K.E.H. was supported by the Training Grant in Molecular Biology NIH-T32-GM08730. This work was supported by NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932 and AHA Award 12BGIA11930014 to T.R.

1. raccogliere le uova dalle mosche con genotipi di interesse NOTA: croci ideali sono costituite da 150 mosche vergini e almeno 75 maschi. collezioni di archivio deve essere composto da almeno 200 mosche. <ol><li> Preparare piatti d&#39;uva. <ol><li> Aggiungere 37,5 g di agar a 1,5 L di acqua distillata in un matraccio 4 L. </li><li> Autoclave miscela acqua / agar per 50 min a 121 ° C (250 ° F). </li><li> Mentre l&#39;acqua / miscela agar è autoclave, aggiungere 50 g di saccarosio al succo d&#39;uva da 500 ml e mescolare con un ancoretta su un piatto mescolare fino a quando riscaldato il saccarosio si scioglie. </li><li> Spegnere il fuoco e continuare a mescolare per raffreddare la miscela succo d&#39;uva / saccarosio al di sotto di 70 ° C. Testare la temperatura interna con un termometro alcool. </li><li> Aggiungere 3 g Drosophila agente anti-fungine (ad esempio, Tegosept) per riscaldare il succo d&#39;uva miscela / saccarosio e mescolare per sciogliere. </li><li> Quando l&#39;acqua / miscela agar è fuori dell&#39;autoclave, permettono raffreddare il pallone al tatto agitando occasionalmente. </li><li&gt; Unire miscela acqua / agar e succo d&#39;uva miscela / saccarosio e mescolare fino a ben miscelati. </li><li> Utilizzare una pipetta sierologica aggiungere 8 - 10 ml della miscela dell&#39;uva al coperchio di una piccola piastra di Petri (stile 35 x 10 mm). Lasciare la miscela a corona superiore alla altezza delle pareti del coperchio per formare una forma convessa. </li><li> Lasciare le piastre uva raffreddare per 2 ore a temperatura ambiente e poi conservare in un contenitore ermetico a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparare pasta di lievito. <ol><li> Aggiungere 6 ml di soluzione tampone fosfato (PBS) a 4 g vivo lievito secco attivo in una provetta conica da 50 ml e mescolare con una spatola fino liscio. </li><li> Conservare lievito in pasta a 4 ° C. </li></ol></li><li> Aggiungere un piccolo ciuffo (circa 1/8 cucchiaino) di pasta di lievito per mezzo di una piastra di uva. Lisciare eventuali asperità con una spatola. </li><li> Posizionare le piastre di uva in un incubatore fino a quando non hanno raggiunto la temperatura ambiente. </li><li> Trasferire le mosche di interesse in un piatto di camera di raccolta delle uova e del luogo d&#39;uva with pasta di lievito rivolta verso l&#39;interno sulla parte superiore. Nastro piatto d&#39;uva per la camera di raccolta delle uova per evitare che la piastra di cadere. Assicurati di scrivere importanti genotipo e informazioni aggiornate sulla parte inferiore della piastra di uva. </li><li> Capovolgere la camera di raccolta delle uova per consentire le mosche di deporre le uova sulla piastra di uva. </li><li> Posizionare una casella o coprire la sorveglianza delle camere di raccolta delle uova e metterli in un incubatore a 25 ° C. </li><li> Consentire mosche per deporre le uova per 4 - 6 ore. </li><li> Terminare raccolta prendendo la piastra dell&#39;uva fuori della camera di raccolta uovo e trasferire le mosche indietro nel loro bottiglia di cibo. Utilizzare una spatola per eliminare ogni pasta di lievito in eccesso dalla piastra di uva. piatto d&#39;uva Conservare in una più grande capsula di Petri in un incubatore umidificato a 25 ° C per ~ 24 ore. </li></ol> 2. Trasferimento larve di Experimental alimentari <ol><li> Preparare il cibo sperimentale. NOTA: Questa ricetta cibo è basato sulla Bloomington Stock Center ricetta 18. importanti cambiamentiincludono una maggiore quantità di lievito per ottimizzare il valore nutrizionale degli alimenti, come valutato dal tempi di vagare fase (tra 112-120 ore dopo la raccolta delle uova a 25 ° C). Mentre abbiamo trovato questa ricetta ideale per la salute e lo sviluppo del nostro larve sperimentale, ogni ricetta cibo è dato di calibrazione accettabile con controlli positivi e negativi, esempi dei quali sono elencati al punto 3.10. <ol><li> Misura 1.600 ml di acqua distillata. </li><li> Mescolare 134 g di farina di mais, 10,6 g Drosophila Agar Tipo II, e una parte dell&#39;acqua (~ 500 ml) in 1 L becher. Miscela per 2 minuti con un miscelatore della mano motorizzato. </li><li> Mescolare 70 g di lievito secco attivo vivo, 18,4 g di farina di soia, 84,8 g estratto di malto, e una parte dell&#39;acqua (~ 500 ml) in un altro 1 L becher. Miscela per 2 minuti con un miscelatore della mano motorizzato. </li><li> Agitare ogni bicchiere e versare in un pallone da 4 L. Usare l&#39;acqua residua per sciacquare i bicchieri e aggiungere nel pallone. </li><li> Misurare 140 ml di sciroppo di mais luce e aggiungere al pallone, mescolare agitando. &lt;/ Li&gt; <li> Autoclave per 50 minuti a 121 ° C (250 ° F) in ambiente liquido. </li><li> Dopo la