K.E.H. was supported by the Training Grant in Molecular Biology NIH-T32-GM08730. This work was supported by NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932 and AHA Award 12BGIA11930014 to T.R.

1. recoger huevos de moscas con genotipos de interés NOTA: cruces Ideal constan de 150 moscas vírgenes y al menos 75 varones. colecciones de archivo debe consistir de por lo menos 200 moscas. <ol><li> Preparar placas de uva. <ol><li> Añadir 37,5 g de agar a 1,5 L de agua destilada en un matraz de 4 L. </li><li> Autoclave mezcla de agua / agar durante 50 minutos a 121 ºC (250 ºF). </li><li> Mientras que el agua / mezcla de agar es el tratamiento en autoclave, añadir 50 g de sacarosa al jugo de uva 500 ml y se agita con una barra de agitación en una placa de agitación se calienta hasta que se disuelve la sacarosa. </li><li> Apagar el fuego y seguir removiendo para enfriar la mezcla de jugo de uva / sacarosa hasta por debajo de 70 ºC. Pruebe la temperatura interna con un termómetro de alcohol. </li><li> Añadir 3 g Drosophila agente antifúngico (por ejemplo, Tegosept) para calentar el jugo de uva mezcla / sacarosa y se agita para disolver. </li><li> Cuando el agua se mezcla / agar está fuera del autoclave, deje enfriar el matraz al tacto de remolinos de vez en cuando. </li><li&gt; Combinar la mezcla de agua / agar y mezcla de jugo de uva / sacarosa y revuelva hasta que esté bien mezclado. </li><li> Utilizar una pipeta serológica para agregar 8 - 10 ml de la mezcla de uva a la tapa de una pequeña placa de petri (estilo 35 x 10 mm). Dejar que la mezcla a la corona más alta que la altura de las paredes de la tapa para formar una forma convexa. </li><li> Permita que las placas de uva que se enfríe durante 2 horas a temperatura ambiente y luego se almacenan en un recipiente hermético a 4 ºC. </li></ol></li><li> Preparar la pasta de levadura. <ol><li> Añadir 6 ml de solución tampón de fosfato (PBS) a 4 g en vivo levadura seca activa en un tubo cónico de 50 ml y se mezcla con una espátula hasta que esté suave. </li><li> levadura tienda pegar a 4 ºC. </li></ol></li><li> Añadir una pequeña porción (aproximadamente 1/8 de cucharadita) de la pasta de levadura en el medio de una placa de uva. Suavizar los bordes ásperos con una espátula. </li><li> Colocar las placas de uva en una incubadora hasta que hayan alcanzado la temperatura ambiente. </li><li> Transferir las moscas de interés en una placa de cámara de la recolección de huevos y el lugar de uva wITH pasta de levadura hacia el interior en la parte superior. placa de uva cinta a la cámara de recogida de huevos de evitar que la placa se caiga. Asegúrese de escribir la información importante genotipo y fecha en la parte inferior de la placa de uva. </li><li> Poner de cabeza la cámara de recolección de huevos para permitir que las moscas ponen sus huevos en la placa de uva. </li><li> Coloque una caja o cubierta sobre las cámaras de recogida de huevos y colocarlos en una incubadora a 25 ºC. </li><li> Permitir que las moscas ponen huevos a 4 - 6 horas. </li><li> Extremo de recogida mediante la adopción de la placa de uva de la cámara de recolección de huevos y la transferencia de las moscas de nuevo en su botella de alimentos. Use una espátula para limpiar cualquier exceso de pasta de levadura de la placa de uva. Tienda placa de uva en una placa de Petri más grande en un incubador humidificado a 25 ° C durante ~ 24 horas. </li></ol> 2. Transferencia de larvas Experimental de Alimentos <ol><li> Preparar la comida experimental. NOTA: Esta receta de comida se basa en la Bloomington Stock receta central 18. cambios importantesque incluyen una mayor cantidad de levadura para optimizar el valor nutritivo de los alimentos según la evaluación de la sincronización de fase errante (altos de 112 - 120 horas después de la recolección de huevos a 25 ºC). Si bien hemos encontrado esta receta ideal para la salud y el desarrollo de nuestra larvas experimental, cualquier receta de comida es aceptable dada la calibración con los controles positivos y negativos, ejemplos de los cuales aparecen en el paso 3.10. <ol><li> Mide 1.600 ml de agua destilada. </li><li> Mezclar 134 g de harina de maíz, 10,6 g Agar Drosophila Tipo II, y una parte del agua (~ 500 ml) en un vaso de precipitados de 1 L. Mezclar durante 2 minutos con una batidora de mano motorizada. </li><li> Mezclar 70 g de levadura seca activa en vivo, 18,4 g de harina de soja, 84,8 g de extracto de malta, y una parte del agua (~ 500 ml) en otro vaso de precipitados de 1 l. Mezclar durante 2 minutos con una batidora de mano motorizada. </li><li> Agitar cada vaso y se vierte en un matraz de 4 l. Use agua restante para enjuagar los vasos de precipitados y agregar en el matraz. </li><li> Medir jarabe de maíz ligero de 140 ml y añadir al matraz, se mezcla por agitación. &lt;/ Li&gt; <li> Autoclave durante 50 minutos a 121 ºC (250 ºF) en el entorno líquido. </li><li> Después del autoclave, se vierte