M), lapso de tiempo (en total tiempo 10 min, lapso de 1 min), el canal de GFP (0,07 mseg tiempo de exposición, 10% la intensidad del láser), el canal de RFP (0,1 mseg tiempo de exposición, la intensidad del láser 10%). Las células no muestran signos de los cambios morfológicos característicos asociados con el estrés fototóxico. (B) Las células de captación de imagen para 10 min sin control de temperatura (mismas condiciones que en A). Las células presentan signos de fototoxicidad inducida por redondeo, lo que indica el estrés. Barra de escala = 10 micras. Las células fueron imágenes en un sistema basado en un microscopio con un objetivo 100x / 1,4 apertura numérica (NA). Las imágenes fueron recolectados con una cámara CCD como 1.024 x 1.024 píxeles, utilizando los archivos de 1 x 1 hurgar en la basura.4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Estudiar el Sistema de Control de Calidad de la Proteína<em&gt; D. discoideum</em&gt; Uso de imágenes de células vivas con temperatura controlada

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

studying-protein-quality-control-system-d-discoideum-using

Research

JoVE Journal

Biology

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

6.3K vistas.  Max-Planck Institute for Molecular Cell Biology and Genetics. The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

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Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other important cellular biology questions. The technologies available to genetically manipulate Dictyostelium cells are well-developed. Transfections can be performed using different selectable markers and marker re-cycling, including homologous recombination and insertional mutagenesis. This is supported by a well-annotated genome. However, these approaches are optimized for axenic cell lines growing in liquid cultures and are difficult to apply to non-axenic wild-type cells, which feed only on bacteria. The mutations that are present in axenic strains disturb Ras signaling, causing excessive macropinocytosis required for feeding, and impair cell migration, which confounds the interpretation of signal transduction and chemotaxis experiments in those strains. Earlier attempts to genetically manipulate non-axenic cells have lacked efficiency and required complex experimental procedures. We have developed a simple transfection protocol that, for the first time, overcomes these limitations. Those series of large improvements to Dictyostelium molecular genetics allow wild-type cells to be manipulated as easily as standard laboratory strains. In addition to the advantages for studying uncorrupted signaling and motility processes, mutants that disrupt macropinocytosis-based growth can now be readily isolated. Furthermore, the entire transfection workflow is greatly accelerated, with recombinant cells that can be generated in days rather than weeks. Another advantage is that molecular genetics can further be performed with freshly isolated wild-type Dictyostelium samples from the environment. This can help to extend the scope of approaches used in these research areas.

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum is a popular model organism to study complex cellular processes such as cell migration, endocytosis, and development. The utility of the organism is dependent on the feasibility of genetic manipulation. Here, we present methods to transfect Dictyostelium discoideum cells that overcome existing limitations of culturing cells in liquid media.

Ingeniería genética de Dictyostelium discoideum las células basada en selección y crecimiento de las bacterias

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Investigación

Genética

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and mediates the delivery of protein and DNA substrates to target cells, a process generally requiring direct cell-to-cell contact. We have recently solved the structure of the Dot/Icm apparatus by cryo-electron tomography (cryo-ET) and showed that it forms a cell envelope-spanning channel that connects to a cytoplasmic complex. Applying two complementary approaches that preserve the native structure of the specimen, fluorescent microscopy in living cells and cryo-ET, allows in situ visualization of proteins and assimilation of the stoichiometry and timing of production of each machine component relative to other Dot/Icm subunits. To investigate the requirements for polar positioning and to characterize dynamic features associated with T4SS machine biogenesis, we have fused a gene encoding superfolder green fluorescent protein to Dot/Icm ATPase genes at their native positions on the chromosome. The following method integrates quantitative fluorescence microscopy of living cells and cryo-ET to quantify polar localization, dynamics, and structure of these proteins in intact bacterial cells. Applying these approaches for studying the Legionella pneumophila T4SS is useful for characterizing the function of the Dot/Icm system and can be adapted to study a wide variety of bacterial pathogens that utilize the T4SS or other types of bacterial secretion complexes.

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Imaging of bacterial cells is an emerging systems biology approach focused on defining static and dynamic processes that dictate the function of large macromolecular machines. Here, integration of quantitative live cell imaging and cryo-electron tomography is used to study Legionella pneumophila type IV secretion system architecture and functions.