sterilizzazione in autoclave, versare il cibo in un 4 L bicchiere e lasciare raffreddare. Aiutare il processo di raffreddamento miscelando con un miscelatore della mano motorizzato. </li><li> Una volta che il pallone si è raffreddato abbastanza da toccare, aggiungere 8,8 ml di acido propionico e 16,8 ml di soluzione di Drosophila agente / etanolo anti-fungine. Mescolare bene. (Fare soluzione agente Drosophila anti-fungine con l&#39;aggiunta di 380 g Drosophila agente anti-fungine a 1 L 200 etanolo prova e mescolare in un piatto caldo fino sciolto, facendo attenzione che la soluzione non sia superiore a 70 ° C.) </li><li> Versare il cibo in fiale fino a quando il cibo è di circa 1 pollice profondo e lasciare raffreddare a temperatura ambiente per 2-3 ore. Collegare flaconi e conservare in un incubatore a 25 ° C. Utilizzare entro una settimana. </li></ol></li><li> Tuffo una spatola più volte nello strato superiore del flaconcino di cibo per segnare esso. Questo aiuterà le larve di scavare e mangimi. </li><li> 22 - 24 ore dopo la raccolta delle uova haended, utilizzare un pennello piccolo per raccogliere 50 primo stadio (L1) larve della stessa dimensione approssimativa. Posizionare larve nel cibo sperimentale. Pulire il pennello su un laboratorio wipe e garantire che non vi siano restante larve sul pennello prima di proseguire per un altro genotipo. </li><li> Mettere flacone di larve in un incubatore a 25 ° C e permettere di sviluppare. </li></ol> 3. Determinare i livelli di grassi nelle larve <ol><li> Preparare soluzioni. <ol><li> Preparare 1 L 10x PBS magazzino. <ol><li> Aggiungere 80 g di NaCl, 2 g KCl, 14,4 g di Na 2 HPO 4, e 2,4 g KH 2 PO 4-800 ml di acqua in un bicchiere 2 L contenente un ancoretta. Mescolare con nessun calore fino a quando tutti i sali sono incorporati. Portare il pH a 7,4. Aumentare il volume di 1 litro con acqua. </li></ol></li><li> Preparare 2 L 1x PBS. Aggiungere 200 ml di soluzione di PBS 10x magazzino a 1.800 ml di acqua. </li><li> Utilizzare questo stock di PBS 1x per rendere il 20% w / v di saccarosio. </li></ol></li><li> Rimuovere il flacone di larve dallaincubatore una volta ci sono 20 - 40 larve di vagare fino ai lati del flacone (generalmente il quinto giorno dopo collezioni di uova). Registrare la data e l&#39;ora del test, nonché il numero di vagare larve. </li><li> Preparare la soluzione sperimentale aggiungendo 11,5 ml di PBS e 9 ml 20% di saccarosio in una provetta conica da 50 ml. </li><li> Aggiungere 20% di saccarosio al flaconcino finché è 0.5 - 1 pollice dalla parte superiore della fiala. </li><li> Utilizzare una spatola per mescolare delicatamente lo strato superiore di cibo per le larve liberi che sono ancora scavando nel cibo. Tutti larve salirà alla superficie della soluzione di saccarosio. </li><li> Utilizzare pinze per trasferire delicatamente le larve nella concentrazione di saccarosio iniziale dal punto 3.3. </li><li> Utilizzare una spatola per mescolare delicatamente le larve in questa soluzione. </li><li> Chiudere la provetta conica e capovolgere più volte per mescolare accuratamente la soluzione. </li><li> Togliere il tubo conico e agitare per creare un vortice gentile. </li><li> Lasciare che le larve di stabilirsi, o galleggianti alla parte superiore della soluzione o sinking al fondo. Attendere 2-5 minuti per le larve di stabilirsi. NOTA: Se ci sono ancora larve, che non sono sicuramente variabile o affondare, scegliere una linea da utilizzare come punto di taglio per etichettare le larve sia come un galleggiante o una zavorra. Applicare questo stesso criterio a tutti i genotipi. Usiamo l&#39;angolo al fondo della provetta conica come nostro confine. Adp o sir2 17 larve mutante può essere utilizzato come controllo positivo e LSD2 19 mutanti possono essere utilizzati come controllo negativo per la calibrazione del test. </li><li> Registrare il numero di larve flottante e la concentrazione specifica testato. </li><li> Aggiungere 1 ml di 20% di saccarosio alla soluzione sperimentale per aumentarne la densità. </li><li> Ripetere i passaggi 3,7-3,10. Registrare il numero di larve galleggianti e questa nuova concentrazione. </li><li> Continuare passi 3.12 e 3.13 fino ad almeno il 95% delle larve sono galleggianti. </li><li> Utilizzare pinze per raccogliere tutte le larve in un piatto dissezione pieno di PBS. </li><li> observe larve al microscopio e nota se ci sono piccole larve, pupe pre-, pupe, o qualsiasi altre differenze tra genotipi. NOTA: Idealmente, tutte le larve deve apparire omogenea e allo stesso stadio di sviluppo. Abbiamo osservato soltanto misurazioni del grasso consistenti in queste condizioni. </li><li> Registrare il numero totale di larve. </li><li> Utilizzando pinze, trasferire 10 larve di un laboratorio di pulire a secco. Etichettare una provetta e posizionare 10 larve nel tubo. </li><li> Flash congelare le larve in azoto liquido. Conservare il tubo a -20 ° C. </li></ol>