la comida en un vaso de precipitados de 4 litros y se deja enfriar. Ayudar al proceso de enfriamiento mediante la mezcla con una batidora de mano motorizada. </li><li> Una vez enfriado el frasco suficiente como para tocar, añadir 8,8 ml de ácido propiónico y 16,8 ml de solución de agente / etanol anti-hongos Drosophila. Mezclar bien. (Agrega Drosophila solución de agente anti-hongos mediante la adición de 380 g de Drosophila agente antifúngico a 1 L de etanol de prueba 200 y agitación, sobre una placa caliente hasta que se disolvió, asegurándose de que la solución no sea superior a 70 ºC.) </li><li> Verter la comida en viales hasta que la comida es de aproximadamente 1 pulgada de profundidad y se deja enfriar a temperatura ambiente durante 2 - 3 horas. Enchufe viales y almacenar en una incubadora a 25 ºC. Usar dentro de una semana. </li></ol></li><li> Sumérgete una espátula varias veces en la capa superior del vial de comida para puntuación que. Esto ayudará a las larvas de la madriguera y alimentarse. </li><li> 22 - 24 horas después de la recolección de huevos tienecomposición, utilizar un pincel pequeño para recoger 50 primer estadio (L1) larvas del mismo tamaño aproximado. Coloque larvas en el alimento experimental. Limpiar la brocha en un laboratorio toallita y asegurar que no hay larvas que queda en el pincel antes de continuar a otro genotipo. </li><li> Colocar el vial de larvas en una incubadora a 25 ° C y permitirá desarrollar. </li></ol> 3. Determinar los niveles de grasa en las larvas <ol><li> Preparar soluciones. <ol><li> Preparar 1 litro de PBS 10x de valores. <ol><li> Añadir 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, y 2,4 g KH 2 PO 4 a 800 ml de agua en un vaso de precipitados de 2 l que contenía una barra de agitación. Se agita sin calor hasta que todas las sales se incorporan. Llevar el pH a 7,4. Aumentar el volumen a 1 L con agua. </li></ol></li><li> Preparar 2 L 1x PBS. Añadir 200 ml de solución PBS 10x acciones a 1.800 ml de agua. </li><li> Utilice esta población de PBS 1x para hacer el 20% w / v de sacarosa. </li></ol></li><li> Retire el vial de las larvas de laincubadora una vez allí son 20 - 40 larvas de vagar por los lados del vial (por lo general en el quinto día después de colecciones de huevo). Registrar la fecha y hora del ensayo, así como el número de larvas errante. </li><li> Preparar la solución experimental mediante la adición de 11,5 ml de PBS y 9 ml 20% de sacarosa a un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Añadir 20% de sacarosa en el vial hasta que es 0,5 a 1 pulgada de la parte superior del vial. </li><li> Use una espátula para agitar suavemente la capa superior de alimento para las larvas libres que todavía están excavando en el alimento. Todas las larvas se elevará a la superficie de la solución de sacarosa. </li><li> El uso de fórceps para transferir suavemente las larvas en la concentración inicial de sacarosa desde el paso 3.3. </li><li> Use una espátula para remover suavemente las larvas en esta solución. </li><li> Se tapa el tubo cónico y poner de cabeza varias veces para mezclar a fondo la solución. </li><li> Destape el tubo cónico y agitar para crear un vórtice suave. </li><li> Permitir que las larvas se asiente, ya sea flotante a la parte superior de la solución o siNKing a la parte inferior. Espere de 2 - 5 min para las larvas se asiente. NOTA: Si todavía hay larvas que no son, sin duda, ya sea flote o de fondo, elegir una línea a utilizar como punto de corte para etiquetar las larvas, ya sea como un flotador o un plomo. Aplicar este mismo criterio para todos los genotipos. Utilizamos el ángulo en la parte inferior del tubo cónico como nuestro límite. Adp o sir2 17 larvas mutante se puede utilizar como un control positivo y Isd2 19 mutantes se pueden utilizar como un control negativo para la calibración del ensayo. </li><li> Registrar el número de larvas flotante y la concentración específica de la prueba. </li><li> Añadir 1 ml 20% de sacarosa a la solución experimental para aumentar su densidad. </li><li> Repita los pasos 3.7 a 3.10. Registrar el número de larvas flotantes y esta nueva concentración. </li><li> Continuar pasos 3.12 y 3.13 hasta por lo menos 95% de las larvas están flotando. </li><li> El uso de fórceps para recoger todas las larvas en un plato lleno de disección con PBS. </li><li> Observarán larvas bajo un microscopio y se nota si hay alguna pequeña larvas, pre-pupas, ninfas, o cualesquiera otras diferencias entre los genotipos. NOTA: Idealmente, todas las larvas debe aparecer homogénea y en la misma etapa de desarrollo. Sólo hemos observado mediciones de grasa consistentes en estas condiciones. </li><li> Anote el número total de larvas. </li><li> Con unas pinzas, transferir 10 larvas a un laboratorio limpie secar. Etiquetar un tubo de microcentrífuga y el lugar 10 larvas en el tubo. </li><li> Flash congelar las larvas en nitrógeno líquido. Almacenar el tubo a -20 ºC. </li></ol>