Aplicación de imágenes de células vivas y tomografía crioelectrónica para resolver las características espaciotemporales del sistema de secreción de puntos de legionela pneumofilia/Icm

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Inmunología e Infección

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D de imágenes de la agregación de proteínas en células vivas

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Biología

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Los ensayos acoplados para Monitoreo replegamiento de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Microscopía de la levadura de fisión del ciclo de vida sexual

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

Evaluación de Dictyostelium discoideum respuesta a estimulación mecánica aguda

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein subcellular localization changes; in particular, a nuclear translocation under a heat stress condition. Proteins react correspondingly to external and internal signals. A common mechanism is to change its subcellular localization. This article describes a protocol to track protein localization that does not require an antibody, radioactive labeling, or a confocal microscope. In this article, GFP is used to tag the target protein EXL-1 in C. elegans, a member of the chloride intracellular channel proteins (CLICs) family, including mammalian CLIC4. An integrated translational exl-1::gfp transgenic line (with a promoter and a full gene sequence) was created by transformation and &#947;-radiation, and stably expresses the gene and gfp. Recent research showed that upon heat stress, not oxidative stress, EXL-1::GFP accumulates in the nucleus. Overlapping the GFP signal with both the nuclei structure and the DAPI signals confirms the EXL-1 subcellular localization changes under stress. This protocol presents two different fixation methods for DAPI staining: ethanol fixation and acetone fixation. The DAPI staining protocol presented in this article is fast and efficient and preserves both the GFP signal and the protein subcellular localization changes. This method only requires a fluorescence microscope with Nomarski, a FITC filter, and a DAPI filter. It is suitable for a small laboratory setting, undergraduate student research, high school student research, and biotechnology classrooms.

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

This protocol demonstrates how to track a protein nuclear translocation under heat stress by using a green fluorescence protein (GFP) fusion protein as a marker and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining. The DAPI staining protocol is fast and preserves the GFP and protein subcellular localization signals.

Detección de localización subcelular de la proteína por etiquetado de proteína de fluorescencia verde y 4', 6-Diamidino-2-phenylindole coloración en Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

Microscopía 4D de levadura

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally important for cell function and cell integrity of neurons. Drosophila photoreceptor cells have become a model for studying membrane protein trafficking. Besides rhodopsin, which upon illumination becomes internalized from the photoreceptor membrane and is degraded, the transient receptor potential-like (TRPL) ion channel in Drosophila exhibits a light-dependent translocation between the rhabdomeral photoreceptor membrane (where it is located in the dark) and the photoreceptor cell body (to which it is transported upon illumination). This intracellular transport of TRPL can be studied in a simple and non-invasive way by expressing eGFP-tagged TRPL in photoreceptor cells. The eGFP fluorescence can then be observed either in the deep pseudopupil or by water immersion microscopy. These methods allow detection of fluorescence in the intact eye and are therefore useful for high-throughput assays and genetic screens for Drosophila mutants defective in TRPL translocation. Here, the preparation of flies, the microscopic techniques, as well as quantification methods used to study this light-triggered translocation of TRPL are explained in detail. These methods can be applied also for trafficking studies on other Drosophila photoreceptor proteins, for example, rhodopsin. In addition, by using eGFP-tagged rhabdomeral proteins, these methods can be used to assess the degeneration of photoreceptor cells.

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Here, non-invasive methods are described for localization of photoreceptor membrane proteins and assessment of retinal degeneration in the Drosophila compound eye using eGFP fluorescence.

Estudio del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de Drosophila utilizando proteínas marcadas con eGFP

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

Estudiar el Sistema de Control de Calidad de la Proteína

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Ingeniería genética de Dictyostelium discoideum las células basada en selección y crecimiento de las bacterias

Aplicación de imágenes de células vivas y tomografía crioelectrónica para resolver las características espaciotemporales del sistema de secreción de puntos de legionela pneumofilia/Icm

4D de imágenes de la agregación de proteínas en células vivas

Los ensayos acoplados para Monitoreo replegamiento de proteínas en

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Microscopía de la levadura de fisión del ciclo de vida sexual

Evaluación de Dictyostelium discoideum respuesta a estimulación mecánica aguda

Detección de localización subcelular de la proteína por etiquetado de proteína de fluorescencia verde y 4', 6-Diamidino-2-phenylindole coloración en Caenorhabditis elegans

Microscopía 4D de levadura

Estudio del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de Drosophila utilizando proteínas marcadas con eGFP