<ol>
	<li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).</li><li>Liu, Z., Huang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+in+Drosophila+development+and+disease+Using+Drosophila+System+to+Study+Lipid+Metabolism+Lipids+Function+in+Drosophila+Early+Development.">Lipid metabolism in Drosophila development and disease Using Drosophila System to Study Lipid Metabolism Lipids Function in Drosophila Early Development.</a> Acta Biochim Biophys Sin. 45 (1), 44-50 (2013).</li><li>Ruden, D. M., Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+conservation+of+metabolism+explains+howDrosophila+nutrigenomics+can+help+us+understand+human+nutrigenomics.">Evolutionary conservation of metabolism explains howDrosophila nutrigenomics can help us understand human nutrigenomics.</a> Genes Nutr. 1 (2), 75-84 (2006).</li><li>Wolf, M. J., Rockman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+genetic+screens,+and+cardiac+function.">Drosophila, genetic screens, and cardiac function.</a> Circ. Res. 109, 794-806 (2011).</li><li>Trinh, I., Boulianne, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+obesity+and+its+associated+disorders+in+Drosophila.">Modeling obesity and its associated disorders in Drosophila.</a> Physiology (Bethesda). 28 (2), 117-124 (2013).</li><li>Azeez, O. I., Meintjes, R., Chamunorwa, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+body,+fat+pad+and+adipose+tissues+in+invertebrates+and+vertebrates:+the+nexus.">Fat body, fat pad and adipose tissues in invertebrates and vertebrates: the nexus.</a> Lipids Health Dis. 13, 71 (2014).</li><li>Dourlen, P., Sujkowski, A., Wessells, R., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+transport+proteins+in+disease:+New+insights+from+invertebrate+models.">Fatty acid transport proteins in disease: New insights from invertebrate models.</a> Prog. Lipid Res. 60, 30-40 (2015).</li><li>Hildebrandt, A., Bickmeyer, I., K&#252;hnlein, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+Drosophila+body+fat+quantification+by+a+coupled+colorimetric+assay.">Reliable Drosophila body fat quantification by a coupled colorimetric assay.</a> PLoS One. 6 (9), e23796 (2011).</li><li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila.">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68, 105-115 (2014).</li><li>Al-Anzi, B., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+measurement+of+triglycerides+cannot+provide+an+accurate+measure+of+stored+fat+content+in+Drosophila.">Colorimetric measurement of triglycerides cannot provide an accurate measure of stored fat content in Drosophila.</a> PLoS One. 5 (8), e12353 (2010).</li><li>Thanh, N. T. K., Stevenson, G., Obatoml, D., Bach, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Lipids+in+Animal+Tissues+by+High-Performance+Thin-Layer+Chromatography+with+Densitometry.">Determination of Lipids in Animal Tissues by High-Performance Thin-Layer Chromatography with Densitometry.</a> J. Planar Chromatogr. 13, 375-381 (2000).</li><li>Borrull, A., Lopez-Martinez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozes, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+separation+and+quantification+of+neutral+lipid+species+using+GC-MS.">A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS.</a> Eur. J. Lipid Sci. Technol. 117, 274-280 (2015).</li><li>Shui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+one+step+analysis+of+cellular+lipidomes+using+liquid+chromatography+coupled+with+mass+spectrometry:+application+to+Saccharomyces+cerevisiae+and+Schizosaccharomyces+pombe+lipidomics.">Toward one step analysis of cellular lipidomes using liquid chromatography coupled with mass spectrometry: application to Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe lipidomics.</a> Mol. Biosyst. 6, 1008-1017 (2010).</li><li>Farvid, M. S., Ng, T. W. K., Chan, D. C., Barrett, P. H. R., Watts, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+adiponectin+and+resistin+with+adipose+tissue+compartments,+insulin+resistance+and+dyslipidaemia.">Association of adiponectin and resistin with adipose tissue compartments, insulin resistance and dyslipidaemia.