<ol>
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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+13C+Isotope+Labeling+Strategy+Reveals+the+Influence+of+Insulin+Signaling+on+Lipogenesis+in+C.+elegans.">A 13C Isotope Labeling Strategy Reveals the Influence of Insulin Signaling on Lipogenesis in C. elegans.</a> Cell Metab. 8, 266-274 (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Hay una multitud de técnicas que se han desarrollado para medir los niveles de lípidos 8-10. Sin embargo, cada uno de estos métodos viene con algunas desventajas importantes que ya están contemplados en el ensayo basado en la flotabilidad se describe anteriormente. En primer lugar, este ensayo es extremadamente rápido. Prueba de un gradiente de concentración completa tarda no más de 30 - 60 min. Esta es una gran mejora en la mayoría de las técnicas actualmente en uso. Por ejempl...

Drosophila melanogaster se ha utilizado durante más de un siglo en el estudio de la genética y otras cuestiones biológicas básicas. En las últimas décadas, se ha hecho evidente que la Drosophila es una poderosa herramienta en el estudio de muchas enfermedades humanas. Un 70 - 80% de los genes asociados con enfermedades humanas tienen un ortholog identificado mosca de 1 - 4, Drosophila proporciona un sistema simplificado aún traducible en el que estudiar las enfermedades complejas. Metabolismo, en particular, se ha beneficiado de estos estudios. No sólo son la genética del metabolismo bien conservados entre las moscas y los seres humanos, pero los órganos y tipos de células son también muy similares 2,5. Por ejemplo, la grasa corporal de las tiendas de la mosca de ambos triacilglicéridos (TAG) y glucógeno, funciones análogas a las realizadas en el hígado de los mamíferos y el tejido adiposo blanco 6. Uso de Drosophila como modelo para la obesidad humana ha mejorado enormemente nuestro conocimiento de los lípidosmetabolismo y la genética de la obesidad 7. Las larvas de desarrollo es particularmente útil para estudiar la segregación de los nutrientes en el almacenamiento o utilización, ya que está dedicado a la alimentación y el almacenamiento de energía que se utilizará durante pupariation. Actualmente, hay muchos diferentes métodos cuantitativos de determinación de los niveles de almacenamiento de grasa en Drosophila. El método más ampliamente utilizado es el ensayo colorimétrico acoplado (CCA) 8,9. CCA fue desarrollado para determinar los niveles de TAG en el suero humano y opera en la premisa de que el glicerol liberado de la columna vertebral de los triglicéridos se someterá a varias reacciones, lo que se traduce en una reacción redox acoplado a la generación de un producto coloreado. A continuación se mide la absorbancia de las longitudes de onda específicas de luz para determinar la cantidad inicial de glicerol presente. Sin embargo, el glicerol también puede ser liberada de mono y diacilglicéridos Además de TAG y por lo tanto puede no ser una medida precisa de sgrasa corporal reada 9. Por otra parte, pigmento de los ojos de las moscas adultas trituradas puede interferir con algunas lecturas de absorbancia y complicar los resultados 9,10. Por lo tanto, CCA debe ir acompañada y validado por cromatografía en capa fina (TLC), que permite la separación de la mayoría de las familias de lípidos que se puede cuantificar mediante densitometría 10,11. Sin embargo, algunas clases de lípidos como esteroles no pueden ser analizados y deben cuantificarse de manera diferente 12. Espectrometría de masas (MS) es una forma precisa para cuantificar todas las clases de los principales lípidos celulares 12,13. Sin embargo, los procedimientos de extracción de lípidos necesarias para analizar por MS consumen mucho tiempo (más la toma de casi un día completo) y costoso. Aquí presentamos un método alternativo para determinar rápida y barata niveles de grasa del organismo en las larvas L3 de Drosophila melanogaster. El método presentado a continuación explota la diferencia de densidad entre el tejido de grasa y tejido magro. fa mamíferost tejido tiene una densidad de aproximadamente 0,9 g / ml 14 mientras que el músculo esquelético como una densidad de 1,06 g / ml 15. Esta diferencia significa que los animales con las tiendas más altos de