</a> Diabetes. Obes. Metab. 7 (4), 406-413 (2005).</li><li>Urbanchek, M. G., Picken, E. B., Kalliainen, L. K., Kuzon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+force+deficit+in+skeletal+muscles+of+old+rats+is+partially+explained+by+the+existence+of+denervated+muscle+fibers.">Specific force deficit in skeletal muscles of old rats is partially explained by the existence of denervated muscle fibers.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56A (5), B191-B197 (2001).</li><li>Mosher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+between+Drosophila+Arc1+and+a+specific+population+of+brain+neurons+regulates+organismal+fat.">Coordination between Drosophila Arc1 and a specific population of brain neurons regulates organismal fat.</a> Dev. Biol. 405 (2), 280-290 (2015).</li><li>Reis, T., van Gilst, M. R., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+buoyancy-based+screen+of+drosophila+larvae+for+fat-+storage+mutants+reveals+a+role+for+Sir2+in+coupling+fat+Storage+to+Nutrient+Availability.">A buoyancy-based screen of drosophila larvae for fat- storage mutants reveals a role for Sir2 in coupling fat Storage to Nutrient Availability.</a> PLoS Genet. 6 (11), e1001206 (2010).</li><li>Teixeira, L., Rabouille, C., R&#248;rth, P., Ephrussi, A., Vanzo, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Perilipin/ADRP+homologue+Lsd2+regulates+lipid+metabolism.">Drosophila Perilipin/ADRP homologue Lsd2 regulates lipid metabolism.</a> Mech. Dev. 120 (9), 1071-1081 (2003).</li><li>Perez, C. L., Van Gilst, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+13C+Isotope+Labeling+Strategy+Reveals+the+Influence+of+Insulin+Signaling+on+Lipogenesis+in+C.+elegans.">A 13C Isotope Labeling Strategy Reveals the Influence of Insulin Signaling on Lipogenesis in C. elegans.</a> Cell Metab. 8, 266-274 (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Ci sono una moltitudine di tecniche che sono state sviluppate per misurare i livelli di lipidi 8 - 10. Tuttavia, ciascuno di questi metodi viene fornito con alcuni importanti inconvenienti che sono indirizzati mediante il saggio galleggiamento basato descritto sopra. In primo luogo, questo test è estremamente rapido. Test di un gradiente di piena concentrazione non richiede più di 30 - 60 min. Questo è un enorme miglioramento sulla maggior parte delle tecniche attualmente in uso. Ad esempio, lipidi quantificazione da MS prende 7-9 ore per isolare i lipidi e altre diverse ore per analizzarli. Questo è un forte deterrente durante l&#39;esecuzione di uno schermo su un gran numero di animali. Misurando un fenotipo galleggiamento rapido, si può mettere a fuoco rapidamente sui genotipi che hanno il fenotipo di interesse. In secondo luogo, il saggio di densità richiede soltanto reagenti comuni quali sali (per PBS) e saccarosio. Questo rende molto più semplice ed economico per lo screening di un gran numero di larve o rapidamente testare genotipo interessante. Infine, questo mi protocollos non invasiva e le larve sono ancora vivi alla fine. Questo permette ulteriori sperimentazioni da effettuare sugli animali, come specifica quantificazione dei lipidi o trascrizione o analisi delle proteine. Inoltre, le larve recuperato può essere consentito di continuare a crescere fino all&#39;età adulta. Un ulteriore vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri viene aumentata sensibilità alle piccole variazioni di livelli di grasso in una popolazione. Eseguendo un intero gradiente di concentrazione su una popolazione di 50 larve, piccoli spostamenti nei livelli di grasso popolazione saranno identificati da un cambiamento nelle concentrazioni intermedie, sebbene la concentrazione alla quale le larve iniziano flottante e sono totalmente galleggiare non può essere diverso rispetto ai controlli . Questo piccolo spostamento nella popolazione non può sempre essere identificato da altri metodi di quantificazione grasso in quanto richiedono un grande gruppo di larve da analizzare. Il dosaggio densità invece interroga individui all&#39;interno della popolazione e può quindi identificare these piccole modifiche o cambiamenti nella distribuzione complessiva della popolazione. Poiché questa tecnica si basa sulla densità della soluzione per produrre risultati affidabili, è estremamente importante che il PBS e soluzioni di saccarosio sono fatti in modo coerente. Abbiamo scoperto che diverse ricette PBS producono differenze di densità della soluzione, portando a risultati diversi. Usiamo la ricetta sopra descritta per ottenere risultati coerenti. Inoltre, rendendo il saccarosio 20% dallo stesso lotto di 1x PBS è importante in quanto determina la stessa densità della soluzione di sfondo. Se le due soluzioni sono state fatte separatamente, leggere variazioni di densità PBS potrebbero portare variabile densità aggiuntiva oltre aggiunta di saccarosio al flaconcino conica sperimentale. Infine, l&#39;evaporazione può essere un problema, perché nel tempo le soluzioni diventeranno più concentrato con l&#39;evaporazione dell&#39;acqua. È quindi importante cap bottiglie ermeticamente e per ristabilire la soluzione ogni settimana in modo che sperimentalesoluzioni rimangono costanti. Tra i punti di cui sopra, ci sono diversi passaggi critici che se alterato, potrebbe portare a risultati non accurati da parte del test di galleggiabilità. In primo luogo, è importante che le larve trasferito nel flaconcino cibo sperimentale sia la stessa età. Trasferimento di larve che variano in dimensioni comporterà larve a diversi stadi di sviluppo al momento viene eseguito il test di galleggiabilità. Questo protocollo è stato sviluppato per determinare i cambiamenti nei livelli di grasso nel vagare L3 larve e non funzionerà in modo accurato per L3 precoce o pre-pupe o successiva. All&#39;inizio del terzo instar larve hanno la tendenza a galleggiare indipendentemente dai livelli di grasso, mentre pre-pupe e lavandino pupe anche alle più alte concentrazioni utilizzate. Per questo motivo, l&#39;età delle larve L1 trasferito è critica. Analogamente, il punto in cui viene preso il flaconcino per eseguire il test di galleggiabilità è importante. Per le stesse ragioni di temporizzazione di sviluppo di cui sopra, i flaconcini devono essere prese solo quando 20 -40 larve vagano per garantire misurazioni della densità accurate. Inoltre, il numero di L1 trasferito può influenzare risultati pure. Le ampie fiale utilizzate in questo protocollo consentono 50 larve di mangiare senza concorrenza durante lo sviluppo. Un numero molto maggiore di larve trasferito a questo si tradurrà in competizione per il cibo e può influenzare la quantità di grasso immagazzinato indipendentemente dal genotipo. Ci possono essere genotipi con tali livelli estremamente elevati di grasso che la maggior parte o tutte le larve galleggerà alla prima concentrazione. In questo caso, il protocollo può essere modificato diminuendo la concentrazione della soluzione di partenza per ottenere uno spettro completo della distribuzione della densità di popolazione. D&#39;altra parte, un genotipo specifico può essere così magra che nessuna larva galleggia in saccarosio iniziale. In questo caso, i passi iniziali possono essere omessi e una concentrazione iniziale più elevata usati. Questo test è molto flessibile e può essere modificato per adattarsi meglio un&#39;ampia gamma di livelli di grasso.Si consiglia l&#39;uso di controlli, come adeguati animali wild type (controllata per il background genetico), controlli positivi (mutanti grassi stabilito, come ADP o Sir2 17), e controlli negativi (mutanti magre pubblicati, come LSD2 19). L&#39;uso appropriato di questo protocollo permetterà futuro proiezione di collezioni per determinare nuovi regolatori del metabolismo e l&#39;obesità predisposizione. Inoltre, questo protocollo fornisce un modo semplice per i ricercatori in ogni campo per verificare se la loro manipolazione genetica di interesse provoca un cambiamento nei livelli di grassi, senza la necessità di protocolli complesse o costose attrezzature. Questo protocollo contribuirà a chiarire la complessa relazione tra la genetica e l&#39;obesità.