grasa tienen menor densidad que los animales con las tiendas más bajos de grasa, que les permitan una mejor flotan en una solución de densidad fija. Esta propiedad permite la detección extremadamente rápida de un gran número de animales, mientras que ser barato y no invasivo. Análisis basado en la flotabilidad se ha utilizado tanto para confirmar los fenotipos de la alteración de los reguladores conocidos de los niveles de grasa, así como para identificar nuevos reguladores genéticos y neurológicos de la obesidad 16,17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="670">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacto Agar</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">214030</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Welch&#39;s Original 100% Grape Juice</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:168px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tegosept</td>
			<td style="width:168px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20-259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>200 proof</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Baker&#39;s yeast</td>
			<td style="width:168px;">Fleichmann&#39;s</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yellow Corn Meal</td>
			<td style="width:168px;">Quaker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Enriched degerminated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Drosophila Agar Type II</td>
			<td style="width:168px;">Apex</td>
			<td style="width:119px;">66-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Soy Flour</td>
			<td style="width:168px;">ADM Specialty Ingredients</td>
			<td style="width:119px;">062-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Malt Extract</td>
			<td style="width:168px;">Breiss</td>
			<td style="width:119px;">5748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Light Corn Syrup</td>
			<td style="width:168px;">Karo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propionic Acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>U330-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:168px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50147491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium phosphate anhydrous</td>
			<td style="width:168px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S3933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 x 10mm petri plate</td>
			<td style="width:168px;">Fisher</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50mL Conical</td>
			<td style="width:168px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50-869-569</td>
			<td></td>
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a buoyancy-based method of determining fat levels in drosophila

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat in Drosophila, but most are expensive and/or laborious and have clear limitations. Here, we present a method to quickly and cheaply determine organismal fat levels in L3 Drosophila larvae. The technique relies on the differences in density between fat and lean tissues and allows for rapid detection of fat and lean phenotypes. We have verified the accuracy of this method by comparison to body fat percentage as determined by neutral lipid extraction and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GCMS). We furthermore outline detailed protocols for the collection and synchronization of larvae as well as relevant experimental recipes. The technique presented below overcomes the major shortcomings in the most widely used lipid quantitation methods and provides a powerful way to quickly and sensitively screen L3 larvae for fat regulation phenotypes while maintaining the integrity of the larvae. This assay has wide applications for the study of metabolism and fat regulation using Drosophila.

La figura 1 representa un ejemplo de cómo el ensayo basado en la flotabilidad se puede detectar tanto las reservas de grasa más altos y más bajos en las larvas manipulado genéticamente. La Figura 1A muestra que la excitación o el silenciamiento de un cierto subconjunto de neuronas (E347) en el cerebro de las larvas induce grasa inferior y superior tiendas respectivamente. El mismo control antecedentes genéticos se utilizó en ambos casos. L...