Drosophila melanogaster è stato utilizzato per più di un secolo nello studio della genetica e di altre questioni biologiche fondamentali. Negli ultimi decenni, è diventato chiaro che la Drosophila è un potente strumento per lo studio di molte malattie umane. Il 70 - 80% di geni associati a malattie umane hanno una mosca ortologo identificata 1 - 4, Drosophila fornisce un sistema semplificato ma traducibile in cui studiare le malattie complesse. Il metabolismo, in particolare, ha beneficiato di tale studio. Non solo la genetica del metabolismo ben conservati tra le mosche e gli esseri umani, ma gli organi competenti e tipi di cellule sono molto simili a 2,5. Ad esempio, il grasso corporeo dei negozi mosca entrambi Triacilgliceroli (TAG) e di glicogeno, funzioni analoghe a quelle svolte nel fegato dei mammiferi e del tessuto adiposo bianco 6. Utilizzando Drosophila come modello per l&#39;obesità umana ha notevolmente migliorato la nostra comprensione di lipidiil metabolismo e la genetica di obesità 7. Lo stadio larvale di sviluppo è particolarmente utile per studiare la segregazione di nutrienti stoccaggio o utilizzo come è dedicata all&#39;alimentazione e l&#39;immagazzinamento di energia da utilizzare durante pupariation. Attualmente, ci sono molti metodi quantitativi diversi della determinazione dei livelli di stoccaggio dei grassi in Drosophila. Il metodo più diffuso è il saggio colorimetrico accoppiato (CCA) 8,9. CCA è stato sviluppato per determinare i livelli TAG nel siero umano e opera sulla premessa che glicerolo liberato dalla spina dorsale di trigliceridi subirà diverse reazioni, che si traduce in una reazione redox-coupled generando un prodotto colorato. Assorbanza di specifiche lunghezze d&#39;onda di luce viene poi misurata per determinare la quantità iniziale di glicerolo presente. Tuttavia, glicerolo può anche essere liberato da mono- e diacylglycerides oltre al TAG e quindi non può essere una misura accurata di storato grasso corporeo 9. Inoltre, l&#39;occhio del pigmento di mosche adulte schiacciati può interferire con alcune letture di assorbanza e complicare i risultati 9,10. Pertanto, CCA deve essere accompagnato e convalidato cromatografia su strato sottile (TLC), che permette la separazione delle maggior parte delle famiglie di lipidi che può essere quantificata mediante densitometria 10,11. Tuttavia, alcune classi di lipidi, come steroli non possono essere analizzati e devono essere quantificati un modo diverso 12. La spettrometria di massa (MS) è un modo preciso per quantificare tutte le classi di grandi lipidi cellulari 12,13. Tuttavia, le procedure di estrazione dei lipidi necessari per analizzare da MS sono sia in termini di tempo (più presa quasi un giorno intero) e costosa. Qui vi presentiamo un metodo alternativo per determinare rapidamente ed economicamente livelli di grasso organismal nelle larve L3 di Drosophila melanogaster. Il metodo presentato sotto sfrutta la differenza di densità tra tessuto adiposo e tessuto magro. fa mammiferit tessuto ha una densità di circa 0,9 g / ml 14 mentre il muscolo scheletrico come una densità di 1,06 g / ml 15. Questa differenza significa che gli animali con elevate riserve di grasso avranno densità inferiore rispetto agli animali con i negozi più bassi di grasso, che permetteranno loro di galleggiare meglio in una soluzione della densità fisso. Questa proprietà consente estremamente rapido lo screening di un gran numero di animali pur essendo sia poco costoso e non invasivo. Analisi di galleggiabilità-based è stato utilizzato sia per confermare i fenotipi di alterare regolatori noti di livelli di grasso, nonché di individuare nuovi regolatori genetici e neurologici di obesità 16,17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="670">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacto Agar</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">214030</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Welch&#39;s Original 100% Grape Juice</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:168px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tegosept</td>
			<td style="width:168px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20-259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>200 proof</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Baker&#39;s yeast</td>
			<td style="width:168px;">Fleichmann&#39;s</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yellow Corn Meal</td>
			<td style="width:168px;">Quaker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Enriched degerminated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Drosophila Agar Type II</td>
			<td style="width:168px;">Apex</td>
			<td style="width:119px;">66-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Soy Flour</td>
			<td style="width:168px;">ADM Specialty Ingredients</td>
			<td style="width:119px;">062-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Malt Extract</td>
			<td style="width:168px;">Breiss</td>
			<td style="width:119px;">5748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Light Corn Syrup</td>
			<td style="width:168px;">Karo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propionic Acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>U330-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:168px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50147491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium phosphate anhydrous</td>
			<td style="width:168px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S3933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 x 10mm petri plate</td>
			<td style="width:168px;">Fisher</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50mL Conical</td>
			<td style="width:168px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50-869-569</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a buoyancy-based method of determining fat levels in drosophila

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat in Drosophila, but most are expensive and/or laborious and have clear limitations. Here, we present a method to quickly and cheaply determine organismal fat levels in L3 Drosophila larvae. The technique relies on the differences in density between fat and lean tissues and allows for rapid detection of fat and lean phenotypes. We have verified the accuracy of this method by comparison to body fat percentage as determined by neutral lipid extraction and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GCMS). We furthermore outline detailed protocols for the collection and synchronization of larvae as well as relevant experimental recipes. The technique presented below overcomes the major shortcomings in the most widely used lipid quantitation methods and provides a powerful way to quickly and sensitively screen L3 larvae for fat regulation phenotypes while maintaining the integrity of the larvae. This assay has wide applications for the study of metabolism and fat regulation using Drosophila.

La figura 1 rappresenta un esempio di come il dosaggio galleggiamento-based può rilevare sia depositi grassi superiori e inferiori in larve geneticamente manipolati. La figura 1A mostra che eccitazione o silenziamento di un certo sottoinsieme di neuroni (E347) nel cervello larvale induce grassi inferiori e superiori negozi rispettivamente. Lo stesso controllo background genetico è stato utilizzato in entrambi i casi. Figura 1B fornisce un esempio di come questo fenotipo ottenuto mediante il saggio densità viene confermata mediante estrazione dei lipidi neutri e quantificazione dal GCMS. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54744/54744fig1.jpg" /> Figura 1. funzione neuronale in specifiche regioni del cervello larvale è necessario e sufficiente per il regolamento di grasso corporeo. Attività neuronale nella linea E347-GAL4 indicato è stato messo a tacere da sovraespressione di Shi DN, Oppure attivata tramite sovraespressione di NB, come indicato nei pannelli, ed effetti sul grasso corporeo sono stati valutati. (A) Percentuale di larve galleggianti all&#39;equilibrio in soluzioni di densità diverse. Cinquanta larve sono stati esaminati per campione biologico, n = 7 - 9 repliche biologiche per genotipo grasso (B) corpo Percent (lipidi neutri totali comprese triacilgliceroli e fosfolipidi divisa per il peso corporeo) come misurato dalla GCMS 17,20 (n = 8).. Le linee blu o barre rappresentano GAL4-only (senza UAS) gli animali hanno attraversato a w 1118 per controllare gli effetti del background genetico. valori di P rappresentano i risultati di test t a due code. **** P &lt;0.0001, *** P = 0,0001 al 0.001 ** P = 0,001 al 0,01, * P = 0.01 0.05. Le barre di errore mostrano SEM. Questa cifra è stata modificata 16. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54744/54744fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila at JoVE.com