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A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Aquí presentamos un método para medir los niveles de grasa organísmicos en el tercer estadio (L3) larvas de Drosophila melanogaster. Este método aprovecha la relativamente baja densidad de tejido graso para diferenciar entre las larvas con las reservas de grasa alterados. análisis basado en la flotabilidad es una herramienta valiosa para la detección rápida, reproducible y económico.

Un método basado en la flotabilidad de la determinación de los niveles de grasa en<em&gt; Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

8.5K vistas.  University of Colorado Anschutz Medical Campus.  Aquí presentamos un método para medir los niveles de grasa organísmicos en el tercer estadio (L3) larvas de Drosophila melanogaster. Este método aprovecha la relativamente baja densidad de tejido graso para diferenciar entre las larvas con las reservas de grasa alterados. análisis basado en la flotabilidad es una herramienta valiosa para la detección rápida, reproducible y económico. 

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Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources. This complex social behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. In many organisms, aggression is critical to survival but controlling and suppressing aggression in distinct contexts also has become increasingly important. In recent years, invertebrates have become increasingly useful as model systems for investigating the genetic and systems biological basis of complex social behavior. This is in part due to the diverse repertoire of behaviors exhibited by these organisms. In the accompanying video, we outline a method for analyzing aggression in Drosophila whose design encompasses important eco-ethological constraints. Details include steps for: making a fighting chamber; isolating and painting flies; adding flies to the fight chamber; and video taping fights. This approach is currently being used to identify candidate genes important in aggression and in elaborating the neuronal circuitry that underlies the output of aggression and other social behaviors.

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

El estudio de la agresión en Drosophila (mosca de la fruta)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Investigación

Biología

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Un método simple para determinar el genotipo exacto

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

Seguimiento visual mediada olor durante el vuelo en Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Neurocircuit ensayos para las convulsiones en la epilepsia de los mutantes Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

En vivo-La centrifugación de embriones de Drosophila

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Bioquímica y de Evaluación de Rendimiento microscópica de masa grasa en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Un método mejorado para la rápida y precisa medición de rendimiento en vuelo<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Medición de niveles hemo síntesis en células de mamífero

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of genetic manipulations with this model has supplanted pharmacological approaches that are commonplace in other animal models and cell-based assays. Here we describe recent advances in a protocol that enables application of small molecules to the developing fruit fly embryo. The method details steps to overcome the impermeability of the eggshell while maintaining embryo viability. Eggshell permeabilization across a broad range of developmental stages is achieved by application of a previously described d-limonene embryo permeabilization solvent (EPS1) and by aging embryos at reduced temperature (18 &#176;C) prior to treatments. In addition, use of a far-red dye (CY5) as a permeabilization indicator is described, which is compatible with downstream applications involving standard red and green fluorescent dyes in live and fixed preparations. This protocol is applicable to studies using bioactive compounds to probe developmental mechanisms as well as for studies aimed at evaluating teratogenic or pharmacologic activity of uncharacterized small molecules.

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Introduction of small molecules to the developing Drosophila embryo offers great potential for characterizing biological activity of novel compounds, drugs, and toxins as well as for probing fundamental developmental pathways. Methods described herein outline steps that overcome natural barriers to this approach, expanding the utility of the Drosophila embryo model.

Un método de permeabilización de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones para ensayos de moléculas pequeñas Actividad

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Cuantitativa inmunofluorescencia Ensayo para medir la variación en los niveles de proteína en centrosomas

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Un método basado en la flotabilidad de la determinación de los niveles de grasa en

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El estudio de la agresión en Drosophila (mosca de la fruta)

Pyrosequencing: Un método simple para determinar el genotipo exacto

Seguimiento visual mediada olor durante el vuelo en Drosophila

Neurocircuit ensayos para las convulsiones en la epilepsia de los mutantes Drosophila

En vivo-La centrifugación de embriones de Drosophila

Bioquímica y de Evaluación de Rendimiento microscópica de masa grasa en

Un método mejorado para la rápida y precisa medición de rendimiento en vuelo

Medición de niveles hemo síntesis en células de mamífero

Un método de permeabilización de

Cuantitativa inmunofluorescencia Ensayo para medir la variación en los niveles de proteína en centrosomas