A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Qui vi presentiamo un metodo per misurare i livelli di grasso organismal nel terzo instar (L3) stadio larvale di Drosophila melanogaster. Questo metodo sfrutta la relativamente bassa densità di tessuto adiposo a distinguere tra le larve con depositi di grasso alterati. analisi di galleggiabilità-based è uno strumento prezioso per lo screening rapido, riproducibile, ed economico.

Un metodo galleggiabilità a base della determinazione dei livelli di grasso nel<em&gt; Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat ...

a-buoyancy-based-method-of-determining-fat-levels-in-drosophila

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

8.5K Views.  University of Colorado Anschutz Medical Campus.  Qui vi presentiamo un metodo per misurare i livelli di grasso organismal nel terzo instar (L3) stadio larvale di Drosophila melanogaster. Questo metodo sfrutta la relativamente bassa densità di tessuto adiposo a distinguere tra le larve con depositi di grasso alterati. analisi di galleggiabilità-based è uno strumento prezioso per lo screening rapido, riproducibile, ed economico. 

Video: A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources. This complex social behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. In many organisms, aggression is critical to survival but controlling and suppressing aggression in distinct contexts also has become increasingly important. In recent years, invertebrates have become increasingly useful as model systems for investigating the genetic and systems biological basis of complex social behavior. This is in part due to the diverse repertoire of behaviors exhibited by these organisms. In the accompanying video, we outline a method for analyzing aggression in Drosophila whose design encompasses important eco-ethological constraints. Details include steps for: making a fighting chamber; isolating and painting flies; adding flies to the fight chamber; and video taping fights. This approach is currently being used to identify candidate genes important in aggression and in elaborating the neuronal circuitry that underlies the output of aggression and other social behaviors.

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Studiare Aggressione in Drosophila (moscerino della frutta)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Ricerca

Biologia

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pirosequenziamento: un metodo semplice per genotipizzazione accurata

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

Visivamente monitoraggio Odore mediata durante il volo in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Saggi Neurocircuit per Sequestri in mutanti di Epilessia Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In vivo centrifugazione di embrioni di Drosophila

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Biochimica e High Throughput valutazione microscopica di massa grassa in<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Un metodo migliore per precisa e rapida misurazione delle performance in volo<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

La misurazione dei livelli Heme sintesi in cellule di mammifero

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of genetic manipulations with this model has supplanted pharmacological approaches that are commonplace in other animal models and cell-based assays. Here we describe recent advances in a protocol that enables application of small molecules to the developing fruit fly embryo. The method details steps to overcome the impermeability of the eggshell while maintaining embryo viability. Eggshell permeabilization across a broad range of developmental stages is achieved by application of a previously described d-limonene embryo permeabilization solvent (EPS1) and by aging embryos at reduced temperature (18 &#176;C) prior to treatments. In addition, use of a far-red dye (CY5) as a permeabilization indicator is described, which is compatible with downstream applications involving standard red and green fluorescent dyes in live and fixed preparations. This protocol is applicable to studies using bioactive compounds to probe developmental mechanisms as well as for studies aimed at evaluating teratogenic or pharmacologic activity of uncharacterized small molecules.

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Introduction of small molecules to the developing Drosophila embryo offers great potential for characterizing biological activity of novel compounds, drugs, and toxins as well as for probing fundamental developmental pathways. Methods described herein outline steps that overcome natural barriers to this approach, expanding the utility of the Drosophila embryo model.

Un metodo di Permeabilization di<em&gt; Drosophila</em&gt; Gli embrioni per saggi di piccole molecole di attività

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Quantitative Immunofluorescence Assay misurare la variazione dei livelli di proteine ​​ad centrosomi

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...